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抗RSV药物的筛选及作用机制研究

抗RSV药物的筛选及作用机制研究

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作者：刘吉玲安徽医科大学

学位级别：硕士

目的呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿急性下呼吸道感染最常见的病原体,目前尚无安全有效的治疗方法。虽然许多针对RSV的药物和疫苗正处在激烈的研发阶段,但其耗时长且安全性不保证。本课题选定了课... 详细信息

目的呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿急性下呼吸道感染最常见的病原体,目前尚无安全有效的治疗方法。虽然许多针对RSV的药物和疫苗正处在激烈的研发阶段,但其耗时长且安全性不保证。本课题选定了课题组以前针对流感病毒筛选出来的抗流感病毒的一系列药物,先在A549细胞上进行体外抗RSV筛选,再进一步联合体内实验评价其抗RSV活性并探讨其可能的抗病毒作用机制,以期探寻更为安全有效的抗RSV药物。方法将A549细胞接种于96孔培养板上培养,待其密度达到80%时,以不同的MOI感染单层细胞培养48 h,用CCK-8法检测50%细胞活力,确定筛选体系所使用的病毒感染滴度。将化合物进行一系列的倍比稀释,分别在不感染状态下和感染状态下加药,培养48 h,CCK-8法检测,计算其IC50和EC50。以利巴韦林(Ribavirin)作为阳性对照,另外调查药物引起的不良反应以及实际应用情况,最后选取选择性指数相对最高的拉帕替尼作为接下来的研究对象。在A549细胞运用实时荧光定量PCR(Real-Time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测不同剂量处理、不同给药方法以及时间过程分析对病毒抑制效果。采用免疫荧光方法检测拉帕替尼抑制 RSVM 蛋白表达情况。qRT-PCR 检测 IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR-3、RIG-Ⅰ、IFN-β、ErbB1和ErbB2含量的变化。动物实验:将72只SPF级BALB/c雌鼠随机分为正常对照组、病毒对照组、利巴韦林对照组、拉帕替尼高剂量组、拉帕替尼中剂量组、拉帕替尼低剂量组,RSV滴鼻建立感染小鼠模型,造模成功后予药物灌胃治疗,空白组和病毒对照组灌胃等体积生理盐水。分别在治疗后的第2天、第4天和第6天,每组各随机处死4只小鼠,取肺组织分别进行 HE 染色、免疫组织化学染色(Immunohistochemical staining,IHC)和 qRT-PCR检测,分别观察肺部的病理学改变以及炎症因子的变化。ELISA检测各实验组细胞培养上清液和BALB/c小鼠血清中IL-6、IL-1β和IFN-β的含量。A549细胞分为正常对照组、RSV感染组、RSV感染后加拉帕替尼药物组,48 h收取细胞样本做转录组学测序,检测各组差异基因的表达,进行GO和KEGG富集分析,进一步对拉帕替尼抗病毒作用机制进行研究。结果(1)对近百种药物库进行筛选,细胞毒和抗病毒实验结果显示3种较为有效的药物分别是:拉帕替尼(Lapatinib)、达沙替尼(Dasatinib)、乙琥胺((Ethosuximide)。阳性对照药物是利巴韦林。3种较为有效的药物和阳性对照药物利巴韦林的IC50分别为31.58 μM、41.82 μM、41.6 μM、715.4μM。EC50分别为 1.017 μM、41.59 μM、2.5 μM、73.87 μM。选择性指数(Selectivity index,SI)值分别为 31.05、1.01、16.64、9.68。综合比较可知拉帕替尼的SI值最高。(2)qRT-PCR检测结果显示:拉帕替尼在6.25 μM、3.125 μM、1.56 μM梯度浓度下,均能抑制病毒基因的表达,差异具有统计学意义(**P<0.01)。与RSV感染组相比,拉帕替尼在三种不同的加入方式下均能明显抑制病毒基因的表达,差异具有统计学意义(**P<0.01)。拉帕替尼在感染后前8 h之内加入对病毒复制有抑制效果,差异有统计学意义(**P<0.01)。(3)qRT-PCR检测结果显示:在RSV感染组中,病毒感染48 h后,炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达量明显升高,差异有统计学意义(***P<0.001)。拉帕替尼组中,拉帕替尼显著降低RSV诱导的IL-6、IL-1β和TNF-α在A549细胞中的表达,差异有统计学意义(*P<0.05);将RSV感染组与正常细胞对照组进行对照可知,TLR3、RIG-Ⅰ和IFN-β的mRNA表达明显增多,利巴韦林组和拉帕替尼各剂量组均抑制其上调,差异有统计学意义(*P<0.05)。(4)免疫荧光结果显示:与正常对照组相比,RSV感染后,A549细胞表达大量的RSVM蛋白,拉帕替尼各剂量组中表达RSVM蛋白的荧光细胞数量显著减少。(5)BALB/c小鼠体重及肺指数变化:RSV感染后小鼠体重在4 dpi时降至最低体重。从2 dpi开始,拉帕替尼浓度为高、中剂量组的小鼠体重逐渐呈上升趋势,低剂量组在3 dpi开始小鼠体重逐渐呈上升趋势。从4 dpi开始各实验组小鼠的体重均逐渐增加,拉帕替尼组体重增加高于利巴韦林组和RSV感染组。拉帕替尼高剂量组肺指数明显低于病毒组和利巴韦林对照组,拉帕替尼中

关键词： RSV 抗病毒活性炎症因子信号通路拉帕替尼利巴韦林

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Toll样受体4 TIR结构域和核仁素GAR结构域在RSV感染SH-SY5Y细胞中的协同作用研究

Toll样受体4 TIR结构域和核仁素GAR结构域在RSV感染SH-SY5Y细胞中...

