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东北红豆杉产紫杉醇内生真菌Alternaria alternata F3的分离鉴定及体外抗癌活性研究

东北红豆杉产紫杉醇内生真菌Alternaria alternata F3的分离鉴定...

作者：张智慧东北林业大学

学位级别：硕士

东北红豆杉（Taxus cuspidata）是红豆杉科红豆杉属植物的一种,主要分布在中国东北、日本、韩国、朝鲜和俄罗斯远东,因其能产生一线抗癌药物紫杉醇而受到广泛关注。红豆杉是我国珍稀濒危保护树种,其紫杉醇含量极低。传统方法从红豆杉树... 详细信息

东北红豆杉（Taxus cuspidata）是红豆杉科红豆杉属植物的一种,主要分布在中国东北、日本、韩国、朝鲜和俄罗斯远东,因其能产生一线抗癌药物紫杉醇而受到广泛关注。红豆杉是我国珍稀濒危保护树种,其紫杉醇含量极低。传统方法从红豆杉树皮中提取分离紫杉醇,对植物资源造成了严重破坏。寻找紫杉醇新的药源途径是本领域的研究热点。与从植物中提取的传统方法相比,微生物发酵法具有不受植物生长季节、地域限制、容易进行遗传操作和规模化生产等优点,成为获取紫杉醇的重要研究方向。内生真菌是指生活在健康宿主的内部组织中,能够与植物长期共存生活,通常不会对植物本身带来任何损害或疾病,且能够产生与其宿主相同或相似结构的代谢产物的微生物。因此内生真菌可以作为次级代谢产物的重要来源。本研究拟从东北红豆杉植株中分离纯化内生真菌,通过薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）和超高效液相—质谱联用（UPLC-MS/MS）筛选到可以产紫杉醇的内生真菌,并对内生真菌发酵培养条件优化,使内生真菌紫杉醇的产量最大化;并对产紫杉醇内生真菌发酵液提取物的抗癌活性进行研究。主要研究结果如下:1.从东北红豆杉的根、茎、叶、果实不同组织中,共分离纯化得到84株内生真菌。依据《真菌鉴定手册》对内生真菌分类,并结合分子生物学方法鉴定其种属,其主要分为以下10个种属:镰刀菌属（Fusarium sp.）,附球胞属（Epicoccum sp.）,派伦霉属（Peyronellaea sp.）,链格胞属（Alternaria sp.）,单梗双胞霉属（Didymella sp.）,茎点霉属（Phoma sp.）,类壳小圆孢（Paraconiothyrium sp.）,地霉属（Geotrichum sp.）,盾壳霉属（Coniothyrium sp.）,轮层炭壳属（Daldinia sp.）。2.通过TLC、HPLC和UPLC-MS/MS方法对分离得到的内生真菌二氯甲烷提取物进行分析,鉴定内生真菌粗提物是否含有紫杉醇。利用TLC检测,以氯仿/甲醇（5:1,v/v）为展开剂,利用UV254nm显色,发现一株果实中分离出的内生真菌F3粗提物与紫杉醇标准品在同一位置具有相同颜色的斑点,Rf值为0.75;利用HPLC对该真菌发酵液提取物进一步分析,确定了 HPLC检测条件:色谱柱:HiQ sil C18W（4.6 mm×250 mm,5μm）,柱温30℃,流动相为乙腈和水,检测波长:227 nm,流速为1 mL/min,内生真菌F3提取物与紫杉醇标准品在26.7 min出现相同的色谱峰;利用UPLC-MS/MS对F3真菌发酵液提取物中紫杉醇进行鉴定,其在1.7 min可以产生和紫杉醇同样的m/z为876的一级母离子,对该峰进一步分析,F3真菌发酵液提取物和紫杉醇标准品同样可以产生m/z308的二级子离子峰,证明该内生真菌F3可以特异性产紫杉醇。通过形态学观察和ITS基因序列鉴定分析,比对序列同源性,确定了 F3菌株为链格孢菌Alternaria alternata。3.通过单因素试验,考察了不同发酵培养基,不同接种量,培养基不同初始pH,不同培养温度,不同的培养时间对内生真菌Alternariaalternata F3紫杉醇产量的影响;通过Plackett-Burman试验和中心组合设计（CCD）试验,筛选最佳的前体与诱导子的种类和浓度。最终优化出该真菌的最佳培养条件:在YPD培养基中,接种量2%,培养基初始pH 6.0,培养温度28℃,在培养基中添加乙酸钠0.1 g/L,水杨酸0.25 g/L,硝酸银0.00125 g/L;在最佳培养条件下,紫杉醇的产量195.4±0.23 μg/L,是基础培养条件的2.17 倍。4.采用MTT法,探究了内生真菌Alternaria alternata F3发酵液二氯甲烷提取物对肺癌A549和宫颈癌HeLa细胞存活率的影响。实验结果表明,F3真菌发酵液提取物对A549和HeLa细胞存活率的抑制作用呈时间和剂量依赖性;不同浓度F3真菌发酵液提取物处理 A549,其 IC50在 24 h、48h、72 h 分别为 26.36 μg/mL、23.89 μg/mL 和 15.95μg/mL;当用相同浓度F3真菌发酵液提取物处理Hela细胞时,其IC50在24 h、48h、72 h 分别为 14.24 μg/mL、11.15 μg/mL 和 11.70 μg/mL。综上所述,本研究通过对东北红豆杉内生真菌分离,共分离出84株内生真菌,筛选出一株特异性产紫杉醇内生真菌Alternaria alternata F3。通过发酵条件优化,提高紫杉醇的产量。通过对真菌紫杉醇提取物的抗癌活性研究,证实了真菌发酵液提取物对A549和HeLa细胞的存活率具有显著的抑制作用。本试验为未来利用分

