TLR4对RSV感染中枢神经元诱导的NLRP3炎性小体与细胞自噬的影响及褪黑素的作用

作     者：孙涛 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄升海

授予年度：2018年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：呼吸道合胞病毒 人神经元细胞 toll样受体4 炎性小体 

摘      要：目的以RSV感染人神经元细胞为基础,通过TLR4-siRNA手段沉默人神经元SY5Y细胞中的TLR4受体,并给予适量褪黑素作用于RSV感染的SY5Y细胞,探究TLR4受体的激活和给予外源性褪黑素对RSV感染神经元诱导NLRP3炎性小体的产生与促进细胞自噬发生的调节作用以及褪黑素可能的保护机制,为临床预防和治疗RSV感染中枢神经系统提供新的思路。方法首先以RSV体外感染SY5Y细胞,分别于感染后4、12、24和48h收集细胞和培养上清液,并设立不同的组别,以未感染的细胞作为对照组,判断RSV感染对人神经元细胞的NLRP3和自噬影响;再以不同TLR4-siRNA序列干扰SY5Y细胞TLR4受体,选择最合适的沉默序列,设立TLR4-siRNA实验组;最后用不同浓度梯度的褪黑素作用SY5Y细胞后,CCK8检测神经元活性情况,选取适宜浓度褪黑素设立为MT实验组。(1)TCLD检测病毒滴度;(2)酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组培养上清液中IL-1β、IL-18和TNF-α炎症因子的表达;(3)免疫印迹法(Western-blot)检测各组不同时间点TLR4、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ蛋白水平的表达变化情况;(5)用Trizol法提取人神经元SY5Y细胞总RNA,通过实时荧光定量PCR法检测TLR4、Caspase-1 mRNA转录水平变化;(6)流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果(1)检测结果显示,RSV病毒的TCID为2.5×10/0.1 ml。(2)ELISA法结果显示,正常对照组中IL-1β、IL-18和TNF-α三种炎症细胞因子的表达量较低;经RSV感染后,SY5Y细胞培养上清液中的IL-1β、IL-18和TNF-α的含量,随着感染时间的延长不断升高;与RSV感染组相比TLR4-siRNA组和褪黑素组中IL-1β、IL-18和TNF-α表达量显著降低,且褪黑素组降低的更明显,差异从4h具有统计学意义(P0.05)。(3)Western blot法测定结果显示,正常对照组中TLR4、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ蛋白表达量较低,RSV感染后TLR4、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ表达上升,且随着感染时间的延长逐渐升高,4 h升高有统计学意义(P0.01);与RSV感染组相比,TLR4蛋白在TLR4-siRNA+RSV组与MT+RSV组中的表达量均有所下降,但在TLR4-siRNA+RSV组中TLR4蛋白表达量的下降更为明显;同时MT+RSV组与TLR4-siRNA+RSV组较RSV感染组相比,MT+RSV组中NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ的表达量降低的更明显,差异从4 h具有统计学意义(P0.01)。(4)在mRNA转录水平,通过实时荧光定量PCR检测正常组中TLR4、Caspase-1的mRNA表达较低,在感染组中TLR4、Caspase-1的表达量逐渐增高,且随着感染时间的延长逐渐升高,分别在4 h升高有统计学意义(P0.01);与RSV感染组相比,TLR4-siRNA+RSV组和MT+RSV组TLR4、Caspase-1 mRNA表达量都有所降低;但TLR4mRNA在TLR4-siRNA+RSV组较MT+RSV组降低的更明显,差异从12 h开始具有统计学意义(P0.01),而Caspase-1 mRNA在MT+RSV组降低的更明显,差异从4 h开始具有统计学意义(P0.01)。从蛋白与基因层面均能发现,TLR4受体沉默后相关的指标均有所下降,提示了TLR4在RSV感染神经元细胞中起到关键的调节作用;同时褪黑素也可能因为抑制TLR4、Caspase-1等的表达,从而在其中起到保护作用。(5)流式细胞术结果显示,正常组细胞凋亡较少,而RSV感染SY5Y细胞后24和48 h,可见细胞出现显著凋亡;在24h,siRNA+RSV组和MT+RSV组此时与RSV组相比,凋亡明显明显减少,分别为7.83%和11.95%,与RSV组相比凋亡有统计学意义(P0.05);而在48h,MT组与RSV感染组相比,凋亡更低,为9.6%,具有统计学意义(P0.05)。结论RSV体外作用于人神经元5Y5Y细胞后,活化TLR4表达并激活下游信号通路,促进NLRP3炎性小体的生成与诱导Caspase-1的活化,激活促进相关前体蛋白pro-IL-1β水解成具有活性的IL-1β,使得下游炎性细胞因子IL-1β、IL-18和TNF-α分泌升高,导致神经元的自噬与凋亡。而阻断TLR4受体和给予外源性褪黑素可以产生显著调控炎性小体和自噬的作用,以上说明TLR4受体在RSV感染中枢神经元所致损伤作用起关键作用。