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作者：桂红芽安徽医科大学

学位级别：硕士

目的目前关于RSV（Respiratory syncytial virus,RSV）感染所致脑病的报道以临床特征和住院病例为主,对于其致病机理研究极少。本课题组之前的研究结果表明,TLR4（Toll-like receptor 4,TLR4）和核仁素（Nucleolin,NCL）可以协同介导RS... 详细信息

目的目前关于RSV（Respiratory syncytial virus,RSV）感染所致脑病的报道以临床特征和住院病例为主,对于其致病机理研究极少。本课题组之前的研究结果表明,TLR4（Toll-like receptor 4,TLR4）和核仁素（Nucleolin,NCL）可以协同介导RSV感染人中枢神经元细胞,但具体机制仍不十分清楚。因此,本课题的目的旨在为研究RSV感染神经元过程中,TLR4的TIR结构域与NCL的GAR结构域是否存在相互协同作用及其相关信号通路,为RSV与宿主相互作用机理研究和新的防治策略开发,提供新的思路。方法根据相应基因序列,由吉凯生物公司合成TIR（674-815aa）、TLR4（del674-815aa）、GAR（645-707aa）和NCL（del 645-707aa）结构域慢病毒,同时按照相应实验分组,用构建好的慢病毒感染SY5Y细胞,经过药物筛选后构建稳定过表达细胞株。在体外培养的SY5Y细胞以及稳定过表达的SY5Y细胞株中,分别于4h、12h、24h和48h行RSV感染。运用激光共聚焦显微镜、免疫共沉淀、蛋白免疫印迹、分子生物学、酶联免疫吸附法、流式细胞术等方法和技术,分别检测TIR/GAR结构域的共定位以及相互作用情况、p-NF-κB和LC3蛋白、TLR4/NCL m RNA、细胞因子和细胞凋亡的表达水平等,明确TLR4的TIR（674-815aa）结构域和NCL的GAR（645-707aa）结构域在神经元损伤中的协同作用,以阐明TIR（674-815aa）和GAR（645-707aa）在介导RSV感染所致神经神系统炎症的可能机制及相关信号通路。结果（1）激光共聚焦和免疫共沉淀结果显示:TIR（674-815aa）慢病毒和GAR（645-707aa）慢病毒共同感染SY5Y细胞后,在激光共聚焦显微镜下观察到TIR（674-815aa）结构域和GAR（645-707aa）结构域存在共定位现象。RSV感染细胞后,裂解细胞用相应标签磁珠孵育处理后进行免疫共沉淀反应,结果显示:TIR（674-815aa）结构域和GAR（645-707aa）结构域存在相互作用。（2）蛋白免疫印迹结果显示:p-NF-κB和LC3在未行RSV感染的细胞对照组（NC组）中表达水平低。NC组、TIR（674-815aa）结构域过表达组、GAR（645-707aa）结构域过表达组、TIR（674-815aa）结构域+GAR（645-707aa）结构域共同过表达组以及TLR4（del 674-815aa）过表达组和NCL（del 645-707aa）过表达组,在行RSV感染后,p-NF-κB表达量均有所增加,差异从4h开始具有显著统计学意义（###P＜0.001）。其中TIR（674-815aa）+GAR（645-707aa）+RSV组的p-NF-κB和LC3表达水平升高最为明显,而TLR4（del 674-815aa）+RSV组和NCL（del645-707aa）+RSV组p-NF-κB和LC3蛋白表达水平与NC+RSV组相持平,差异无统计学意义。（3）实时荧光定量PCR结果显示:在未经过表达处理的SY5Y细胞（NC组）和过表达的各组SY5Y细胞中行RSV感染后,与NC组相比,RSV感染的各组细胞TLR4/NCL m RNA表达水平均升高,4h开始差异有统计学意义（###P＜0.001）。与NC+RSV组相比,TIR（674-815aa）+RSV组、GAR（645-707aa）+RSV组,TIR（674-815aa）+GAR（645-707aa）+RSV组的TLR4/NCL m RNA表达水平均有一定程度的升高,升高从4h开始具有显著性差异（*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001）;而TLR4（del 674-815aa）+RSV组和NCL（del 645-707aa）+RSV组的TLR4/NCL m RNA表达水平与NC+RSV组差异无统计学意义。（4）酶联免疫吸附结果显示:未经过表达处理的SY5Y细胞对照组（NC组）中IL-6、IL-1β和TNF-α分泌的浓度并不高,用RSV分别于4h、12h、24h和48h感染SY5Y细胞后,IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度逐渐升高,升高具有统计学差异（#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001）,IL-6和TNF-α从4h开始有统计学意义,IL-1β从12h开始有统计学意义。在过表达TIR（674-815aa）结构域过表达组、GAR（645-707aa）结构域过表达组,TIR（674-815aa）结构域和GAR（645-707aa）结构域共同过表达组中行RSV感染,与NC+RSV组相比,我们发现三组细胞分泌的IL-6、IL-1β和TNF-α均有

关键词： RSV TIR结构域 GAR结构域 SH-SY5Y 协同作用

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甲基化与乙酰化修饰在RSV感染Hela细胞过程中的作用机制研究

