检索结果-南通市图书馆

作者：马樱琬西北农林科技大学

学位级别：硕士

白藜芦醇对小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻所致线粒体损伤的修复作用研...

白藜芦醇对小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻所致线粒体损伤的修复作用研究

作者：高臻西北农林科技大学

学位级别：硕士

过去的几十年来,玻璃化冷冻生物学已经取得巨大进步,玻璃化冷冻保存哺乳动物胚胎的效率也越来越高,但胚胎冻存后往往不可避免地会受到一定程度的损伤,特别是线粒体(mitochondria)损伤。线粒体是胚胎的能量工厂,通过氧化磷酸化为胚胎的... 详细信息

过去的几十年来,玻璃化冷冻生物学已经取得巨大进步,玻璃化冷冻保存哺乳动物胚胎的效率也越来越高,但胚胎冻存后往往不可避免地会受到一定程度的损伤,特别是线粒体(mitochondria)损伤。线粒体是胚胎的能量工厂,通过氧化磷酸化为胚胎的发育提供能量。与细胞内部不同区域能量需求所匹配的线粒体分布和状态,对于小鼠2-细胞胚胎的后续发育至关重要。同时,线粒体还与胚胎中活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的生成与清除、胚胎的氧化应激密切相关。因此,线粒体的功能损伤或分布异常会严重影响胚胎发育。白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂,目前认为其能够激活线粒体的生物合成并保护线粒体。因此我们假设白藜芦醇处理玻璃化冷冻保存胚胎可能会对玻璃化冷冻诱发的线粒体损伤产生有利影响。本研究首先检测了尼龙网法玻璃化冷冻对小鼠2-细胞胚胎可能造成的线粒体损伤,在此基础上研究白藜芦醇能否修复玻璃化冷冻造成的线粒体损伤及其机制,以期对人类医学和动物生产中卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻技术的进一步研究提供借鉴。研究内容和结果如下:(1)利用尼龙网法玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎,检测玻璃化冷冻-解冻对胚胎造成的线粒体损伤。新鲜组和玻璃化冷冻-解冻组小鼠2-细胞胚胎培养2 h后,检测线粒体分布、线粒体膜电位(ΔΨm)以及细胞内ROS水平。结果显示,新鲜胚胎中线粒体均匀分布于细胞质中,在细胞核周围有环绕聚集现象;而大部分玻璃化冷冻-解冻后胚胎,线粒体在细胞质中不规律聚集分布;新鲜胚胎的线粒体膜电位显著高于玻璃化冷冻-解冻胚胎(P0.05),进一步说明与白藜芦醇共培养8 h、胚胎已经完成下一个卵裂周期发育到4-细胞阶段,白藜芦醇已经基本完成了其修复胚胎冷冻-解冻所造成的线粒体损伤的作用,能够保证冷冻-解冻胚胎的后续发育。(5)根据上述研究结果,同时考虑到与白藜芦醇长时间共培养可能会对胚胎发育产生一定程度的毒性作用,我们进一步探索缩短白藜芦醇对玻璃化冷冻-解冻后小鼠2-细胞胚胎的处理时间,能否恢复玻璃化冷冻-解冻胚胎的线粒体正常分布及其生物学功能。继续对上述研究中四个培养组的2-细胞胚胎培养2 h,检测SIRT1和PGC-1αmRNA表达水平,转入常规培养液继续培养至72 h的囊胚发育率,以及共培养2 h时2-细胞胚胎的线粒体分布、ROS水平和线粒体膜电位。结果表明,四组胚胎在培养2 h后,白藜芦醇处理组胚胎的

小鼠早期卵裂胚胎玻璃化冷冻与批量冻存技术研究

作者：李伟西北农林科技大学

学位级别：硕士

随着玻璃化冷冻技术的不断进步,玻璃化冷冻保存哺乳动物胚胎的效率越来越高。现有的玻璃化冷冻技术在保存哺乳动物早期胚胎时依旧存在很多问题,如冷冻效率不高,存在潜在的冷冻损伤等。本研究在已有的尼龙网玻璃化冷冻法的基础上,对小鼠... 详细信息