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木豆内生细菌的分离、鉴定及促生抗菌活性的研究

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作者：韩海燕东北林业大学

学位级别：硕士

目前,人们主要通过使用化学肥料和化学农药来提高农作物的产量,然而其存在很多不利的影响,如效果不持久、土壤环境污染等。通过施用微生物肥料和生防制剂来替代化肥、农药,可以改善化肥和化学农药带来的危害,实现农业的可持续发展。内... 详细信息

目前,人们主要通过使用化学肥料和化学农药来提高农作物的产量,然而其存在很多不利的影响,如效果不持久、土壤环境污染等。通过施用微生物肥料和生防制剂来替代化肥、农药,可以改善化肥和化学农药带来的危害,实现农业的可持续发展。内生细菌是生活于健康植物的各种组织和器官中,而不引起宿主植物任何疾病的一类微生物。内生细菌具有促进植物生长的作用,利用其促生作用来开发微生物菌肥和生防制剂,在农业方面具有重大的研究意义。本研究以药用植物木豆为材料,采用梯度稀释涂板法对木豆内生细菌进行分离,并结合形态观察和16S rRNA序列分析方法对其鉴定;采用Salkowski 比色法,钼锑抗比色法,CAS检测法等方法对木豆内生细菌分泌植物生长素(IAA),磷酸盐增溶,产铁载体等体外促生活性进行研究;利用平板抑制试验对菌株抗病活性进行研究并利用PCR和Voges-Proskauer法进一步验证菌株的抗菌和促生机制;通过盆栽试验,验证促生菌株对小麦幼苗的促生作用。研究结果如下:1.以木豆根、茎、叶为材料,将不同梯度的组织稀释涂布于NA、LB和TSA 3种培养基上进行分离培养,传代和纯化,最终获得纯化菌株54株。其中从NA培养基中获得20株,从LB培养基中获得18株,从TSA培养基中获得16株;从根中分离的菌株占63%,从叶中分离的菌株占29%,从茎中分离的菌株占16%。2.参照《细菌鉴定手册》和分子生物学方法鉴定,根据木豆内生细菌不同形态及16S rRNA序列,将分离得到的54株内生细菌进行分类,主要为:假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。3.通过比色法和平板检测法对分离获得的54株内生细菌进行体外促生活性研究,有39株可以分泌吲哚乙酸(IAA),分泌的IAA浓度范围为0.86-80.8μg/mL,其中8株菌株分泌IAA的浓度达到10μg/mL以上;36株可以溶磷,溶磷量范围为2.8-25.8μg/mL;42株可以产嗜铁素,R值在1.2-8.8之间;24株可以产淀粉酶,R值在1.1-1.6之间;17株可以产蛋白酶,R值在1.2-1.5之间;28株可以产纤维素酶,R值在1.1-6.1之间。4.对*** BE-R4拮抗植物病原菌活性进行了研究,其对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和腐皮镰孢Fusarium solani有较好的抑制作用,抑菌率分别为52.5%和50%。通过PCR检测发现,该菌株含有编码聚酮类及非核糖体肽类抗生素生物合成的基因PKS-I和NRPS。通过Voges-Proskauer法,确定*** BE-R4含有促进植物生长的物质3-羟基-2-丁酮。5.通过对菌株体外促生活性的筛选和测定,*** BE-R4表现出较强的促生活性和抑菌活性。选取*** BE-R4为试验菌株进行盆栽试验,经*** BE-R4处理后可显著提高小麦幼苗生物量。小麦的平均根长和叶长分别增加了 52.1%和44.4%;叶和根的鲜重增加比例分别为71.2%和60.2%;根和叶的干重增加比例分别为75.8%和59.3%。

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木豆叶总黄酮提取物及其单体成分牡荆苷对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及矿化作用研究

木豆叶总黄酮提取物及其单体成分牡荆苷对成骨细胞MC3T3-E1增殖、...