甲基化与乙酰化修饰在RSV感染Hela细胞过程中的作用机制研究

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作者：肖艺璇安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:目前关于甲基化和乙酰化修饰的报道以调控肿瘤机制作用为主,在修饰病毒的机制以及对病毒毒力的改变,宿主细胞和病毒之间修饰的相互影响这些方面少有提及。本课题组之前的研究结果表明,感染RSV可激活细胞的先天性免疫RIG-I信号通路... 详细信息

目的:目前关于甲基化和乙酰化修饰的报道以调控肿瘤机制作用为主,在修饰病毒的机制以及对病毒毒力的改变,宿主细胞和病毒之间修饰的相互影响这些方面少有提及。本课题组之前的研究结果表明,感染RSV可激活细胞的先天性免疫RIG-I信号通路,但是感染后RIG-I的作用机制一直都在研究中。综上所述,本课题研究目的是呼吸道合胞病毒（RSV）感染Hela细胞之后,对各甲基化修饰筛选出修饰影响最大的甲基化修饰酶（mA修饰酶ALKBH5、mA修饰相关酶ALKBH3、mG修饰相关酶METTL1、mC修饰相关酶NSUN2）和乙酰化修饰ac4C相关调节酶NAT10对RSV感染复制增殖和先天性免疫起了何种作用,以及各修饰对相关的信号通道的上调或者下调,对修饰如何调控RSV病毒和宿主的机制做出相应的研究并为开发全年龄段疫苗和寻找药物新靶标提供一个新的思路和方向。方法:根据目的蛋白的全部基因序列,由通用生物公司设计合成ALKBH5（mA修饰相关酶）、NAT10（ac4C修饰相关酶）慢病毒,由擎科生物有限公司设计合成si-ALKBH3（mA修饰相关酶）、si-METTL1（mG修饰相关酶）、si-NSUN2（mC修饰相关酶）、si ALKBH5和si NAT10同时按照相应实验分组,选取培养贴壁的Hela细胞,构建好慢病毒和si RNA对Hela进行感染培养,培养后使用流式分选仪对感染慢病毒的Hela细胞进行分选得出稳定过表达细胞株。在正常Hela细胞、已进行稳定过表达的Hela细胞株和si RNA转染的Hela细胞株,这些不同组别的Hela细胞感染呼吸道合胞病毒4-48h（以4h、12h、24h、48h为代表收取样本）之后,运用一些常规使用的实验方法和技术如激光共聚焦显微镜、蛋白免疫印迹、分子生物学以及mA-seq和ac4C-seq等,分别检测ALKBH5、NAT10和RSV病毒蛋白M、F的共定位以及结合情况、RIG-I和LC3蛋白、IFN-α和IFN-βm RNA和蛋白的表达水平等,明确mA以及ac4C在Hela细胞感染RSV后对病毒复制产生的促进作用。以此用来说明mA和ac4C在对RSV感染后所致的先天免疫抑制干扰素产生的可能机制及感染中激活的相关信号通路。结果:（1）经过q RT-PCR检测结果发现:Hela细胞感染RSV 4h、12h、24h和48h这四个时间点的各修饰酶的表达量,与mock组相比,均有变化,其中ALKBH5在感染24h和48h表达量降低出现统计学意义,其他修饰酶均未出现明显差异,结合文献报道以及我们的结果表明:在RSV感染过程中去甲基修饰酶ALKBH5可能发挥了最大的调控作用。（2）激光共聚焦结果表明:在ALKBH5和NAT10慢病毒分别感染Hela细胞后,使用激光共聚焦显微镜观察ALKBH5和NAT10与病毒蛋白F、M有一定的共定位情况。我们推测mA修饰分子和ac4C修饰分子与病毒功能蛋白可能存在相互作用。（3）q RT-PCR结果显示:在正常Hela细胞和干扰的各组细胞被RSV感染后,以未感染的细胞对照组（mock组）,RSV感染的各组细胞M蛋白、RIG-I、IFN-α和IFN-β的基因表达含量与正常组对比来看有上升趋势。与正常Hela组相比,ALKBH5（mA修饰分子）干扰组和ALKBH3（mA修饰分子）干扰组的M蛋白表达水平均有一定程度的明显升高,RIG-I蛋白以及其下游调控的IFNs m RNA表达水平有一定的下降,而NAT10（ac4C修饰分子）干扰组、METTL1（mG修饰分子）干扰组和NSUN2（mC修饰分子）干扰组的M蛋白m RNA表达水平有一定程度的降低,RIG-I蛋白以及其下游调控的干扰素m RNA表达水平对比来看有一定升高。综合来看几种甲基化修饰中mA的调控作用更明显。（4）蛋白免疫印迹结果显示:mock组中RIG-I和LC3表达水平含量并不高。Hela组、ALKBH5（mA修饰分子）过表达组、NAT10（ac4C修饰分子）过表达组以及ALKBH5（mA修饰分子）干扰组和NAT10（ac4C修饰分子）干扰组,各组被RSV分时间段感染后,可发现蛋白RIG-I和LC3表达量较未感染mock组有所增加,对比正常Hela组敲低的ALKBH5和过表达的NAT10组RIG-I蛋白表达降低,LC3蛋白表达增高;敲低的NAT10和过表达ALKBH5组的RIG-I蛋白表达升高,LC3蛋白表达降低（在感染24h时差异具有统计学意义）。（5）ELISA结果显示:Hela组、ALKBH5（mA修饰分子）过表达组、NAT10（ac4C修饰分子）过表达组以及ALKBH5（mA修饰分子）干扰组和NAT10（ac4C修饰分子）干扰组,各组被RSV分时间段感染后,可发现IFNs表达量较未感染mock组有所增加,对比正常Hela组敲低的ALKBH

关键词： RSV m6A ac4C Hela 先天免疫

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TLR4对RSV感染中枢神经元诱导的NLRP3炎性小体与细胞自噬的影响及褪黑素的作用

TLR4对RSV感染中枢神经元诱导的NLRP3炎性小体与细胞自噬的影响及...

