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C型钠肽调节小鼠卵母细胞线粒体功能的分子机制研究

C型钠肽调节小鼠卵母细胞线粒体功能的分子机制研究

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作者：姚舸西北农林科技大学

学位级别：硕士

哺乳动物卵母细胞体外培养时,由于离开了在体卵泡环境,使卵母细胞内的环腺苷磷酸(cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate,c AMP)水平迅速下降,从而导致卵母细胞内成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)活性恢复,过早启动减... 详细信息

哺乳动物卵母细胞体外培养时,由于离开了在体卵泡环境,使卵母细胞内的环腺苷磷酸(cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate,c AMP)水平迅速下降,从而导致卵母细胞内成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)活性恢复,过早启动减数分裂。减数分裂的过早启动和完成,使卵母细胞没有足够的时间完成胞质成熟所需要的物质储备,因而胞质成熟不充分,并导致体外培养的卵母细胞核成熟(减数分裂)和胞质成熟不同步,获得的卵母细胞的质量低、后续发育能力差。线粒体作为卵母细胞能量产生的主要中心,通过一系列氧化磷酸化过程为卵母细胞的成熟及其后续发育提供能量。同时,线粒体与卵母细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成和消除密切相关,因此在调控卵母细胞氧化应激中发挥重要作用。已有研究证明,C型钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)可通过作用于卵丘细胞鸟苷酸环化酶受体(natriuretic peptide receptor 2,NPR2)维持卵母细胞减数分裂阻滞,从而为胞质成熟赢得了更多的时间,使卵母细胞胞质能够充分成熟,从而提高卵母细胞质量。其中,CNP是否通过调节卵母细胞中的线粒体功能,进而影响到卵母细胞质量,及其调节的机制需要进一步解析。本研究主要探讨CNP对小鼠卵母细胞中线粒体形态、分布、氧化代谢的影响及其对线粒体融合、分裂和氧化代谢相关基因表达的影响,探讨CNP对小鼠卵母细胞线粒体生理状态的影响及其调控机制。研究内容和研究结果如下:(1)选择发情前期小鼠,腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)促进卵泡发育,PMSG处理24 h后处死小鼠、采集卵巢,分离小鼠卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)进行COCs体外培养。在培养的1 h,2 h,3 h和4 h时,回收培养的COCs进行GVBD检测,结果发现小鼠COCs在基础培养液培养2 h前后卵母细胞迅速发生生发泡破裂(germinal vesicle break down,GVBD),GVBD发生率为53.42±10.53%,到4 h时GVBD发生率达到85.86±3.80%,所以选择培养2 h作为后续卵母细胞线粒体氧化代谢、数量分布等研究工作的检测时间点。(2)为了检测CNP对小鼠卵母细胞体外培养过程中线粒体氧化代谢的影响,将COCs分为两组,即对照组(基础培养液组)和根据实验室前期研究结果设计的CNP处理组(添加50 n M CNP的培养液组)中培养2 h。培养结束后,脱去卵丘细胞,利用相关荧光探针、试剂盒检测卵母细胞中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量和线粒体膜电位水平。结果表明,CNP处理组卵母细胞中的ROS含量显著低于对照组(P<0.05),GSH含量和线粒体膜电位水平显著高于对照组(P<0.05)。说明经CNP处理降低了小鼠卵母细胞ROS水平,提升了抗氧化应激能力(谷胱甘肽水平升高)和线粒体活性(膜电位水平升高)。(3)为了检测CNP对小鼠卵母细胞体外培养过程中线粒体分布和数量的影响,对卵母细胞的线粒体和核进行染色,以确定卵母细胞中线粒体形态和分布;提取两组的小鼠卵母细胞中的线粒体DNA,采用q RT-PCR技术检测卵母细胞线粒体拷贝数。结果表明,CNP处理2 h后,小鼠卵母细胞线粒体呈核周分布,同时在核周有小的簇状聚集,而对照组卵母细胞中的线粒体颗粒小,并均匀分布于胞质中;CNP处理组卵母细胞中的线粒体拷贝数显著高于对照组(P<0.05)。可以看出,CNP处理的小鼠卵母细胞中的线粒体分布更为合理,这种形态分布更有利于发挥线粒体功能;相较于对照组,线粒体DNA的拷贝数也更高,即线粒体数量更多。线粒体的合理分布和拷贝数的增加,可能为卵母细胞的胞质成熟及后续发育能力的提高提供了更加充足的能量供应和更加合理的能量分配。(4)为进一步研究CNP提高卵母细胞线粒体活性的机制。应用q RT-PCR技术和Western Blot技术检测卵母细胞的线粒体融合、分裂和代谢相关基因表达情况。结果显示,与对照组相比,CNP处理组中线粒体分裂相关基因FIS1和DRP1的m RNA表达水平显著上升(P<0.05),线粒体融合相关基因OPA1和MFN1/2的m RNA表达水平显著上升(P<0.05),线粒体代谢相关基因SIRT1、PGC-1α、TFAM、NRF1/2的m RNA表达显著上升(P<0.05)。同时,CNP处理组卵母细胞线粒体活性关键调控因子PGC-1α蛋白表达水平显著上升(P<0