随着玻璃化冷冻技术的不断进步,玻璃化冷冻保存哺乳动物胚胎的效率越来越高。现有的玻璃化冷冻技术在保存哺乳动物早期胚胎时依旧存在很多问题,如冷冻效率不高,存在潜在的冷冻损伤等。本研究在已有的尼龙网玻璃化冷冻法的基础上,对小鼠早期卵裂阶段胚胎的玻璃化冷冻保存技术进行进一步优化,进行小鼠2-细胞胚胎的玻璃化冷冻保存研究,并进行大规模的批量化冻存小鼠2-细胞胚胎样本的探索,使每片尼龙网上冷冻保存的小鼠2-细胞胚胎达到100枚左右,以满足哺乳动物胚胎空间发育试验对早期卵裂阶段胚胎的批量需求。将玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎批量冻存／解冻后,再在实验室已经建立的密闭培养体系(地面模拟空间胚胎发育试验的培养条件)下培养,与新鲜胚胎密闭培养的结果进行综合比较,评估批量玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎的发育能力,探讨其是否可以满足哺乳动物空间胚胎发育试验的需要。为了更准确的评估批量玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎的质量,本研究还从胚胎细胞膜完整性、细胞骨架、线粒体分布、水通道蛋白的表达与分布等方面,探讨导致玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎体外发育率降低的原因。研究内容和结果如下：1.采用尼龙网玻璃化冷冻法,以EFS40作为玻璃化冷冻保护液——包含乙二醇(ethylene glycol,EG) (V/V) 40%,蔗糖(sucrose) 0.5 M和聚蔗糖(Ficoll 70) (W/V)25%,小鼠2-细胞胚胎在玻璃化冷冻保护液液中处理后,迅速加载到尼龙网上,然后浸没于装有液氮的冻存管中,置于液氮罐中冻存,每片尼龙网上加载约100枚胚胎。解冻时依次在0.5 M,0.25 M,0.125 M,0M的蔗糖溶液中处理,每个浓度的蔗糖溶液中平衡5 min,快速地脱除冷冻保护剂。解冻后小鼠2-细胞存活率为96.22±2.74%(1791/1857),其中完整胚胎(intact embryos, IEs)约占89.88±4.32%(1669/1857),部分完整胚胎(partial embryos, PEs)约占6.95±3.44%(122/1857)。因此,本研究采用的玻璃化冷冻方法可以用于批量冻存并获得批量存活的小鼠2-细胞阶段冷冻胚胎。2.小鼠2-细胞胚胎解冻后,将存活胚胎在常规微滴条件和密闭培养条件下体外培养,结果显示：玻璃化冷冻胚胎在不同培养体系条件下培养72 h、96h囊胚发育率,96h囊胚孵化率均低于新鲜胚胎组。其中玻璃化冷冻胚胎-密闭培养组的2-细胞胚胎培养72 h的囊胚发育率(90.86±1.43%)低于新鲜胚胎-密闭培养组(94.10±0.89%),但差异不显著;玻璃化冷冻胚胎-密闭培养组的2-细胞胚胎培养96h的囊胚发育率和囊胚孵化率(91.38±0.29%,32.02±2.30%)显著低于新鲜胚胎-密闭培养组(93.72±0.95%,39.02±2.99%)(P0.05)。密闭培养的囊胚细胞数与常规微滴培养囊胚细胞数之间也无显著差异(P>0.05)。结果表明,玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎能够在密闭培养条件下正常发育到囊胚阶段,冷冻胚胎能够满足空间胚胎发育试验要求。3.尼龙网玻璃化冷冻的早期卵裂阶段小鼠胚胎体外发育率降低,可能是由于玻璃化冷冻-解冻过程对胚胎细胞造成了潜在损伤。因此,本研究从细胞膜完整性,细胞骨架,线粒体分布三个方面分析玻璃化冷冻-解冻过程对胚胎细胞造成的损伤。结果表明,相比于新鲜2-细胞胚胎,玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎细胞膜完整性未受到明显影响。冷冻-解冻后的胚胎,微丝骨架发生了变化,并且这种变化未能在体外培养中短时间恢复,但随着胚胎发育的进行,微丝骨架逐步得到恢复,微丝分布与新鲜胚胎基本一致;冷冻-解冻后的胚胎中纺锤体未见明显异常,与新鲜胚胎中的纺锤体形态结构一致。使用罗丹明123(Rhodamine123)检测冷冻-解冻胚胎线粒体分布时发现,部分解冻后的胚胎线粒体分布发生变化,在胚胎细胞的胞质中散乱分布,呈现无规则聚集状态;而新鲜胚胎中,线粒体均匀分布于胚胎细胞的胞质中,在细胞核周围呈现环绕聚集。这些结果证明,线粒体分布变化可能是导致胚胎发育率降低的主要原因,并因此推测早期卵裂阶段胚胎玻璃化冷冻-解冻过程可能导致胚胎细胞线粒体功能异常。4.为了进一步探讨卵裂阶段小鼠胚胎的玻璃化冷冻是否造成胚胎的其他损伤,本研究检测了小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻前后水通道蛋白3(aquaporin3, AQP3)和水通道蛋白7(aquaporin7, AQP7)在胚胎细胞的分布与表达。RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)检测