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作者：王秋雪东北林业大学

学位级别：硕士

木豆作为豆科木豆属植物,具有重要的药理作用,芪类和黄酮类是其主要活性成分,在医疗保健领域被人们广泛重视。本课题主要进行木豆叶总黄酮的酶辅助提取工艺及其活性单体牡荆苷对成骨细胞MC 3T3-E1生物学作用的研究。首先建立纤维素酶辅... 详细信息

木豆作为豆科木豆属植物,具有重要的药理作用,芪类和黄酮类是其主要活性成分,在医疗保健领域被人们广泛重视。本课题主要进行木豆叶总黄酮的酶辅助提取工艺及其活性单体牡荆苷对成骨细胞MC 3T3-E1生物学作用的研究。首先建立纤维素酶辅助提取木豆叶总黄酮的提取工艺,检测木豆总黄酮提取液中牡荆苷含量,为木豆黄酮类成分的开发利用奠定基础;利用成骨细胞体外模型MC 3T3-E1,系统研究了木豆总黄酮及其活性单体牡荆苷对成骨细胞MC 3T3-E1的增殖、分化、矿化作用,结果如下:1.本文以木豆叶为原料,首次利用纤维素酶破坏细胞壁,增加总黄酮得率,并借助响应面法对其各影响因素进行优化,确定最佳提取工艺参数其结果如下:纤维素酶量:8.65 mg;酶解温度:33.88 ℃;酶解时间:2.02 h;酶解pH:5.02;提取次数:3次;乙醇浓度:80%;料液比:1:100;实际总黄酮得率:4.86%。2.建立了木豆叶总黄酮中牡荆苷的HPLC检测条件为:色谱柱:HiQ Sil C18W(4.6 mm I.D.×250 mm);流动相:乙腈-1%乙酸水溶液(20:80);检测波长:332 nm;流速:1 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:10μL;此条件下检测木豆叶总黄酮提取液中牡荆苷含量0.2%。3.运用MTT法研究牡荆苷、木豆提取物对成骨细胞MC 3T3-E1细胞增殖作用的影响,发现在不同时间牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物对MC 3T3-E1均有不同程度促进增殖作用:(1).在牡荆苷浓度1×10-10μg/mL～1×10-1μg/mL范围内,对成骨细胞MC3T3-E1分别作用24 h、48 h和72 h时,随着给药剂量的增加,增殖效果明显加大,浓度范围在1×10-10μg/mL～1×10-6 μg/mL时,其增殖效果大于1×10-5 μg/mL～1×10-1 μg/mL。药物对MC 3T3-E1分别作用24h、48h和72h时,均能不同程度的促进MC3T3-E1的增殖、生长。(2).牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物在浓度范围1×10-10 μg/mL～1×10-6 μg/mL内,对成骨细胞MC3T3-E1分别作用24h、48h和72h,对MC3T3-E1具有一定的增殖作用,其中在浓度为1×10-8 μg/mL时,对成骨细胞的增殖效果最明显。其中在24h时牡荆苷组细胞增殖率达到37.52±0.34%,木豆叶总黄酮提取物达到46.17±0.76%;在48 h时牡荆苷组细胞增殖率达到62.17±1.34%,木豆叶总黄酮提取物达到55.54±2.47%;在72 h时牡荆苷组细胞增殖率达到38.54±0.52%,木豆叶总黄酮提取物达到36.49±0.82%。并且在一定浓度下呈浓度依赖性。4.采用比色法对牡荆苷、木豆叶总黄酮提取物对成骨细胞MC 3T3-E1分化效果进行研究,发现牡荆苷、木豆叶总黄酮提取物对细胞的分化有一定的促进作用。药物对成骨细胞分别作用3d、5d、7d时,牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物浓度为1×10-8μg/mL时对成骨细胞促进分化效果最明显,且在一定范围内与作用时间及浓度呈依赖关系。5.采用MTT法检测牡荆苷、木豆提取物对地塞米松逆转MC 3T3-E1增殖效果,结果在诱导后分别加入牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物处理,发现细胞增殖率均高于模型组,当牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物浓度为1×10-8 μg/mL且对成骨细胞作用72 h后,牡荆苷组细胞增殖率达到45.36±4.19%;木豆叶总黄酮提取物组细胞增殖率达到52.47±2.55%;表明牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物对地塞米松均有一定的逆转作用,并存在浓度依赖性。6.运用比色法对MC 3T3-E1细胞内ALP含量检测,结果在诱导后分别加入木豆叶总黄酮提取物及牡荆苷发现细胞内ALP含量在对照组与模型组之间且大于模型组小于对照组。其中牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物浓度为1×10-8μg/mL且对成骨细胞作用72 h后,牡荆苷组ALP含量为17.04±0.54%,木豆叶总黄酮提取物组ALP含量为15.06±0.27%。说明在一定浓度下地塞米松能抑制其分化。7.采用Von Kossa染色法对成骨细胞MC3T3-E1矿化结节数进行分析,结果对于同一组处理的细胞矿化结节个数随着加药时间的延长而增加,其中牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物对成骨细胞分别作用28 d时,牡荆苷组及木豆叶总黄酮提取物组结节个数均多于空白对照组。说明牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物对地塞米松诱导后的成骨细胞MC3T3-E1有逆转作用,并在一定剂量内存在时间依赖性。

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特异性产牡荆苷木豆内生真菌Dichotomopilus funicola Y3的发酵工艺优化及其生物活性研究

特异性产牡荆苷木豆内生真菌Dichotomopilus funicola Y3的发酵工...

