地衣芽孢杆菌E7氨肽酶的异源表达及其在高效蛋白水解中的应用

作     者：陈雅惠 柳志永 张荣珍 徐岩 CHEN Yahui;LIU Zhiyong;ZHANG Rongzhen;XU Yan

作者机构：江南大学生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室江苏无锡214122 

出 版 物：《微生物学报》 (Acta Microbiologica Sinica)

年 卷 期：2022年第62卷第8期

页      面：3079-3091页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

基　　金：国家自然科学基金(31970045) 国家轻工技术与工程双一流学科项目(LITE2018-12) 高校学科人才引进计划(111-2-06) 江苏省高等学校拔尖学科项目 

主　　题：地衣芽孢杆菌 氨肽酶 大肠杆菌 酶学性质 蛋白水解 

摘      要：【目的】将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)E7氨肽酶基因pepN克隆到大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中,实现氨肽酶Ec PepN的异源表达,研究重组酶的酶学性质及其与碱性蛋白酶协同作用,高效水解大豆蛋白和酪蛋白,产生小分子活性肽和游离氨基酸。【方法】以地衣芽孢杆菌E7基因组DNA为模板,将氨肽酶基因pepN克隆到载体pET28a中,构建重组表达载体pET28-pepN,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经DNA测序验证,获得重组菌E. coli BL21/pET28-pepN。利用镍离子亲和层析柱对重组酶进行分离纯化,研究纯酶的pH和温度稳定性、半衰期和NaCl的耐受性等酶学性质。以商品化氨肽酶与碱性蛋白酶协同作用为对照,重组酶Ec PepN与碱性蛋白酶协同水解大豆蛋白和酪蛋白,测定水解产物中小分子活性肽和游离氨基酸的组成。【结果】Ec PepN在大肠杆菌BL21中可溶性表达,SDS-PAGE分析表明纯化的重组酶在52kDa左右显示单一条带。在7种测定底物中,Ec PepN的最适底物为Ala-pNA。在最适条件(pH 9.0和50℃)下,最高比酶活为365.04 U/mg,KM值为1.2 mmol/L,kcat为598.3 s–1,kcat/KM为499.0 L/(mmol·s)。当重组酶Ec PepN在pH 6.0-9.0孵育2 d后,相对酶活力保持85%以上,在45℃下半衰期为36 h。酶在3.0 mol/L NaCl中22 d后,残留酶活力为55%以上。重组Ec PepN与碱性蛋白酶协同作用水解大豆蛋白和酪蛋白,和商品化氨肽酶与碱性蛋白酶协同作用水解蛋白效率相当,水解产物中超过70%为分子量小于500Da的活性肽,同时含有超过2000mg/L种类丰富的游离氨基酸。【结论】构建了氨肽酶的重组菌株,重组酶Ec PepN具有较好pH和温度稳定性及较强的高浓度NaCl耐受性,能够高效催化大豆蛋白和酪蛋白水解,释放小分子活性肽和游离氨基酸,该研究为提高蛋白质的深度水解和富含蛋白质生物资源的增值提供了重要研究途径。