GPR1在LPS诱导的抑郁症模型小鼠生殖系统中的作用

作者：李荣荣西北农林科技大学

学位级别：硕士

抑郁症是一种常见的具有较高发病率、死亡率和残疾率的精神疾病。根据世界卫生组织的统计,全世界大约有3.5亿人患有抑郁症,且持续时间较长,给社会与家庭带来严重的负担。值得注意的是,女性患这种精神疾病的风险是男性的两倍,暗示抑郁症... 详细信息

抑郁症是一种常见的具有较高发病率、死亡率和残疾率的精神疾病。根据世界卫生组织的统计,全世界大约有3.5亿人患有抑郁症,且持续时间较长,给社会与家庭带来严重的负担。值得注意的是,女性患这种精神疾病的风险是男性的两倍,暗示抑郁症与雌性生殖或生殖系统疾病之间存在着某种联系。研究表明,女性生殖系统疾病(如子宫内膜癌、多囊卵巢综合征等)常常伴随着抑郁症患病率增加,尽管这种患病率增加的病因尚不清楚,但肥胖、胰岛素抵抗、雄激素升高、不孕、下丘脑-垂体-肾上腺轴异常或炎症等均有可能在抑郁症的发生中有一定的作用。然而,抑郁症是否会造成生殖系统功能的变化尚不清楚。近年来,抑郁症和女性生殖系统相关疾病之间的因果关系尚存在争议。据相关文献报道,G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1,GPR1)mRNA在中枢神经系统的下丘脑和生殖系统的卵巢中均有较高的表达。本研究利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射给药建立雌性小鼠抑郁症模型,检测了抑郁症小鼠生殖相关指标的变化,并尝试利用GPR1拮抗肽G5探究GPR1对抑郁样指标以及抑郁症小鼠生殖内分泌的影响。研究内容及其结果如下:(1)已知抑郁症和下丘脑的分泌活动相关,本研究采集正常雌性小鼠下丘脑组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片,免疫组织化学染色,以探究下丘脑组织中是否有GPR1的表达。结果显示,GPR1在正常雌性小鼠下丘脑中部组织的细胞胞质中有明显表达,说明GPR1可能与下丘脑的某些功能相关。(2)为了进一步探究GPR1是否与下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)和下丘脑-垂体-卵巢轴(HPO)的活动相关,采用石蜡切片免疫荧光技术,对正常雌性小鼠下丘脑组织中的GPR1和促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin releasing factor,CRF)或促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)进行共染色。结果显示,GPR1和CRF在正常雌性小鼠下丘脑后部组织大多数细胞的胞质中共表达;GPR1和GnRH在正常雌性小鼠下丘脑前部大多数细胞的胞质中共表达。说明,GPR1可能与下丘脑CRF,GnRH的分泌功能相关。(3)为了探究GPR1是否在抑郁症中发挥作用,使用LPS腹腔注射建立抑郁症小鼠模型,并使用实验室新筛选的GPR1特异性拮抗肽G5拮抗GPR1的作用,同时使用经典抗抑郁药物氟西汀(Fluoxetine,Flu)作为阳性对照药物进行验证。通过计算,设置低浓度(2.2585 mg/kg)、中浓度(22.585 mg/kg)和高浓度(225.85 mg/kg)三个G5浓度,其中中浓度的G5与氟西汀在相同单位体积内的有效分子数目一致。结果表明,经过G5处理的抑郁症模型小鼠表现出体重恢复,蔗糖偏好增加,以及游泳中不动的时间的减少;氟西汀处理组小鼠蔗糖偏好增加,游泳中不动时间减少。由此推测,G5可能通过抑制GPR1发挥缓解模型小鼠抑郁的发生,并且从行为学测试结果来看,中浓度的G5处理比氟西汀治疗效果更好。(4)为了进一步在分子水平上验证抑郁症小鼠模型是否构建成功,同时探究GPR1拮抗肽G5通过何种方式发挥抗抑郁作用,以及抑郁是否导致生殖系统功能的变化。将蔗糖测试结束之后的小鼠进行组织取材,从炎症、神经、生殖三个层次进行分析。采用放射免疫分析法检测血清中炎症因子和类固醇激素变化;采用高效液相色谱串联质谱法检测海马和前额皮质中神经递质的变化;采用酶联免疫吸附法检测小鼠海马中脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)水平的变化和LPS注射4小时以后血清中皮质酮(Corticosterone,CORT)水平的变化。结果显示,给小鼠腹腔注射LPS引起了血清中肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-6,IL-1β)水平升高;海马和前额皮质中神经递质γ-氨基丁酸(Gamma-Amino Butyric acid,GABA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的水平降低;海马中BDNF水平降低。从结果可以看出,G5缓解了抑郁造成的分子水平的变化,说明G5可能通过GPR1发挥抗抑郁作用。进一步检测LPS注射4 h以后血清中皮质酮的变化,发现抑郁症模型组CORT水平显著升高,中低浓度的G5降低了CORT的水平,再一次证明了G5可能具有缓解抑郁的作用。更重要的是,与对照组相比,抑郁症模型小鼠血清中,P、E的水平降低,相对应地,参与孕酮代谢的酶cyp21a1 mRNA的水平显著升高,参与合成雌激素的酶Aro

