基于CRISPR/Cas9的蛹虫草无抗性标记转化技术的构建

作     者：李波 邹根 周思池 尹昕 杨占山 鲍大鹏 李晓玲 汪滢 LI Bo;ZOU Gen;ZHOU Sichi;YIN Xin;YANG Zhanshan;BAO Dapeng;LI Xiaoling;WANG Ying

作者机构：长春工业大学化学与生命科学学院吉林长春130012 梧州学院食品与制药工程学院广西梧州543002 上海市农业科学院食用菌研究所食用菌工程技术研究中心农业部南方食用菌资源利用重点实验室上海201403 

出 版 物：《菌物学报》 (Mycosystema)

年 卷 期：2022年第41卷第7期

页      面：1044-1054页

核心收录：

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

基　　金：上海市科技兴农重点攻关项目(2018-02-08-00-12-F01555) 国家自然科学基金(31902089) 上海市科学基金委“一带一路”(20310741900) 

主　　题：CRISPR/Cas9 蛹虫草 无抗性标记 ura5 营养缺陷型标记 

摘      要：传统的真菌遗传改造方法需要抗性标记,但目前可使用的抗性标记基因非常有限,导致蛹虫草遗传改造面临着抗性基因数量不足的问题,且尚未能实现多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本研究利用CRISPR/Cas9技术对蛹虫草的Cmura5基因进行编辑,通过内源5S-1、5S-2和U6启动子对gRNA进行转录,结果表明使用U6启动子对Cmura5基因的编辑效率达到了100%。在尿嘧啶缺陷型菌株Cmura5–中,回补野生型Cmura5基因可实现正向选择,即野生型菌株可以在基础培养基上生长。利用设计的同源臂对Cmura5基因进行回收,可以实现反向选择,即野生型在含有5-氟乳清酸培养基中生长受到抑制。以尿嘧啶缺陷型Cmura5–为出发菌株,利用无抗性标记转化技术,导入一个重组质粒效率为75%;连续导入2个重组质粒效率为80%;连续导入3个重组质粒效率为100%;连续导入4个重组质粒效率为50%,平均转化效率为75.7%,每一轮的标记回收率均在100%,实现了4个外源基因在蛹虫草中同时表达。