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作者：马慧东北林业大学

学位级别：硕士

植物内生真菌能够产生具有多种生物活性的代谢产物,同时也可以产生与宿主相同或结构类似的成分,被认为是农业、工业和医学领域具有巨大价值的新化合物的宝库。牡荆苷(Vitexin)是豆科木豆属植物木豆中的主要有效成分,具有良好的抗氧化、... 详细信息

植物内生真菌能够产生具有多种生物活性的代谢产物,同时也可以产生与宿主相同或结构类似的成分,被认为是农业、工业和医学领域具有巨大价值的新化合物的宝库。牡荆苷(Vitexin)是豆科木豆属植物木豆中的主要有效成分,具有良好的抗氧化、抗肿瘤、降血压、细胞增殖等作用。临床上用于治疗心脑血管疾病,对缺血性心肌损伤具有良好的保护作用,其机理是增加冠状动脉的血流量、降低射血阻力及血浆粘度、提高RBC的变性能力、抑制血栓形成。目前,牡荆苷主要从植物中提取,含量低、工艺复杂和不易纯化。本试验以本课题组前期从木豆中分离并筛选出的产牡荆苷的内生真菌Y3为材料,鉴定内生真菌Y3的种属并申请Gen Bank号,为开发牡荆苷来源提供更多新的候选资源;为了适应工业化生产,对产牡荆苷内生真菌进行优化培养,以提高牡荆苷产量;并进行了内生真菌Y3发酵液牡荆苷提取物的抗氧化作用及其促进成骨细胞MC3T3-E1增殖作用的研究。试验取得如下结果:1.根据菌落形态及显微形态的观察结果,将菌株Y3初步鉴定为毛科菌属Chaetomidium up 在此基础上,对其ITS片段进行扩增并测序,得到长度为558 bp的DNA片段,在NCBI数据库中进行ITS序列同源性比对,Y3的ITS序列和NCBI中收录的Dichotomopilus funicola(EF017204)ITS序列同源性为99%,结合形态学特征和分子生物学鉴定结果将菌株Y3鉴定为Dichotomopilu funicola,并得到Genbank登录号为 MF800960。2.首先,以原始培养基为基础,通过单因素实验筛选出有利于牡荆苷合成的碳源、氮源、温度和pH,初步确定了发酵培养产牡荆苷的基本条件为葡萄糖20g/L、氯化铵8g/L、温度为30℃、pH=7,并且通过两周的培养确定其最佳培养时间为8天;然后,利用Plackett-Burman设计筛选出能诱导牡荆苷产量增加的显著诱导因子;最后,采用中心组合设计(CCD)实验拟合出产量与显著性诱导因素间的多元回归关系,并预测出理论极值且通过实验验证。最终,优化培养基中添加的诱导因子为L-苯丙氨酸0.06 g/L,水杨酸0.21g/L,硫酸铜0.19 g/L。预测牡荆苷产量为79.49 mg/L,在上述优化培养条件下对其进行验证实验,牡荆苷产量为79.15 mg/L,是原始水平的4.61倍。3.通过清除OH活性测定和清除DPPH活性测定,对内生真菌Y3发酵产物牡荆苷粗提物的抗氧化活性进行研究。试验结果表明:木豆内生真菌Y3发酵液中的牡荆苷粗提物拥有较高的DPPH自由基清除能力,清除率最高达94.42%,且高于同等浓度下Vc的清除率,计算得到其IC50=164 μg/mL;同时也具有较强的OH清除能力,最高达到53.12%,且高于同等浓度下Vc的清除能力,计算得其IC50=5.32mg/mL。***法是通过细胞代谢来检测细胞增殖。本实验为研究内生真菌产牡荆苷提取物对成骨细胞MC3T3-E1促进增殖的效果,以牡荆苷标准品为阳性对照,木豆产内生真菌粗提物为待测样品探讨其不同浓度、不同作用时间对颜色深浅的影响,确立了最佳的检测条件。结果如下:产牡荆苷内生真菌对成骨细胞MC3T3-E1的增殖产生不同程度的影响,从时间和浓度梯度来看,药物浓度为10-4μg/mL的内生真菌产牡荆苷发酵液粗提物对细胞作用24h时的增殖效果最显著,最大增殖率达到24.39%。综合以上研究结果,从木豆内生真菌中筛选到产牡荆苷的活性菌株,进行了形态学和分子学的鉴定确定其种属;通过发酵优化大大提高了其牡荆苷的产量;并且研究表明其牡荆苷粗提物不仅具有较强的抗氧化,而且对小鼠成骨细胞MC3T3-E1具有一定的增殖作用。本论文的研究成果丰富了牡荆苷提取来源和方法,非常值得开发利用。