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作者：孙涛安徽医科大学

学位级别：硕士

目的以RSV感染人神经元细胞为基础,通过TLR4-siRNA手段沉默人神经元SY5Y细胞中的TLR4受体,并给予适量褪黑素作用于RSV感染的SY5Y细胞,探究TLR4受体的激活和给予外源性褪黑素对RSV感染神经元诱导NLRP3炎性小体的产生与促进细胞自噬发生... 详细信息

目的以RSV感染人神经元细胞为基础,通过TLR4-siRNA手段沉默人神经元SY5Y细胞中的TLR4受体,并给予适量褪黑素作用于RSV感染的SY5Y细胞,探究TLR4受体的激活和给予外源性褪黑素对RSV感染神经元诱导NLRP3炎性小体的产生与促进细胞自噬发生的调节作用以及褪黑素可能的保护机制,为临床预防和治疗RSV感染中枢神经系统提供新的思路。方法首先以RSV体外感染SY5Y细胞,分别于感染后4、12、24和48h收集细胞和培养上清液,并设立不同的组别,以未感染的细胞作为对照组,判断RSV感染对人神经元细胞的NLRP3和自噬影响;再以不同TLR4-siRNA序列干扰SY5Y细胞TLR4受体,选择最合适的沉默序列,设立TLR4-siRNA实验组;最后用不同浓度梯度的褪黑素作用SY5Y细胞后,CCK8检测神经元活性情况,选取适宜浓度褪黑素设立为MT实验组。(1)TCLD检测病毒滴度;(2)酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组培养上清液中IL-1β、IL-18和TNF-α炎症因子的表达;(3)免疫印迹法(Western-blot)检测各组不同时间点TLR4、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ蛋白水平的表达变化情况;(5)用Trizol法提取人神经元SY5Y细胞总RNA,通过实时荧光定量PCR法检测TLR4、Caspase-1 mRNA转录水平变化;(6)流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果(1)检测结果显示,RSV病毒的TCID为2.5×10/0.1 ml。(2)ELISA法结果显示,正常对照组中IL-1β、IL-18和TNF-α三种炎症细胞因子的表达量较低;经RSV感染后,SY5Y细胞培养上清液中的IL-1β、IL-18和TNF-α的含量,随着感染时间的延长不断升高;与RSV感染组相比TLR4-siRNA组和褪黑素组中IL-1β、IL-18和TNF-α表达量显著降低,且褪黑素组降低的更明显,差异从4h具有统计学意义(P<0.05)。(3)Western blot法测定结果显示,正常对照组中TLR4、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ蛋白表达量较低,RSV感染后TLR4、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ表达上升,且随着感染时间的延长逐渐升高,4 h升高有统计学意义(P<0.01);与RSV感染组相比,TLR4蛋白在TLR4-siRNA+RSV组与MT+RSV组中的表达量均有所下降,但在TLR4-siRNA+RSV组中TLR4蛋白表达量的下降更为明显;同时MT+RSV组与TLR4-siRNA+RSV组较RSV感染组相比,MT+RSV组中NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ的表达量降低的更明显,差异从4 h具有统计学意义(P<0.01)。(4)在mRNA转录水平,通过实时荧光定量PCR检测正常组中TLR4、Caspase-1的mRNA表达较低,在感染组中TLR4、Caspase-1的表达量逐渐增高,且随着感染时间的延长逐渐升高,分别在4 h升高有统计学意义(P<0.01);与RSV感染组相比,TLR4-siRNA+RSV组和MT+RSV组TLR4、Caspase-1 mRNA表达量都有所降低;但TLR4mRNA在TLR4-siRNA+RSV组较MT+RSV组降低的更明显,差异从12 h开始具有统计学意义(P<0.01),而Caspase-1 mRNA在MT+RSV组降低的更明显,差异从4 h开始具有统计学意义(P<0.01)。从蛋白与基因层面均能发现,TLR4受体沉默后相关的指标均有所下降,提示了TLR4在RSV感染神经元细胞中起到关键的调节作用;同时褪黑素也可能因为抑制TLR4、Caspase-1等的表达,从而在其中起到保护作用。(5)流式细胞术结果显示,正常组细胞凋亡较少,而RSV感染SY5Y细胞后24和48 h,可见细胞出现显著凋亡;在24h,siRNA+RSV组和MT+RSV组此时与RSV组相比,凋亡明显明显减少,分别为7.83%和11.95%,与RSV组相比凋亡有统计学意义(P<0.05);而在48h,MT组与RSV感染组相比,凋亡更低,为9.6%,具有统计学意义(P<0.05)。结论RSV体外作用于人神经元5Y5Y细胞后,活化TLR4表达并激活下游信号通路,促进NLRP3炎性小体的生成与诱导Caspase-1的活化,激活促进相关前体蛋白pro-IL-1β水解成具有活性的IL-1β,使得下游炎性细胞因子IL-1β、IL-18和TNF-α分泌升高,导致神经元的自噬与凋亡。而阻断TLR4受体和给予外源性褪黑素可以产生显著调控炎性小体和自噬的作用,以上说明TLR4受体在RSV感染中枢神经元所致损伤作用起关键作用。