姜黄素缓解热应激小鼠睾丸损伤的作用及机制研究

作者：刘阳西北农林科技大学

学位级别：硕士

牛体外成熟卵母细胞与X性控冻精体外受精技术研究

作者：刘闯西北农林科技大学

学位级别：硕士

随着流式细胞仪在XY精子分离方面的应用,采用性控冻精进行体外受精成为性别控制领域的研究热点。采用性控冻精体外受精后,性控胚胎的囊胚发育率(约20%)和发育质量均较低,先前的研究表明,采用与体细胞进行共培养的方法可以显著促进胚胎... 详细信息

随着流式细胞仪在XY精子分离方面的应用,采用性控冻精进行体外受精成为性别控制领域的研究热点。采用性控冻精体外受精后,性控胚胎的囊胚发育率(约20%)和发育质量均较低,先前的研究表明,采用与体细胞进行共培养的方法可以显著促进胚胎的体外发育能力。睾丸支持细胞(Sertoli Cell,SC)是可以分泌转运蛋白类、调节蛋白类、生长因子类和类固醇类等物质等诸多因子。有报道指出睾丸支持细胞对早期胚胎体外发育具有促进作用,本研究主要围绕X性控冻精体外受精和性控胚胎体外培养两方面做进一步的探讨。结果如下: 1.采用改良方法高效分离培养新生犊牛Sertoli细胞,并进行鉴定。比较在0.1 %的IV型胶原酶、0.25 %的胰蛋白酶进行次第消化前,采用不同的睾丸组织处理方法(分离曲细精管法和组织剪碎法)对Sertoli细胞分离效果的影响。结果表明分离曲细精管之后进行酶消化的总时间(8 min)较组织剪碎后进行酶消化总时间(15 min)短,且前者消化所得有效细胞数(4 h贴壁细胞)高于后者(46.8% vs. 40.8 %),具有统计学差异性(P0.05),但前者囊胚体外发育率(20.9 %)显著高于后者(15.2 %, P0.05),但是前者简化了离心操作这一步骤,同时也避免了X性控冻精在体外受精操作过程中受到不必要离心损伤,优化了精子处理过程;采用X性控冻精和常规冻精分别进行IVF,结果显示X性控冻精组受精卵的卵裂率(51.4 %)、桑椹胚发育率(55.1 %)和囊胚发育率(19.7 %)均低于常规冻精组(67.9 %, 66.8 %, 29.9 %),具有统计学差异性(P<0.05)。 3.性控受精卵体外培养时,采用2.0×104个细胞/mL的Sertoli细胞200μL接种于四孔板中,待细胞贴壁,长满后作为饲养层细胞与早期性控胚胎共培养。结果显示Sertoli细胞共培养组卵裂率(51.4 %)和囊胚发育率(21.9 %)与对照组(50.3 % & 20.4 %.)相比无统计学差异,但从胚胎发育形态而言,Sertoli细胞共培养组优于空白对照组。

密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育及胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化...