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牡荆苷纳米混悬剂及其冻干粉的制备工艺研究

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作者：李旺东北林业大学

学位级别：硕士

牡荆苷是一种黄酮碳苷类天然活性成分,具有抗心肌缺血、降血压、抗病毒、抗糖尿病抗肿瘤、抗炎镇痛、抗氧化等多种生物活性和药理作用,临床上主要用于治疗各类心血管疾病。由于牡荆苷水溶性差、溶解度低,导致其口服生物利用度低,严重限... 详细信息

牡荆苷是一种黄酮碳苷类天然活性成分,具有抗心肌缺血、降血压、抗病毒、抗糖尿病抗肿瘤、抗炎镇痛、抗氧化等多种生物活性和药理作用,临床上主要用于治疗各类心血管疾病。由于牡荆苷水溶性差、溶解度低,导致其口服生物利用度低,严重限制了其在临床上的应用。纳米混悬剂是20世纪末新兴起的一种给药系统,在难溶性药物的临床应用上取得的丰硕的成果,是一种药物的纳米粒子依靠少量的表面活性剂提供稳定作用,而形成的一种稳定的胶体溶液。纳米混悬剂能有效提高难溶性药物的溶解度和溶出度,达到提高生物利用度和治疗效果的目的。此外,还可实现控释给药、靶向给药的作用。许多纳米混悬剂通过固体化,还可以将其制成片剂、胶囊、颗粒剂等剂型,以满足不同疾病治疗的需求,同时还可以提高它的稳定性,使其在临床上得到了广阔的发挥空间。本文应用难溶性药物增溶技术,将牡荆苷制成纳米混悬剂,然后将其制成冻干粉,考察牡荆苷纳米混悬剂的制备、冻干工艺,并进一步研究它的理化性质。测定静脉注射牡荆苷纳米混悬剂后的经时血药浓度。此外,还对牡荆苷在人工胃液和人工肠液的稳定性进行研究,考察纳米混悬剂作为牡荆苷口服给药载体的可能性。1、采用反溶剂重结晶法(以DMSO为溶剂,水为反溶剂)对牡荆苷原药进行了微粉化研究。考察了药物浓度、溶剂与反溶剂体积比以及搅拌转速对牡荆苷粒径的影响,并进一步通过正交试验,确定牡荆苷微粉的最佳制备工艺:药物浓度为35 mg/mL,反溶剂与溶剂体积比为15:1,搅拌转速为1500r/min,反应温度为4℃。此条件下牡荆苷晶体颗粒的平均粒径为368.4±31.23 nm,经CO2超临界快速膨胀干燥后,可获得平均粒径为478.8±26.97 nm的牡荆苷微粉。应用气相色谱(GC)检测牡荆苷微粉中DMSO残留含量为1757.100±168.83ppm,有机溶剂的残留符合ICH的标准。.2、应用高压匀质技术将牡荆苷微粉制成牡荆苷纳米混悬剂。牡荆苷纳米混剂的平均粒径随着匀质压力、匀质循环数的增大先减小后趋于稳定,考察了泊洛沙姆188、PEG300、卵磷脂对体系中牡荆苷纳米结晶的稳定作用。确定了高压匀质法制备牡荆苷纳米混悬剂的最佳制备工艺:牡荆苷微粉用量为50 mg,加入0.5%泊洛沙姆188的50 mL 7水溶液中,预分散后,在200、500 bar分别匀质2个循环,然后在800 bar下匀质20个循环,制备了平均粒径为128.6 nm,Zeta电位为16.78±0.89 mV的稳定牡荆苷纳米混悬剂。3、分别以成型性、复溶时间、冻干时间、平均粒径为指标,考察了不同冻干保护剂(甘露醇、葡糖糖、山梨醇等)对牡荆苷冻干粉的冷冻干燥效果,最终选择日甘露醇作为冻干保护剂,用量为主药的10倍,冻干时间为48 h。最佳工艺制备的牡荆苷纳米混悬剂冻干粉,复溶后平均粒径为135.7 nm,Zeta电位为17.05±1.40 mV,与未冻干前的基本一致,说明经冷冻干燥过程未影响牡荆苷纳米混悬剂的稳定性,冻干粉复溶后能恢复原有纳米混悬剂的特性。牡荆苷纳米混悬剂冻干后复溶0～8 h内,三个批次的平均粒径分别为135.5±13.2、138.9±14.9和137.3±12.6nm。重现行和稳定性试验说明反溶剂重结晶-高压匀质串联法制备牡荆苷纳米混悬剂冻干粉的重现性、稳定性良好。4、建立了测定牡荆苷含量的HPLC方法,该方法灵敏、精密度高、可靠,符合HPLC分析的要求。测定牡荆苷纳米混悬剂冻干粉中牡荆苷的含量为6.37±0.22%,理论含量值为6.25%,基本与理论含量相一致;饱和溶解度试验显示,牡荆苷纳米混悬剂冻干粉与牡荆苷原药的饱和溶解度分别为920.58±24.76和30.95±1.03 μm/mL,提高了 28.7倍;溶出度结果实验显示,在30min内,牡荆苷纳米混悬剂冻干粉与牡荆苷原药的累计溶出量分别为33.749±1.88和99.44±2.95%,溶出度得到显著提高。5、分别采用扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)、差示扫描(DSC)、红外光谱(FT-IR)、对牡荆苷纳米混悬剂冻干粉进行表征,牡荆苷纳米混悬剂冻干粉的结晶度与同组分物理混合的相比较明显降低,牡荆苷纳米混悬剂冻干粉中的牡荆苷化学结构未发生改变。6、利用药代动力学软件3P87对单剂量静脉注射牡荆苷纳米混悬剂静后的平均血药浓度-时间数据进行房室模型拟合,符合二室模型,分布相半衰期T1/2α为2.4924 min,消除半衰期T1/2β 为 57.123 min,AUC 为 407.668 mg·min·L-1 药物的总消除率 CL 为 0.0074 L·kg-1·min-1。