关键词：呼吸道合胞病毒人神经元细胞 toll样受体4 炎性小体

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碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌β-内酰胺类耐药基因的调查研究

碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌β-内酰胺类耐药基因的调查研究

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作者：黄中海安徽医科大学

学位级别：硕士

目的对临床分离的碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌β-内酰胺类耐药基因携带情况进行调查研究,探讨其耐药机制。方法收集2013-2015年安徽医科大学第一附属医院155株和安徽医科大学第二附属医院87株,共计242株临床分离的粘质沙雷菌,采用Vitek-2 ... 详细信息

目的对临床分离的碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌β-内酰胺类耐药基因携带情况进行调查研究,探讨其耐药机制。方法收集2013-2015年安徽医科大学第一附属医院155株和安徽医科大学第二附属医院87株,共计242株临床分离的粘质沙雷菌,采用Vitek-2 Compact全自动微生物系统对其鉴定并进行药敏试验,从中筛选出对亚胺培南耐药18株、中介1株;再用K-B法检测19株细菌对厄他培南和美罗培南的药物敏感性,确认均为耐药;采用改良Hodge试验及EDTA协同试验检测碳青霉烯酶;PCR检测碳青霉烯酶基因bla KPC、bla NMC、bla IMP、bla GIM、bla VIM、bla OXA-23及超广谱β-内酰胺酶基因bla VEB、bla PER、bla TEM、bla SHV、bla CTX-M-1、bla CTX-M-2、bla CTX-M-9,阳性结果进行DNA测序,BLAST比对确定其基因型。结果药敏实验结果显示,19株细菌对美罗培南、厄他培南、氨曲南、环丙沙星、头孢唑林、头孢曲松、头孢噻肟全部耐药,对亚胺培南18株耐药、1株中介;对阿米卡星全部敏感;对庆大霉素敏感率为57.9%;妥布霉素敏感率为26.3%;对头孢替坦、头孢他啶均为15.8%;对头孢吡肟敏感率为10.5%;左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦敏感率均为5.3%;19株细菌改良Hodg试验阳性18株,阴性1株;EDTA协同试验全部阴性;PCR扩增和DNA测序显示,7株含bla KPC-2基因、6株含bla CTX-M-14基因、3株含bla SHV-11基因、2株含bla SHV-12基因、1株含bla OXA-23基因;19株细菌均未检出bla NMC、bla IMP、bla GIM、bla VIM碳青霉烯酶基因及bla VEB、bla PER、bla TEM、bla CTX-M-1、bla CTX-M-2超广谱β-内酰胺酶基因。结论安徽医科大学第一、第二附属医院临床分离的碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌,耐药现象较为严重,主要携带KPC-2型基因和CTX-M-14型基因,携带率分别为31.6%和36.8%。

关键词：粘质沙雷菌耐药基因聚合酶链反应

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等离子体体外抑制白假丝酵母菌生长的实验研究

等离子体体外抑制白假丝酵母菌生长的实验研究

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作者：杜文辉安徽医科大学

学位级别：硕士

目的研究低温等离子体(cold atmospheric plasmas, CAPs)的照射对体外培养白假丝酵母菌(Candida albicans)生长的影响,探索低温等离子体对白假丝酵母菌感染患者进行治疗的可能性,为临床上治疗白假丝酵母菌感染寻找一种新的、安全的治疗... 详细信息

目的研究低温等离子体(cold atmospheric plasmas, CAPs)的照射对体外培养白假丝酵母菌(Candida albicans)生长的影响,探索低温等离子体对白假丝酵母菌感染患者进行治疗的可能性,为临床上治疗白假丝酵母菌感染寻找一种新的、安全的治疗方式,在治疗白假丝酵母菌感染的工作中,提供一个新的思路和治疗方案。方法选择白假丝酵母菌标准菌株ATCC10231作为实验菌株,将标准白假丝酵母菌菌株连续三次转种、培养,然后选取适量的白假丝酵母菌菌落经过无菌研磨、稀释,最终配制成浓度为1 ×108和1×107CFU/ml的两组白假丝酵母菌悬液。然后分别取两组浓度的白假丝酵母菌菌液1 00μ1均匀涂布在沙堡琼脂培养基平皿上,将平皿常温放置于无菌操作台中静置30分钟。为了保证实验结果的准确性和随机性,两个浓度组每组随机选择各15块受试平皿,每个照射时问点上同时用3块受试平皿进行平行实验,即在相同实验条件下同时进行实验。在氩气和氧气反应环境下,以介质阻挡放电方法(dielectric barrier discharge, DBD)产生低温等离子体,然后用低温等离子体对受试平皿上白假丝酵母菌菌落进行不同时间的照射。将经过照射的培养基平皿放置于37℃恒温培养箱培养,连续3天观察照射后的培养皿上白假丝酵母菌培养菌落的生长情况,以此来判断低温等离子体照射对沙堡琼脂培养皿上白假丝酵母菌的生长有无影响,以及两个浓度组和不同照射时间下的实验组之间的差异。结果经低温等离子体分别照射0s,30s,60s,120s和180s后的受试平皿,将其放置于37℃恒温培养箱培养24h后,除空白实验平皿外,在均匀生长白假丝酵母菌菌落的培养皿中心经低温等离子体照射位置处,均出现明显的抑菌圈,随着照射时间的延长,抑菌圈逐渐增大;连续观察3天,所有实验组平皿上产生的抑菌圈大小均没有发生改变。抑菌圈大小与白假丝酵母菌菌液浓度呈负相关性,即相同低温等离子体照射时间下,白假丝酵母菌菌液浓度越低,在平皿上产生的抑菌圈越大;同时与低温等离子体照射时间呈正相关性,即相同浓度的白假丝酵母菌菌液平皿,低温等离子体对其照射时间越长,在平皿上产生的抑菌圈越大。结论低温等离子体在体外可明显抑制白假丝酵母菌的生长,而且抑菌现象可以维持较长的时间,为其将来可能成为治疗白假丝酵母菌感染的一种新的、安全的、经济的、可靠的治疗手段提供了新的实验室依据。

