去甲肾上腺素对小鼠骨髓间充质干细胞迁移的影响及其机制

作     者：孔亚男 金晶 程飚 Kong Yanan;Jin Jing;Cheng Biao

作者机构：安徽医科大学第一附属医院整形外科合肥230022 解放军南部战区总医院烧伤整形科广州510010 

出 版 物：《中华烧伤杂志》 (Chinese Journal of Burns)

年 卷 期：2020年第36卷第12期

页      面：1173-1182页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

基　　金：国家重点研发计划(2017YFC1103301) 军事医学创新工程专项(18CXZ029) 国家自然科学基金面上项目(81171812、81272105、81671924) 广东省科技计划(2014B020212010、2015B020233012) 广州市健康医疗协同创新重大专项(201508020253)。 

主　　题：去甲肾上腺素 间充质干细胞 细胞迁移分析 

摘      要：目的探讨交感神经递质去甲肾上腺素(NE)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)迁移的影响及其机制。方法(1)取20只3周龄雄性C57BL/6小鼠,处死后取出股骨和胫骨,分离培养BMSC并鉴定。取第2代或3代细胞,分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、1μmol/L NE组、10μmol/L NE组及100μmol/L NE组,每组8孔。1μmol/L NE组、10μmol/L NE组及100μmol/L NE组细胞分别在含体积分数1%胎牛血清的低糖DMEM培养基(以下简称低血清培养基)内分别加入终物质的量浓度为1、10、100μmol/L的NE培养,PBS组细胞在低血清培养基内加入等体积的PBS培养。在刺激前(0 d)及刺激1、3、5 d,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活性(以吸光度值表示)。(2)细胞划痕试验1中,取细胞分为PBS组和单纯NE组,行划痕试验后,单纯NE组细胞采用低血清培养基+终物质的量浓度为10μmol/L的NE培养,PBS组细胞采用低血清培养基+等体积PBS培养。细胞划痕试验2中,取细胞分为PBS组、普萘洛尔+NE组、酚妥拉明+NE组,行划痕试验后,普萘洛尔+NE组细胞每天采用低血清培养基+终物质的量浓度为1μmol/L的普萘洛尔、酚妥拉明+NE组细胞每天采用低血清培养基+终物质的量浓度为10μmol/L的酚妥拉明预处理30 min后,均再采用低血清培养基+终物质的量浓度为10μmol/L的NE培养;PBS组采用低血清培养基+等体积PBS培养。细胞划痕试验3中,取细胞分为单纯NE组、单纯(2E,6E)-2,6-二(4-吡啶基亚甲基)环己酮(SC-66)组、SC-66+NE组,行划痕试验后,单纯NE组采用低血清培养基+终物质的量浓度为10μmol/L的NE培养;单纯SC-66组细胞每天采用终物质的量浓度为30 mmol/L的SC-66预处理30 min后,再采用低血清培养基培养;单纯SC-66+NE组每天采用终物质的量浓度为30 mmol/L的SC-66预处理30 min后,再采用低血清培养基+终物质的量浓度为10μmol/L的NE培养。以上3个细胞划痕试验,每组样本数均为6,均计算划痕后24、48、72 h的划痕愈合率。(3)取细胞分为PBS组、单纯NE组、普萘洛尔+NE组、酚妥拉明+NE组,每组3孔,PBS组、单纯NE组下室处理分别同细胞划痕试验1相同组,普萘洛尔+NE组和酚妥拉明+NE组下室处理分别同细胞划痕试验2相同组,行Transwell实验。常规培养24 h后,计数迁移细胞。(4)取细胞分为PBS组、单纯NE组、普萘洛尔+NE组、酚妥拉明+NE组,每组2皿,PBS组、单纯NE组细胞处理分别同细胞划痕试验1相同组,普萘洛尔+NE组和酚妥拉明+NE组细胞处理分别同细胞划痕试验2相同组。常规培养24 h后,采用蛋白质印迹法检测细胞蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本t检验、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)刺激1 d,100μmol/L NE组细胞吸光度值明显低于PBS组(t=2.986,P0.05);刺激5 d,10μmol/L NE组细胞吸光度值明显高于PBS组(t=3.547,P0.01)。(2)细胞划痕试验1中,划痕后24、48、72 h,单纯NE组细胞划痕愈合率分别为(34.4±3.4)%、(52.5±4.7)%、(70.0±3.8)%,明显低于PBS组的(44.1±4.2)%、(80.0±3.6)%、(95.9±2.2)%(t=19.320、128.319、221.575,P0.01)。细胞划痕试验2中,划痕后24、48、72 h,普萘洛尔+NE组细胞划痕愈合率均明显低于PBS组(t=4.073、9.618、15.272,P0.01)。细胞划痕试验3中,划痕后72 h,单纯NE组细胞划痕愈合率明显低于单纯SC-66组(t=8.862,P0.01);划痕后24、48、72 h,SC-66+NE组细胞划痕愈合率均明显低于单纯SC-66组(t=3.862、4.290、10.357,P0.01)。(3)Transwell实验显示,培养24 h,单纯NE组、普萘洛尔+NE组及酚妥拉明+NE组细胞迁移数量均明显少于PBS组(t=11.895、10.196、3.222,P0.01)。(4)培养24 h后,与PBS组比较,单纯NE组、普萘洛尔+NE组细胞Akt磷酸化水平明显升高(t=8.186、5.996,P0.01)。结论NE可抑制小鼠BMSC迁移,Akt信号通路参与了此调控过程。