密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育及胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化影响的研究

作者：陈海燕西北农林科技大学

学位级别：硕士

空间胚胎发育研究已成为空间生命科学研究的重要内容之一,而胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件。由于气密和液密的限制,使密闭培养必须选择最适的哺乳动物早期胚胎长期体外培养的密度条件、气相条件、培养液成分等。因此能够满... 详细信息

空间胚胎发育研究已成为空间生命科学研究的重要内容之一,而胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件。由于气密和液密的限制,使密闭培养必须选择最适的哺乳动物早期胚胎长期体外培养的密度条件、气相条件、培养液成分等。因此能够满足胚胎发育的营养物质和代谢废物平衡的适宜的胚胎培养密度(培养胚胎数和培养液体积之比)成为首要研究内容之一。其次由于小鼠早期胚胎对环境的敏感性以及胚胎中与发育相关基因的表观遗传模式易受发育环境影响而改变,特别是Igf2/H19印迹调控区(Imprinting Control Region,ICR)的甲基化印迹容易受到体外操作和体外培养条件的影响而发生变化。因此本研究主要围绕密闭培养条件对小鼠2-细胞胚胎发育和Igf2/H19 ICR甲基化水平的影响进行初步探讨,并对密闭培养体系的优化进行进一步的深入研究和探索,从而为哺乳动物胚胎空间生物学研究提供新的研究手段和地基数据资料。 1.在本研究设立的充有5%O2,5%CO2,90%N2高纯标准气于200μL的CZB培养液的密闭培养条件下,分析在培养胚胎数:培养液体积为1:4、1:2、1:1的3个密度条件下小鼠2-细胞胚胎分别进行4个时间点(24 h, 48 h, 72 h, 96 h)培养的胚胎发育率,以相应培养密度的常规体外培养各期胚胎发育率作为评定密闭培养条件的标准。本研究证实密闭培养和常规体外培养条件下,1:2的培养密度都比1:1和1:4更适合小鼠2-细胞胚胎培养;而且虽然密闭培养的胚胎发育率和发育速度都低于常规体外培养,但是培养96 h的孵化胚发育率几乎相同(75.1%,78.1%),可见该密闭培养条件可以用于小鼠2-细胞胚胎体外培养。 2.应用亚硫酸氢盐PCR测序法(BSP)分析密闭培养条件下小鼠2-细胞胚胎分别培养24 h、48 h、72 h时相对应的8-细胞胚胎、桑葚胚、囊胚中Igf2/H19印记调控区(ICR)的甲基化水平,以常规体外培养条件下相应胚胎的甲基化水平作为对照,以体内发育的相应胚胎的甲基化水平作为标准。本研究证实密闭培养条件下各胚胎期Igf2/H19 ICR的甲基化水平都低于常规体外培养的结果,更低于体内发育的结果,可见密闭培养会引起小鼠早期胚胎Igf2/H19 ICR的甲基化水平降低。同时证实Igf2/H19 ICR的甲基化水平可以作为监测哺乳动物早期胚胎发育状况的一个分子指标。

FSH对E2/GPR30介导的小鼠卵丘卵母细胞复合体体外成熟的影响

作者：赵慧西北农林科技大学

学位级别：硕士

正常生理状态下,雌性动物促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)主要促进卵巢中卵泡的生长、促黄体素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)的表达以及卵母细胞减数分裂能力的获得。在卵泡膜细胞中,促黄体素(luteinizing hormon... 详细信息