关键词：低温等离子体白假丝酵母菌抑制

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呼吸道合胞病毒合并肺炎克雷伯菌感染所致肺炎与TLR4-NF-κB信号通路关系的初步研究

呼吸道合胞病毒合并肺炎克雷伯菌感染所致肺炎与TLR4-NF-κB信号...

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作者：王云安徽医科大学

学位级别：硕士

目的本研究拟用呼吸道合胞病毒合并肺炎克雷伯菌感染诱发SD大鼠引起肺炎,观察SD大鼠肺组织病理变化,检测TLR4通路相关因子的表达情况,初步探讨其与TLR4-NF-kB信号转导通路的关系。方法60只雄性SD大鼠随机分为四组:对照组、RSV组、Kp组及... 详细信息

目的本研究拟用呼吸道合胞病毒合并肺炎克雷伯菌感染诱发SD大鼠引起肺炎,观察SD大鼠肺组织病理变化,检测TLR4通路相关因子的表达情况,初步探讨其与TLR4-NF-kB信号转导通路的关系。方法60只雄性SD大鼠随机分为四组:对照组、RSV组、Kp组及RSV+Kp组,每组各15只。通过滴鼻感染法处理各组SD大鼠,于第0、1、3、5、7 d相同时间段测量其体重、肺指数(LI),H&E染色观察肺部病理变化,RT-PCR检测TLR4及NF-kB的m RNA表达情况,Western blot检测NF-kB蛋白质的表达丰度,ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-a和IL-1b炎性因子的分泌量。结果(1)肺指数:与正常对照组相比,RSV组、Kp组和RSV+Kp组SD大鼠LI呈逐渐递增趋势,RSV组和Kp组在感染后第3、5天升高,差异有统计学意义(P<0.05),第7天显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与RSV组和Kp组相比,RSV+Kp组SD大鼠LI在感染后随时间延长逐渐升高,第5、7天差异有统计学意义(F=7.027,P<0.05)。(2)肺组织病理:正常对照组SD大鼠肺泡结构清楚,壁薄无充血,肺间质无炎症细胞浸润。RSV组和Kp组在感染后第3天开始出现弥漫性肺泡间隔增厚与肺泡壁破坏,且均随感染时间的延长,肺泡结构破坏逐渐加重。而RSV+Kp组从第1天开始肺组织就有炎性细胞浸润,并且在感染后同一时期较RSV组和Kp组更为严重。(3)m RNA转录水平:正常对照组SD大鼠肺组织中TLR4 m RNA、NF-kB m RNA表达很低;随着感染时间的延长,RSV组、Kp组和RSV+Kp组TLR4 m RNA、NF-kB m RNA表达量逐渐增加,有时间依赖性。RSV组TLR4 m RNA表达在感染后第5、7 d升高,差异统计学意义(P<0.01),NF-kB m RNA在感染后第5 d升高,差异有统计学意义(P<0.05),第7 d显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);Kp组TLR4 m RNA表达在感染后第3 d升高,差异有统计学意义(P<0.05),第5、7 d显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),NF-kB m RNA在感染后第3d升高,差异有统计学意义(P<0.05),第5、7 d显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。RSV+Kp组较RSV组TLR4 m RNA、NF-kB m RNA表达在感染后第5、7 d升高,差异有统计学意义(P<0.05);较Kp组TLR4 m RNA表达在感染后第7 d升高,差异有统计学意义(P<0.05),NF-kB m RNA表达在感染后第5、7 d均升高,差异有统计学意义(F=6.373,P<0.05)。(4)NF-kB蛋白表达:正常对照组中SD大鼠肺组织中NF-κB蛋白水平表达量较低,而在RSV组、Kp组和RSV+Kp组NF-κB蛋白随着感染时间的延长表达不断增加。RSV组在感染后第5天明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),第7天显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);Kp组NF-kB蛋白表达Kp组NF-kB蛋白表达在感染后第3天明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),在感染后第5、7天显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与RSV组相比,RSV+Kp组NF-kB蛋白在感染后第3、5、7天升高有统计学意义(P<0.05),与Kp组相比,RSV+Kp组NF-kB蛋白在感染后第5、7天升高差异有统计学意义(P<0.05)。(5)TNF-a、IL-1b含量:正常对照组中TNF-α和IL-1b含量较低,而在RSV组、Kp组和RSV+Kp组TNF-a、IL-1b含量随着感染时间点的延长逐渐增加,有时间依赖性。RSV组和Kp组TNF-α在感染后第5、7天明显升高,差异有统计学意义(F=9.137,P<0.05);与RSV组和Kp组相比,RSV+Kp组TNF-a含量较RSV组在感染后第5天升高,差异有统计学意义(P<0.05),第7天显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),较Kp组第5、7天明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。RSV组和Kp组IL-1b含量在感染后第5、7 d均显著升高,差异有统计学意义(F=8.737,P<0.01);与RSV组和Kp组相比,RSV+Kp组IL-1b 含量在感染后第5、7天均显著升高,差异有统计学意义(F=8.871,P<0.01)。结论(1)通过滴鼻法建立RSV合并Kp感染诱发SD大鼠引起肺炎的动物模型可行。(2)RSV和Kp混合感染具有协同作用,加重肺部炎症。(3)RSV合并Kp感染可能通过TLR4-NF-?B途径诱导肺部防御细胞释放细胞因子TNF-?和IL-1?等。

