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用于转化生长因子β/Smad信号转导通路抑制剂筛选的慢病毒报告载体的构建

Construction of lentiviral reporter vectors for screening inhibitors of transforming growth factor-β/Smad signal transduction pathway

作     者:杨翠平 何园 刘慧莹 张硌 周晨辰 米志强 查玉华 柏长青 YANG Cui-ping;HE Yuan;LIU Hui-ying;ZHANG Luo;ZHOU Chen-chen;MI Zhi-qiang;ZHA Yu-hua;BAI Chang-qing

作者机构:解放军医学院北京100039 中国人民解放军总医院第五医学中心南院区呼吸与危重症医学科北京100071 中国人民解放军总医院第五医学中心南院区医学工程科北京100071 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 

出 版 物:《中国药理学与毒理学杂志》 (Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology)

年 卷 期:2022年第36卷第4期

页      面:274-281页

学科分类:1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

基  金:国家重点研发计划(2017YFF0108605) 国家重点研发计划(2018YFC160025) 北京市自然科学基金(7202196) 北京市自然科学基金(5192021)。 

主  题:转化生长因子β Smad 慢病毒报告基因 受体 拮抗剂 

摘      要:目的构建由转化生长因子β(TGF-β)诱导的含有Smad响应元件(SmadRE)和红色荧光蛋白mCherry或荧光素酶报告基因序列的慢病毒报告载体,为筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂提供有效工具。方法合成UAS-SmadRE-Pmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-SmadRE-Pmin-Gal4VP64-lucifer⁃ase报告基因序列,分别将其插入经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后的pCDH-GFP-Puro-noCMV慢病毒质粒载体,获得响应TGF-β的含有SmadRE和mCherry或荧光素酶报告基因序列的慢病毒报告载体,分别命名为pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase。利用慢病毒三质粒包装系统在293FT细胞中分别包装出慢病毒并感染A549细胞(分别命名为USPG-mCherryA549和USPG-luciferaseA549细胞),在倒置荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,鉴定A549细胞是否被感染成功。用TGF-β(10μg·L^(-1))及其受体拮抗剂LY2109761(5μmol·L^(-1))和SB431542(10μmol·L^(-1))分别处理USPG-mCherry A549和USPG-luciferaseA549细胞24 h,倒置荧光显微镜下观察USPG-mCherryA549细胞mCherry的表达,用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测USPG-luciferaseA549细胞荧光素酶的表达,验证所构建慢病毒报告载体用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂的可行性。用TGF-β及其受体拮抗剂LY2109761和SB431542处理A549细胞24 h,Western印迹法检测A549细胞磷酸化Smad2/3蛋白表达,验证LY2109761和SB431542对TGF-β/Smad信号转导通路的抑制作用。结果经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析,成功构建pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase慢病毒重组质粒;分别转染293FT细胞包装出慢病毒并感染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察到被感染的A549细胞表达GFP,表明USPGmCherryA549和USPG-luciferaseA549细胞构建成功。加入TGF-β处理24 h后,USPG-mCherryA549细胞表达mCherry,USPG-luciferaseA549细胞表达荧光素酶;而加入LY2109761和SB431542后,USPG-mCherryA549细胞几乎检测不到mCherry的表达,USPG-luciferaseA549细胞检测不到荧光素酶的表达。Western印迹法结果表明,TGF-β刺激后A549细胞中有磷酸化Smad2/3蛋白表达,加入LY2109761和SB431542后未检测到磷酸化Smad2/3蛋白表达。结论成功构建由TGF-β诱导的受Smad调控表达mCherry和荧光素酶的2个慢病毒报告载体,可有效感染目的细胞。该慢病毒报告载体可用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂。

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