mleA基因在酿酒酵母中的整合型表达

作     者：刘延琳 李华 LIU Yan-lin;LI Hua

作者机构：西北农林科技大学葡萄酒学院/陕西省葡萄-葡萄酒工程中心 

出 版 物：《中国农业科学》 (Scientia Agricultura Sinica)

年 卷 期：2009年第42卷第4期

页      面：1372-1377页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：西北农林科技大学人才计划(01140301) 国家“863”计划专项(2007AA10Z314) 国家葡萄产业技术体系建设专项经费(Z225020801) 

主　　题：酒酒球菌 苹果酸-乳酸酶基因 整合重组表达 酿酒酵母 

摘      要：【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌SD-2a(Oenococcus oeni SD-2a)的苹果酸-乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE检测及斑点杂交检测,并对酵母转化子培养上清液进行L-苹果酸及L-乳酸含量的HPLC分析,检测目的基因的功能性表达。【结果】转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定表明获得了阳性转化子;SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了目标蛋白,斑点杂交检测表明目的基因整合到受体菌中。模拟发酵表明mleA基因整合到受体菌中后进行了功能性表达,将培养基中的L-苹果酸转化成L-乳酸,使得培养液中的L-苹果酸含量极显著降低。转化子YS59/pYILmleA在添加5648mg·L-1L-苹果酸和10%葡萄糖的SD/-Ura培养基中培养4d,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量与空载体转化子YS59/YIp5(对照)差异极显著,苹果酸的相对降低率为20.18%～20.85%。供试的转化子L-乳酸生成量为1278～1312mg·L-1,对照未检出乳酸的生成。【结论】中国自主筛选的专利菌种*** SD-2a的mleA基因的整合型表达质粒构建成功并在酿酒酵母中进行了功能性表达。