正常生理状态下,雌性动物促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)主要促进卵巢中卵泡的生长、促黄体素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)的表达以及卵母细胞减数分裂能力的获得。在卵泡膜细胞中,促黄体素(luteinizing hormone,LH)与其受体结合,促进雄烯二酮(androstenedione)合成并最终到达颗粒细胞。同时,FSH诱导卵泡颗粒细胞中P450芳香化酶(CYP19)活化,将雄烯二酮转变为雌酮;雌酮又在17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hydroxyl steroid dehydrogenase,HSD-17B)的作用下转变为17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E)。合成的雌激素又通过其核受体(estrogen nuclear receptors,ERs)和跨膜的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPR30)介导而发挥生理作用。也就是说,FSH通过促进雌激素合成,并可能在雌激素受体介导下间接发挥生理作用。有研究已经表明,将不同浓度的FSH,或将FSH与促卵泡素受体抑制剂一起添加到绵羊COCs成熟培养液中时,雌激素核受体ERα和ERβ的m RNA和蛋白表达水平均不会发生显著的变化,说明FSH的间接生理作用不是通过ERs(ERα和ERβ)实现的。那么,FSH是如何通过雌激素间接发挥生理作用的,是否通过调控雌激素膜受体GPR30,介导卵母细胞成熟以及卵丘扩展,是需要探明的科学问题。因此,本研究以小鼠卵丘卵母细胞复合体(cumulus–oocyte complexes,COCs)为试验模型,探讨FSH对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,并对其作用机制进行研究。研究内容及结果如下:(1)首先对体外成熟培养小鼠COCs过程中FSH的浓度进行筛选。设置0 IU/m L、0.01 IU/m L、0.1 IU/m L、1 IU/m L、10 IU/m L FSH的浓度梯度,添加到小鼠COCs体外陈述培养液,体外培养16 h后COCs卵丘扩展指数(cumulus spreading index,CEI)统计结果显示,添加0.1 IU/m L FSH可最有效地促进体外成熟培养的小鼠COCs的卵丘细胞扩展。利用芳香化酶的特异性抑制剂来曲唑(Letrozole,Let),进一步对E合成相关的芳香化酶基因进行定量研究。q RT-PCR结果显示,FSH组CYP51、HSD-17B1的m RNA水平相对于对照组和FSH+Let组显著上调(P0.05)。利用ELISA检测小鼠COCs体外成熟培养过程中添加FSH时,培养液中雌激素水平的变化。结果显示,与对照组相比,FSH能促进小鼠COCs合成E。这表明,在小鼠COCs体外成熟培养过程中,添加0.1 IU/ml FSH能够激活卵丘细胞中的芳香化酶,使雄烯二酮转化为E,促进了内源性雌激素的合成。(2)基于上述研究,利用雌激素膜受体GPR30的选择性抑制剂G15,进一步研究了在小鼠COCs体外成熟培养过程中,添加FSH促进COCs合成的E是否通过雌激素膜受体GPR30,介导雌激素对卵母细胞成熟的调控。首先,对小鼠卵丘细胞和COCs进行免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜分析表明,小鼠卵丘细胞和卵母细胞胞质膜上均存在GPR30表达,但是相较于卵丘细胞,卵母细胞质膜上GPR30的表达量很少。进一步对成熟培养过程中GPR30的m RNA水平及蛋白水平的变化进行研究。q RT-PCR分析结果显示,分别用FSH+G15、FSH+Let或FSH+G15+Let处理小鼠COCs后,GPR30 m RNA水平较FSH组明显降低(P<0.05);Western blotting检测结果显示,GPR30蛋白水平与m RNA水平呈相同的趋势,也出现明显的下降(P<0.05)。说明,FSH通过激活小鼠COCs的芳香化酶,促进内源性雌激素的合成,进而间接调控GPR30的表达。(3)根据上述研究结果,进一步研究了FSH在E/GPR30介导的小鼠卵丘细胞扩展过程中的作用。我们发现,在小鼠COCs体外培养8 h后,FSH组COCs相较于对照组和其他添加GPR30信号通路关键分子ERK的小分子抑制剂(G15,Let,PD98059)组,卵丘细胞扩展更明显,有显著差异(P<0.05);培养16 h后,FSH组相较于对照组和其他添加小分子抑制剂组,卵丘细胞会进一步扩展。CEI计算结果显示,培养8 h后,FSH组、FSH+G15组、FSH+PD98059组、FSH+G15+PD98059组、FSH+G15+Let+PD98059组CEI均高于对照组CEI(P<0.0

C型钠肽调节小鼠卵母细胞减数分裂纺锤体形态的作用及分子机制研究

作者：马驰原西北农林科技大学

学位级别：硕士

常规方法进行哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时,由于离开了卵泡环境而使卵母细胞内环腺苷酸单磷酸核苷酸(3’,5’-cyclic adenylate monophosphate,cAMP)的水平迅速下降,进而引起减数分裂提早恢复,而此时卵母细胞胞质并未完全成熟,即会... 详细信息

