马铃薯Y病毒衣壳蛋白抗原表位分析及其快速ELISA检测方法的建立

作     者：梁雨欣 吴建祥 李小宇 张春雨 侯吉超 周雪平 王永志 LIANG YuXin;WU JianXiang;LI XiaoYu;ZHANG ChunYu;HOU JiChao;ZHOU XuePing;WANG YongZhi

作者机构：吉林农业大学植物保护学院 吉林省农业科学院植物保护研究所 中国农业科学院植物保护研究所 浙江大学生物技术研究所 

出 版 物：《中国农业科学》 (Scientia Agricultura Sinica)

年 卷 期：2021年第54卷第6期

页      面：1154-1162页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

基　　金：国家重点研发计划(2017YFD0201604) 吉林省农业科技创新工程人才基金(c92070813) 吉林省科技厅重点项目(20180201013NY) 

主　　题：马铃薯Y病毒 单克隆抗体 抗原表位 双抗夹心ELISA 

摘      要：【目的】马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白(coat protein,CP)分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA(DAS-ELISA)对识别不同抗原表位的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体(9G6和3D3),并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记后以2μg·mL的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒(potato virus S,PVS)、马铃薯M病毒(potato virus M,PVM)、马铃薯卷叶病毒(potato leaf-roll virus,PLRV)等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVYN及PVYO样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。