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尖镰孢菌40kD蛋白激发子的分离纯化、蛋白序列分析及生物活性研究

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作者：蔡曼东北林业大学

学位级别：硕士

激发子是来源于病原菌(真菌、细菌、卵菌及病毒等)、非病原菌、寄主植物和非寄主植物的能够诱导植物产生防卫反应的信号分子,包括蛋白质、糖蛋白、寡糖、多肽以及脂类等,其中最主要的是蛋白类激发子,尤其是真菌蛋白激发子。真菌蛋白激... 详细信息

激发子是来源于病原菌(真菌、细菌、卵菌及病毒等)、非病原菌、寄主植物和非寄主植物的能够诱导植物产生防卫反应的信号分子,包括蛋白质、糖蛋白、寡糖、多肽以及脂类等,其中最主要的是蛋白类激发子,尤其是真菌蛋白激发子。真菌蛋白激发子是广泛存在于植物病原真菌中,具有广谱诱导植物抗病性、促进植物生长的信号传导分子。真菌蛋白激发子是非特异性的激发子,能够诱导植物自身抗病基因的表达,启动植物防卫反应和免疫系统,提高植物自身免疫力,通过调节植物生长代谢系统,促进植物生长、促进植物种子萌发,引起植物的过敏反应等。因此真菌蛋白激发子有开发为新型的生物农药的潜力。根腐病不仅是农作物的严重病害,同时又是中药材栽培中的顽固性病害,目前尚未找到有效的根治措施。引起中药材根腐病的病原菌主要是镰孢菌包括尖孢镰菌、茄病镰刀菌、燕麦镰刀菌、木贼镰刀菌、半裸镰刀菌、立枯丝核菌等。不同种类的药用植物被镰孢菌属病菌侵染后其根、块根、块茎、休眠芽等地下部分均腐烂坏死,呈黄色、褐色干腐状,对药用植物本身及其药用价值造成很大的损失。大豆根腐病(Soybeanrootrot)是大豆产区普遍发生的根部病害,一般在土壤潮湿地块或多雨年份发病严重,病情指数较高;是由大豆根腐病菌侵染引起的。在病株根及茎基部会产生椭圆形褐色长条形甚至不规则形的凹陷斑直至扩展成环绕状,但不会导致主根的大斑块,不会引起病株枯死,但会导致大量减产。尖镰孢菌属半知菌亚门镰孢属,能引起大豆、禾谷类以及药用植物的根腐病。禾谷类尖镰孢菌基本已研究透彻,但是源于豆科尤其是来源于大豆的尖镰孢菌蛋白激发子的研究并不多。目前尚未见从大豆根腐病原菌尖镰孢菌中分离纯化出具有生物活性的蛋白激发子的相关报道。本文通过超声破碎、离心、不同温度处理、凝胶过滤、离子交换和分子筛等联用的方法,从大豆根腐病菌尖镰孢菌中首次分离出一表观分子量约为40kD的蛋白,以小麦、大豆为生物材料,考察其对小麦种子萌发和幼苗生长、小麦幼苗根系生长和根系活力、小麦抗旱性以及大豆防御相关酶活性的生物学活性的影响。研究结果如下:1 建立了尖镰孢菌40kD蛋白激发子初步纯化体系尖镰孢菌在PD培养基中培养后高速离心得菌丝体,用Tris-HCl缓冲液提取总蛋白,分别室温、煮沸处理30min,离心取上清,再经Hitrap Q HP离子交换柱层析,通过洗脱峰对小麦种子的发芽率以及幼苗的生长作为生理指标,确定蛋白粗提液以及粗纯化峰具有一定蛋白质激发子活性。2 40kD尖镰孢菌蛋白激发子的粗提液的纯化及其活性研究蛋白粗提液经过不同温度(室温、40℃、60℃、80℃、100℃)处理后,经脱盐处理后再经Source 30Q Column后纯化出含目的成分的峰,进行活性检测,发现在小麦幼苗生长至第6d时,室温、40℃、60℃与对照相比,差异显著即明显促进幼苗的生长,尤其是60℃处理的。因此进一步将 60℃Source 30Q Column 活性峰经 Superdex 200 3/200 GL column纯化,得到分子量约为40kD单条带,经检测其具有活性。说明该蛋白是一种来源于大豆根腐病菌—尖镰孢菌的新型蛋白激发子,是首次从此菌中分离纯化出的蛋白激发子。3 40kD尖镰孢菌蛋白激发子的生物活性研究对于40kD尖镰孢菌蛋白激发子的生物学活性研究包括小麦幼苗根系生长和根系活力、小麦抗旱性以及大豆防御相关酶活性的生物学活性的影响。用浓度为1、5、10ug/ml的40kD蛋白液处理5d后,小麦幼苗株高分别比对照提高5.64%、11.25%和14.69%;浓度为1、5、10、20ug/ml的40KD蛋白液处理6d后,小麦根系琥珀酸脱氢酶活力比对照分别提高1.78%、3.52%、7.79%和14.37%;5ug/ml蛋白液处理小麦后,小麦抗旱综合系数比对照提高了 59%,说明该纯化蛋白能够增强小麦的抗旱性,而且可能与其根系活力的增加有关。PAL、CAT和PPO均与植物的抗病性有关。测定纯化蛋白液处理后的大豆叶肉内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化。经蛋白液处理后,大豆叶肉内的PAL、CAT和PPO的活性均有不同程度的提高。蛋白液诱导后24h,PAL活性达到最高值,比对照组增加了 62.5%;在蛋白液诱导48h,CAT和PPO活性均达到最高值,并且比对照组分别增加了 98.7%和150%。实验结果表明:尖镰孢菌的蛋白液能够促进小麦幼苗根系的生长,增强小麦的抗旱性和大豆防御相关酶活性,该纯化蛋白是具有生物学活性的蛋白激发子。4 40kD尖镰孢菌蛋白激发子质谱序列分析纯化所得活性蛋白进行SDS-PAGE电泳后,将电泳条带切下进行质谱鉴定,得到该蛋白的肽指纹图谱,将得到肽指纹图谱于数据库(NCBI)中搜索,均无匹配蛋白结果,说明该蛋白为一全新蛋白。根据一级质

