LepR 3'UTR缺失导致CreER工具鼠示踪特征改变的研究

作     者：贠海涛 庞思怡 贺婷 胡景岩 郑超 杨柳 YUN Hai-tao;PANG Si-yi;HE Ting;HU Jing-yan;ZHENG Chao;YANG Liu

作者机构：中国人民解放军空军军医大学第一附属医院骨科西安710032 西北工业大学医学研究院西安710072 西北大学生命科学学院西安710069 

出 版 物：《骨科》 (ORTHOPAEDICS)

年 卷 期：2023年第14卷第1期

页      面：68-75页

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

基　　金：陕西省创新能力支撑项目计划(2020TD-0036) 陕西省重点研发计划一般项目(2021SF-022) 陕西省重点产业链项目(2022ZDLSF02-12) 

主　　题：瘦素受体 关节软骨 骨关节炎 Cre-LoxP系统 

摘      要：目的构建瘦素受体(Leptin receptor,LepR)报告基因(LepR-CreER)小鼠,在体内研究LepR 3’UTR中引入polyA对骨关节和其他脏器中LepR基因表达模式的影响。方法通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在LepR基因终止密码子前定点敲入2A-CreERT2-WPER-polyA表达框,构建诱导型LepR-CreER基因小鼠,与R26^(tdTomato)小鼠杂交繁育,获得LepR-CreER;R26^(tdTomato)基因小鼠,提取小鼠组织DNA,采用PCR进行基因型鉴定。对幼龄及成年期LepR-CreER;R26^(tdTomato)基因小鼠的骨关节和脏器组织进行冰冻切片,利用DAPI和免疫荧光染色检测体内LepR+细胞表达情况,并与LepR-Cre;R26^(tdTomato)小鼠LepR+细胞表达进行比较。在LepR-Cre和LepR-CreER小鼠关节腔注射Leptin重组蛋白,采用Safranin O染色和Aggrecan免疫荧光染色观察关节软骨的变化。结果幼龄期,LepR-CreER;R26^(tdTomato)和LepR-Cre;R26^(tdTomato)小鼠的生长板肥大区及骨髓中均有LepR+细胞存在,关节软骨中没有LepR+细胞的出现;而成年期,LepR-CreER;R26^(tdTomato)小鼠关节软骨中LepR+细胞的数目较LepR-Cre;R26^(tdTomato)小鼠明显增多,阳性细胞分布范围扩大。关节腔注射Leptin后,LepR-CreER小鼠较LepR-Cre小鼠出现更严重的关节软骨退变表现。进一步生物信息学及表达对比分析发现LepR基因的3’UTR存在关节软骨中高表达的miR-31-5p互补结合位点。结论成年期,不同方式构建的LepR报告基因小鼠中LepR+细胞表达具有差异,激活异位表达LepR+细胞的关节软骨出现更严重的骨关节炎,生信分析提示其中的差异可能源自LepR基因3’UTR存在miR-31-5p的潜在结合区域。