关键词：肺炎克雷伯菌呼吸道合胞病毒肺炎 TLR4 NF-?B 炎性因子

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安庆地区急性散发性戊型肝炎病毒感染的基因型研究

安庆地区急性散发性戊型肝炎病毒感染的基因型研究

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作者：刘海燕安徽医科大学

学位级别：硕士

目的了解安庆地区急性散发性戊型肝炎生化指标的变化特点,分析戊型肝炎病毒(HEV)各生物标志物之间的相关性及其基因型和流行病学特点,为预防戊型肝炎的流行提供依据。方法收集2007年-2009年临床检测为急性散发性肝炎患者的系列血清,用... 详细信息

目的了解安庆地区急性散发性戊型肝炎生化指标的变化特点,分析戊型肝炎病毒(HEV)各生物标志物之间的相关性及其基因型和流行病学特点,为预防戊型肝炎的流行提供依据。方法收集2007年-2009年临床检测为急性散发性肝炎患者的系列血清,用酶联免疫(ELISA)试剂检测HEV-IgG抗体、HEV-IgM抗体,用RT-PCR法检测HEV RNA载量,比较各指标间的相关关系,并将部分扩增产物进行测序和基因分型。结果在46例安庆地区临床确诊为急性散发性戊型肝炎患者中,HEV-IgG抗体滴度有升高趋势的36例,HEV-IgM抗体阳性的41例,RNA阳性者39例。HEV-IgM抗体变化与HEV-IgG抗体变化的符合率为88.2%,HEV-IgM抗体变化与HEV RNA阳性的符合率为85.3%,HEV-IgG抗体变化与HEV RNA阳性的符合率为83.8%;分别扩增HEV RNA ORF1区域494-nt核苷酸片段和ORF2区域150-nt核苷酸片段各27条和15条,系统进化分析显示均为HEV基因Ⅳ型。结论***感染早期,同时进行HEV-IgG抗体HEV-IgM抗体和核酸的检测有助于戊性肝炎的诊断。2.安庆地区急性散发性HEV流行株以Ⅳ型病毒株为主。

关键词：戊型肝炎病毒 IgG抗体 IgM抗体 HEV RNA定量检测基因分型

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T淋巴细胞亚群与细胞因子在鉴别鲍曼不动杆菌定植与感染中的作用

T淋巴细胞亚群与细胞因子在鉴别鲍曼不动杆菌定植与感染中的作用

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作者：宋骏安徽医科大学

学位级别：硕士

目的探讨T淋巴细胞亚群与细胞因子在鉴别鲍曼不动杆菌定植与感染中的临床意义。方法收集2016年1月016年11月期间,在皖南医学院第一附属医院住院,109例痰培养分离出鲍曼不动杆菌的住院患者,根据中华医学会呼吸分会医院获得性肺炎的诊断标... 详细信息

目的探讨T淋巴细胞亚群与细胞因子在鉴别鲍曼不动杆菌定植与感染中的临床意义。方法收集2016年1月016年11月期间,在皖南医学院第一附属医院住院,109例痰培养分离出鲍曼不动杆菌的住院患者,根据中华医学会呼吸分会医院获得性肺炎的诊断标准,分为鲍曼不动杆菌定植组53例和感染组56例,另选择50例健康人群作为对照组。用VITEK2 Compact全自动细菌检测仪进行细菌鉴定和药敏试验,利用K-B法验证药敏结果;利用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8比例;采用酶联免疫吸附法检测细胞因子水平,并比较各组间的差异。分析各组年龄、性别构成比及科室分布情况及其耐药性的规律。应用Spearman相关分析,探讨影响T淋巴细胞亚群、细胞因子的相关影响因素;应用Logistic回归分析,了解T淋巴细胞亚群、细胞因子是否为鲍曼不动杆菌感染的独立影响因素。结果在所有检出的鲍曼不动杆菌患者中男性67例,占61.47%,女性42例,占38.53%,男性多于女性。且患者年龄大多在60岁以上;鲍曼不动杆菌出现严重的耐药性,其中氨苄西林耐药率为98.16%,头孢替坦耐药率为99.08%。氨曲南、头孢吡肟、氨苄西林舒巴坦、环丙沙星、亚胺培南、妥布霉素也出现60%以上的耐药率,耐三类以上药物的41例,占全部鲍曼不动杆菌37.61%,耐全部所测药物的29例,占全部鲍曼不动杆菌26.61%;在鲍曼不动杆菌定植组与感染组之间,T淋巴细胞亚群、TNF-α、IFN-γ、IL-17存在显著性的差异。鲍曼不动杆菌感染与TNF-α(r=0.241,P=0.012)、IFN-γ(r=0.235,P=0.014)、IL-2(r=0.249,P=0.009)、IL-4(r=0.268,P=0.005)和IL-17(r=0.538,P<0.001)存在正相关,与CD3(r=-0.193,P=0.045)和CD4/CD8(r=-0.302,P=0.001)存在负相关。多因素Logistic回归分析显示IFN-γ(OR=1.420)和IL-17(OR=1.511)可能是鲍曼不动杆菌定植与感染的鉴别指标。结论鲍曼不动杆菌感染与TNF-α、IFN-γ以及IL-2、IL-4和IL-17存在正相关,与CD3和CD4/CD8存在负相关;多因素Logistic回归分析显IFN-γ、IL-17可作为鉴别鲍曼不动杆菌感染与定植的指标,并可为抗菌药物的合理使用以及医院感染的预防、控制提供依据。