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木豆叶中球松素的超声提取工艺及其对成骨细胞MC3T3-E1作用研究

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作者：付丽楠东北林业大学

学位级别：硕士

本文通过HPLC-UV法检测木豆叶中球松素(5’-羟基-7-甲氧基-2-苯基色满-4-酮,pinostrobin)的含量,并通过正交设计实验对木豆叶球松素的超声提取条件进行优化;同时以成骨细胞MC3T3-E1为体外模型,研究球松素及木豆叶提取物对成骨细胞MC3T3... 详细信息

本文通过HPLC-UV法检测木豆叶中球松素(5’-羟基-7-甲氧基-2-苯基色满-4-酮,pinostrobin)的含量,并通过正交设计实验对木豆叶球松素的超声提取条件进行优化;同时以成骨细胞MC3T3-E1为体外模型,研究球松素及木豆叶提取物对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及矿化等生物学活性并对其作出评价,研究结果如下:1.运用HPLC-UV方法,确定了测定木豆叶中球松素含量的检测条件,色谱条件为:色谱柱:HiQ sil C18W(4.6mmφ×250mm,5μm);流动相:(A)甲醇-(B)0.1%水(v/v),梯度洗脱条件为0-15min A:75%-70%,15-25 min A:70%-85%,25-40 min A:85%-75%;流速:1.0mL/min;柱温25℃;检测波长287nm。该方法的精密度和重复性的R.S.D.均小于3%。2.以木豆叶为原料,采用正交设计L9(34)对其各影响因素进行优化,确定最佳提取工艺参数其结果如下:甲醇浓度80%,提取时间60min,温度50℃,料液比1:40(g/mL),在此条件下的球松素的最大提取率为1.832mg/g。木豆叶球松素提取物具有较好的DPPH自由基清除能力,其IC50值为0.281mg/mL,与抗坏血酸的IC50值0.202 mg/mL相近。表明应用正交设计优化木豆叶中球松素的提取率安全可靠,球松素的甲醇提取物具有较好的抗氧化活性。3.运用MTT法研究球松素对成骨细胞MC3T3-E1增殖的促进作用,结果表明木豆提取物及球松素对成骨细胞MC 3T3-E1均有不同程度的影响,与阳性对照雌二醇相比,球松素的促进增殖效果更为明显,从时间和浓度梯度来看,40μg/mL球松素作用成骨细胞24h,对细胞的增殖有显著的效果,增殖率达到(26.27±0.95)%。4.利用硝酸还原法检测球松素对成骨细胞MC3T3-E1内NO含量的影响,结果表明球松素浓度为40μg/mL,作用MC3T3-E1成骨细胞24h后,球松素组的NO水平(63.15±2.15)μmol/L显著低于对照组(82.63±3.48)μmol/L(P<0.01)。该结果显示:球松素促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,可能与其维持低水平的NO有关。5.运用比色法研究球松素以及木豆叶提取物对成骨细胞MC 3T3-E1中ALP活性进行检测,结果表明,球松素、木豆叶提取物对成骨细胞的分化均有不同程度的影响,球松素及木豆叶提取物中球松素浓度为40μg/mL时,对成骨细胞MC3T3-E1作用4d时,对成骨细胞促进分化效果最明显,达到(37.022±1.638)U/gprot。说明在一定范围内成骨细胞的分化与作用时间及作用浓度成依赖关系。6.运用酶联免疫法检测球松素对成骨细胞MC3T3-E1中COL Ⅰ的含量,结果表明球松素浓度在10 μg/mL-40 μg/mL对成骨细胞内的COL Ⅰ的含量有不同程度的影响,其中在球松素处理5d后,与对照组相比,成骨细胞内的COL Ⅰ的含量显著增高,达到(6.207±0.256)ng/106。