关键词： C型钠肽卵母细胞线粒体小鼠

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利用“3i”体系分离培养小鼠和山羊胚胎干细胞

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作者：刘晓坤西北农林科技大学

学位级别：硕士

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有维持自我更新和多能性的能力，但在传统的有饲养层和血清的干细胞分离培养体系中很难建立昆白小鼠的ESCs系和山羊的ESCs系。有研究证明，应用添加三种小分子化合物（MEK inhibitor，ALK5in... 详细信息

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有维持自我更新和多能性的能力，但在传统的有饲养层和血清的干细胞分离培养体系中很难建立昆白小鼠的ESCs系和山羊的ESCs系。有研究证明，应用添加三种小分子化合物（MEK inhibitor，ALK5inhibitor和GSK3β inhibitor）组成的“3i”培养体系能抑制诱发分化的信号通路，从而更有利于分离并维持ESCs传代培养。利用此方法，一些很难分离ESCs的物种成功分离了具有形成嵌合胚胎能力的ESCs。本研究目的在于利用“3i”体系分离培养昆白系小鼠和山羊的ESCs，研究工作取得以下结果：（1）在无饲养层、无血清的培养体系中添加2.5μM6-溴靛玉红-3-肟（6-bromoindirubin-3’-oxime，BIO）（GSK3β信号通路抑制剂），分离得到了2株来源于昆白小鼠体外受精囊胚的ESCs系。在这个培养体系中，体外受精来源的扩张囊胚可以自发孵化并贴壁。培养过程中，可以观察到类胚胎干细胞集落，经过扩增，得到了2株昆白小鼠ESCs系，分别命名为KMES1和KMES2。这2株细胞系和其他啮齿类动物的ESCs具有相同的形态学特征，具有碱性磷酸酶活性，具有与细胞多能性相关的细胞标记，包括Oct-4, Nanog和SSEA-1。拟胚体实验和畸胎瘤实验证明分离得到的ESCs可以在体内外自发分化为三胚层来源的细胞。（2）对关中奶山羊进行超数排卵和配种，手术法采集体内发育囊胚。在添加有2.5μM BIO、0.5μM PD184352（MEK信号通路抑制剂）、0.5μM SB431542（ALK5抑制剂）和1000U/mL白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）的“3i”体系中分离培养ESCs。共超排了118只关中奶山羊，获得1204枚囊胚，分析表明，季节和气温变化会影响关中奶山羊的超排效果，秋冬季超排处理期间气温骤降会显著降低超排羊的胚胎回收数。通过机械分割法将超排获得的囊胚内细胞团分离后接种于铺有饲养层细胞的四孔板，在“3i”培养体系中培养，分离得到了山羊类ESCs，并传至12代，类ESCs具有碱性磷酸酶活性、表达OCT-4和Nanog，经悬浮培养可形成拟胚体，拟胚体贴壁培养后可自发分化为神经样细胞。研究结果证明，添加有BIO培养体系可以支持无饲养层、无血清条件下小鼠ESCs的建系;在添加有BIO，SB431542和PD184352三种小分子化合物的培养体系中，可以分离得到山羊类ESCs，这为加快良种山羊的育种速度提供重要的技术平台。