关键词：鲍曼不动杆菌 T淋巴细胞亚群细胞因子定植感染

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TLR4和核仁素协同介导呼吸道合胞病毒感染人中枢神经元的作用研究

TLR4和核仁素协同介导呼吸道合胞病毒感染人中枢神经元的作用研究

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作者：袁晓玲安徽医科大学

学位级别：硕士

目的呼吸道合胞病毒(RSV)感染可以引起儿童急性脑病,导致神经系统症状,但尚未阐明其确切的致病机制。TLR4和核仁素两种受体都可以介导吸道合胞病毒感染中枢神经元。本课题的目的是研究这两种受体在RSV感染中枢神经元中可能的协同作用,... 详细信息

目的呼吸道合胞病毒(RSV)感染可以引起儿童急性脑病,导致神经系统症状,但尚未阐明其确切的致病机制。TLR4和核仁素两种受体都可以介导吸道合胞病毒感染中枢神经元。本课题的目的是研究这两种受体在RSV感染中枢神经元中可能的协同作用,为今后临床治疗以及疾病预防提供新的思路。方法实验用TLR4与C23过表达质粒转染293T细胞后,激光共聚焦和免疫共沉淀检测它们的共定位和相互作用情况;然后,以TLR4和C23的过表达质粒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y,简称SY5Y)细胞,再行RSV感染,以未行任何处理的细胞为正常对照组,并分别设立RSV感染组、TLR4过表达组、C23过表达组、TLR4+C23过表达组。在RSV感染2h、4h、24h、48h后分别从每个组收集蛋白以及细胞的上清液。(1)免疫印迹法(Western-blot)检测各组不同时间点p-NF-κB,TLR4及C23蛋白水平的表达变化;(2)实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)在每一组不同时间点检测TLR4和C23 m RNA表达的变化;(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养液上清中IL-6、IL-8和TNF-α含量的改变情况;(4)流式细胞术检测每组细胞凋亡率。结果(1)激光共聚焦和免疫共沉淀结果显示:用TLR4和C23过表达质粒分别转染293T细胞后,激光共聚焦观察到细胞表面存在共定位;收集细胞用相应抗体孵育处理,进行免疫共沉淀反应后,免疫印迹检测相应蛋白表达的情况显示:用C23蛋白抗体孵育结合后可以下拉到TLR4,且TLR4蛋白抗体孵育结合后也下拉出C23蛋白。提示TLR4和C23存在相互作用。(2)Western Blot结果显示:在正常对照组中,p-NF-κB蛋白的表达量较低,经RSV病毒感染之后,随着感染时间增加蛋白表达量不断增加;与RSV感染组相比,TLR4过表达组、C23过表达组,TLR4+C23过表达组的p-NF-κB表达量均有所增加,其中TLR4过表达组相对于同时间点的C23过表达组增加的更明显,而且TLR4+C23过表达组的p-NF-κB表达量最高,差异从2h开始具有显著统计学意义(P<0.05)。TLR4蛋白在正常对照组中表达量较低,RSV感染后表达上升,2h开始差异有统计学意义(P<0.05);与RSV感染组相比,TLR4过表达组、C23过表达组,TLR4+C23过表达组的表达量均有所增加,同时间点TLR4+C23过表达组中的表达量显著高于单独过表达组。C23蛋白在各组细胞中的变化也检测到类似的结果。(3)Real-time PCR结果显示:正常细胞中TLR4 m RNA含量较低,RSV感染后TLR4 m RNA表达上升,2h开始差异有统计学意义(P<0.05);与RSV感染组相比,TLR4过表达组、C23过表达组中表达量都显著升高;其中,TLR4+C23过表达组的表达量最高,差异从2h开始具有显著统计学意义差异(P<0.01)。C23 m RNA的表达检测到与TLR4 m RNA类似的结果。(4)ELISA结果显示:正常对照组中IL-6、IL-8和TNF-α表达量较低,经RSV感染后,SY5Y细胞培养上清液中的IL-6、IL-8和TNF-α的含量,随着感染时间的延长不断升高,均高于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。TLR4过表达组、C23过表达组中IL-6、IL-8和TNF-α表达量显著升高(P<0.01),且TLR4过表达组升高更明显,其中,TLR4+C23过表达组的表达量最高。差异有显著性(P<0.05)。(5)流式细胞术结果显示:正常组SY5Y细胞凋亡较少;RSV作用24 h后,RSV感染组细胞凋亡增加,凋亡有统计学意义(P<0.01);TLR4过表达组、C23过表达组与RSV组相比,细胞凋亡较为明显升高,与RSV组相比凋亡有统计学意义(P<0.01);TLR4+C23过表达组与RSV组相比细胞凋亡变化更为明显,具有显著统计学意义(P<0.01)。在感染后48 h,各组细胞凋亡检测到与24h相似的表达趋势,但均比24h时增加的更加显著。结论TLR4和C23可以相互作用共同促进RSV活化NF-κB,导致相关信号通路下游细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α表达增高和细胞凋亡,表明两受体在RSV感染SY5Y细胞所致损伤中起到协同作用。

关键词：呼吸道合胞病毒 Toll-like receptor4 核仁素协同作用 SH-SY5Y

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