TGF-β_3基因转染诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化的初步研究

作     者：王慧建 李彦林 陈建明 王鑫 赵沣凯 曹树海 

作者机构：昆明医科大学第一附属医院运动医学科昆明650032 湖南省永州市中心医院骨科 

出 版 物：《中国修复重建外科杂志》 (Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery)

年 卷 期：2014年第28卷第2期

页      面：149-154页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

基　　金：云南省医学学科带头人培养基金资助项目(D-201207) 云南省自然科学基金资助项目(2010FB) 高等学校博士学科点专项科研基金联合资助项目(20115317110001)~~ 

主　　题：软骨组织工程TGF—β3 BMSCs 软骨分化 基因转染 滇南小耳猪 

摘      要：目的观察TGF-β3基因转染滇南小耳猪BMSCs后目的基因的表达和向软骨细胞分化的作用。方法以血清5型重组腺病毒（recombinantadenovirus5，rAd5）构建系统为基因载体，包装为重组腺病毒***-β3，行双酶切及PCR鉴定。采集2月龄滇南小耳猪（体重12～15kg）骨髓分离培养制备BMSCs，取第2代细胞用于实验。将实验分为3组，实验组和对照组分别用rAd5-TGF-β3人腺病毒阴性空病毒载体转染BMSCs，以未转染的BMSCs为空白对照组。流式细胞仪检测转染效率，免疫荧光染色、Westernblot检测各组TGF-β3蛋白表达情况；培养后各时间点倒置相差显微镜观察细胞形态变化，Westernblot检测各组II型胶原蛋白表达情况。结果rAd5-TGF．瞰重组腺病毒成功构建并转染BMSCs，在细胞内表达并迅速扩增，免疫荧光显微镜下可观察到强绿色荧光。流式细胞仪检测示转染72h时病毒达最佳转染效果（转染效率为84．86％）。免疫荧光染色示，***-β3转染BMSCs72h，细胞质内有明显TGF-β3蛋白表达；转染后7、21dWesternblot检测示，实验组在相对分子质量为30×10^3处有TGF-β3阳性条带，而对照组和空白对照组均呈阴性。转染后体外培养，倒置相差显微镜下示实验组向软骨细胞分化明显。培养21d时Westernblot检测示，实验组在相对分子质量为130×10^3处有II型胶原阳性条带，对照组和空白对照组均呈阴性。结论重组腺病毒***-β3可成功转染BMSCs,TGF-β3蛋白可稳定表达，并促使BMSCs向软骨细胞方向分化，为软骨缺损修复的局部基因治疗奠定了实验基础。