关键词：胚胎干细胞 “3i”培养体系小鼠山羊

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山羊腺垂体细胞分离培养及体外分泌特性研究

山羊腺垂体细胞分离培养及体外分泌特性研究

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作者：尹慧勇西北农林科技大学

学位级别：硕士

垂体是机体内最复杂、最重要的内分泌腺,上承中枢,下系靶腺,在神经内分泌系统中具有极其重要的地位。腺垂体中的促性腺激素细胞分泌的卵泡刺激素和黄体生成素对整个生殖活动的不同阶段起重要的调控作用。在羊的繁殖过程中,产后生理性的... 详细信息

垂体是机体内最复杂、最重要的内分泌腺,上承中枢,下系靶腺,在神经内分泌系统中具有极其重要的地位。腺垂体中的促性腺激素细胞分泌的卵泡刺激素和黄体生成素对整个生殖活动的不同阶段起重要的调控作用。在羊的繁殖过程中,产后生理性的促乳素较高,而FSH和LH水平较低,抑制卵巢功能,使母羊产后哺乳期间不能配种妊娠,产羔间隔延长,影响优良母羊生产性能的充分发挥。通过建立山羊腺垂体细胞体外无血清培养体系,研究繁殖季节(10月至翌年1月),PRL、FSH和LH的分泌特性及其之间的相互关系。对于生产实践上研究促进哺乳母羊的子宫和卵巢恢复,促进产后母羊的发情具有重要的指导意义。 1.比较胰蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶和胶原酶混合、胰蛋白酶和透明质酸酶混合对山羊腺垂体组织消化结果。结果显示在37℃条件下,以1 g/LⅣ型胶原酶和1 g/L透明质酸酶混合消化2.5 h时细胞悬液粘度小,易过滤,镜下观察发现大多细胞单个存在,消化效果最好。 2.比较1.5×10个/mL,2×10个/mL,4.5×10个/mL对腺垂体细胞增殖的影响。结果显示采用2×10个/mL山羊腺垂体细胞增殖效果最好,所得细胞在培养24 h开始贴壁,72 h后细胞主要呈多角形或梭形,连接成片,培养6 d左右细胞即可铺满培养皿的细胞生长面;免疫细胞化学鉴定结果显示FSH阳性细胞胞质呈蓝色,PRL阳性细胞胞质呈蓝褐色;放射免疫测定表明分离、培养的腺垂体细胞具有激素分泌活性。 3.探讨体外培养的繁殖季节山羊垂体细胞PRL、FSH和LH分泌特性及其互相关系。用胶原酶和透明质酸酶联合对山羊腺垂体组织进行消化,原代细胞用生长培养液培养6天,更换为无血清培养液继续培养到第7天,再分别用含TRH、溴隐亭、HMG、GnRH和GnRH+PRL的无血清培养液及空白无血清培养液,继续培养6 h后收集培养液,用放射免疫分析法测定培养液中FSH、LH和PRL质量浓度。结果表明,无血清培养液中添加10,100 ng/mL的TRH时,培养液中PRL的浓度显著增加,同时FSH和LH的浓度显著降低;添加10,100 ng/mL的溴隐亭时,培养液中PRL浓度显著降低,而FSH和LH浓度无显著变化;GnRH单独处理或GnRH联合PRL处理时,培养液中FSH和LH的浓度均显著增加;添加50,100 ng/mL的HMG时,培养液中PRL浓度显著降低,而FSH、LH浓度显著升高。

关键词：腺垂体细胞促乳素促黄体素促卵泡素山羊

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