MRSA耐药相关TG-TPase嵌合基因的原核表达与纯化

作     者：杨杰 饶贤才 侯瑞 胡晓梅 陈志瑾 丛延广 谭银铃 朱军民 周莹冰 胡福泉 YANG Jie;RAO Xian-cai;HOU Rui;HU Xiao-mei;CHEN Zhi-jin;CONG Yang-guang;TAN Yin-ling;ZHU Jun-min;ZHOU Ying-bing;HU Fu-quan

作者机构：第三军医大学微生物学教研室重庆400038 

出 版 物：《免疫学杂志》 (Immunological Journal)

年 卷 期：2008年第24卷第2期

页      面：158-162,166页

核心收录：

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(30571666)资助 

主　　题：MRSA TG-TPase 原核表达 纯化 鉴定 

摘      要：目的设计、构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行原核表达、纯化探索,为进一步利用其酶学活性建立抑制剂筛选系统奠定基础。方法通过引物设计,从盐平板法筛选的MRSA菌株中分别克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP片段,分别克隆入T载体,对阳性重组子进行酶切/再连接,构建TG-TPase嵌合基因,经核苷酸测序鉴定正确的嵌合基因再亚克隆到pET22b,构建表达载体,转化Rosetta(DE3)plysS,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行SDS-PAGE、质谱和Western blotting鉴定。小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化。结果从13株临床分离的金葡菌中筛选出2株高耐药性MRSA菌株,用PCR法从中成功地克隆到青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达载体,并在大肠埃希菌中表达,产量达菌体总蛋白的43%。融合蛋白纯化分析表明,嵌合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上。结论成功设计并构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。