常规方法进行哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时,由于离开了卵泡环境而使卵母细胞内环腺苷酸单磷酸核苷酸(3’,5’-cyclic adenylate monophosphate,cAMP)的水平迅速下降,进而引起减数分裂提早恢复,而此时卵母细胞胞质并未完全成熟,即会使得卵母细胞核质成熟不同步,最终导致体外成熟培养的卵母细胞后续发育能力降低。在卵母细胞成熟过程中,纺锤体正确组装并具有正常形态是减数分裂中染色体正常分离和细胞器正常分布的基础,并且直接影响卵母细胞的成熟质量和后续发育能力。为了提高卵母细胞体外成熟质量和后续发育能力,至今已有多种能阻滞减数分裂恢复的物质被用来诱导体外培养卵母细胞的核质同步成熟,C-型钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)便是其中之一。虽然科学家们普遍认为CNP提高卵母细胞成熟率和后续发育能力是通过维持减数分裂阻滞,为卵母细胞的胞质成熟争取到了更多的时间。但是,在卵母细胞成熟过程中CNP是否能通过某些信号转导途径直接或间接地对卵母细胞的胞质成熟(特别是对纺锤体形态)进行调节,尚未有明确的研究证据。本研究通过研究CNP对MⅡ纺锤体形态的影响及其对纺锤体组装相关基因在卵母细胞核成熟过程中的表达的影响,探讨CNP对小鼠卵母细胞胞质成熟的影响,进一步揭示CNP在卵母细胞成熟过程中的作用及其调控机制。研究内容和结果如下:(1)为了检测CNP对小鼠卵母细胞体外培养核成熟和MⅡ纺锤体形态的影响,首先从PMSG处理24 h时小鼠卵巢采集生发泡(germinal vesicle,GV)期卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs),将COCs分别在含有50 nM CNP的培养液中减数分裂阻滞培养24 h后,再于含10 ng/mL EGF的常规成熟培养液中培养16 h(CNP阻滞培养试验组);或将COCs直接在含10 ng/mL EGF的常规成熟培养液中培养16 h(体外对照组);或从PMSG处理48 h后hCG处理16 h时小鼠输卵管采集体内成熟卵母细胞(体内对照组)。收集培养结束后的COCs,脱卵丘细胞后的卵母细胞用Hoechst33342染色,观察卵母细胞的染色质形态,以判断其核成熟进程,并结合极体排出的情况统计各组卵母细胞核成熟率。结果显示,CNP阻滞培养试验组卵母细胞的核成熟率(78.47±5.24%)显著高于体外对照组(57.53±3.20%)(P0.05).说明CNP的参与显著促进了小鼠卵母细胞成熟过程中纺锤体正确组装。(2)CNP下游最主要的作用通路是cAMP-PKA通路,为了检测CNP是否通过该通路促进小鼠卵母细胞成熟过程中正常纺锤体的形成,首先采用ELISA技术检测了采用添加或不添加CNP的培养液分别培养小鼠COCs 2 h后卵母细胞内cAMP水平。结果显示,使用不添加CNP的培养液体外培养COCs 2 h时,卵母细胞内cAMP水平(0.155±0.037 pmol/mL)显著低于添加CNP组卵母细胞cAMP水平(0.582±0.047 pmol/mL)(P<0.05),说明CNP显著提高了CNP体外阻滞培养时卵母细胞内cAMP水平。然后使用能升高cAMP水平的PDE3A抑制剂Milrinone和PKA的抑制剂H89进行进一步的试验。除CNP阻滞培养试验组、体外对照组和体内对照组外,小鼠COCs分别于单独添加2.5μM Milrinone的培养液(Milrinone组)或添加25μM H89+50 nM CNP的培养液(CNP+H89组)中预培养24 h后再于常规成熟培养液中成熟培养16 h.对结束培养的卵母细胞进行免疫荧光染色,统计具有正常MⅡ纺锤体形态的成熟卵母细胞的比率。结果显示,Milrinone组具有正常MⅡ纺锤体形态的成熟卵母细胞的比率为64.40±2.17%,显著高于体外对照组(54.73±2.37%)和CNP+H89组(15.89±1.80%)(P<0.05),但显著低于体内对照组卵母细胞(82.00±3.48%)和CNP阻滞培养试验组(76.03±2.46%)(P<0.05)。同时发现CNP+H89组成熟卵母细胞中具有正常MⅡ纺锤体形态的比率(15.89±1.80%)显著降低于其他各组(P<0.05).这些结果说明,

山羊卵母细胞通过旁分泌因子调控卵丘细胞雌激素受体表达的研究

作者：卫俊材西北农林科技大学

学位级别：硕士