7.将球松素(10 μg/mL-40 μg/mL)分别作用于成骨细胞MC 3T3-E1 14d、21d、28d,采用VonKossa法对MC3T3-E1进行染色,结果发现,相同浓度球松素处理的细胞矿化结节数目,随着药物作用时间延长而增加,并于处理后28d矿化结节数最多,钙盐沉积面积增大;在球松素浓度为40μg/mL,对成骨细胞MC 3T3-El作用28d时,成骨细胞矿化结节数目达到(177.21±25.86)个,说明球松素对成骨细胞的矿化具有促进作用,并存在时间和浓度依赖性。8.利用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)对骨钙素基因(OC)的表达进行实时定量分析,用球松素处理成骨细胞24h,随着球松素浓度的升高OC基因的表达呈上调趋势。当球松素浓度为40μg/mL时,OC基因的相对表达量为对照组的8.3倍,表明球松素能够促进成骨细胞OC基因的表达。9.采用MTT法检测球松素、木豆提取物对地塞米松预处理的成骨细胞MC 3T3-E1增殖抑制的逆转作用,在地塞米松预处理组中分别加入球松素及木豆叶提取物,结果发现细胞增殖率均高于激素组而低于空白对照组。说明球松素及木豆叶提取物能够在一定程度上逆转地塞米松对成骨细胞增殖的抑制作用,并存在浓度依赖效果。10.运用比色法研究球松素对成骨细胞内ALP含量的影响,结果在地塞米松预处理组中分别加入球松素以及木豆叶提取物,发现成骨细胞MC 3T3-E1内ALP含量高于地塞米松组且低于对照组。其中球松素及木豆叶提取物浓度为40μg/mL,作用成骨细胞MC3T3-E14d后,球松素组ALP含量为(10.235±0.283)U/gprot,木豆叶提取物组ALP含量为(8

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木豆中产牡荆苷内生真菌的分离鉴定及其对MC3T3-E1细胞增殖作用研究

木豆中产牡荆苷内生真菌的分离鉴定及其对MC3T3-E1细胞增殖作用研...

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作者：牛丽丽东北林业大学

学位级别：硕士

内生真菌是生活于健康植物的各种组织和器官中,能够产生与宿主植物相同或相似的化合物,其次生代谢产物种类繁多,生物活性各异,在农业、医药、工业等领域表现出良好的应用前景。木豆为豆科木豆属植物,具有丰富的药理活性,黄酮类和芪类是... 详细信息

内生真菌是生活于健康植物的各种组织和器官中,能够产生与宿主植物相同或相似的化合物,其次生代谢产物种类繁多,生物活性各异,在农业、医药、工业等领域表现出良好的应用前景。木豆为豆科木豆属植物,具有丰富的药理活性,黄酮类和芪类是其主要活性成分,从木豆当中分离获得的活性成分在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化及抗菌等方面都具有非常重要的作用。牡荆苷(Vitexin),是存在于木豆中的一类重要的黄酮类物质,临床上用于治疗心脑血管疾病,对缺血性心肌损伤具有良好的保护作用,其机理是增加冠状动脉的血流量、降低射血阻力及血浆粘度、提高RBC的变性能力、抑制血栓形成。本课题主要进行木豆产牡荆苷内生真菌的分离鉴定及其对促进成骨细胞MC3T3-E1增殖作用的研究。研究结果如下：1.以木豆根、茎、叶为材料,将已消毒的植物材料接种至PDA上进行分离培养,传代和纯化,最终获得纯化菌株154株,其中从根中获得76株;从茎中获得15株;从叶中获得63株,均在PDA斜面试管,4度保存。2.参照《真菌鉴定手册》和分子生物学方法鉴定,根据木豆内生真菌不同形态,将分离得到的154株木豆内生真菌进行分类,大致分为：镰刀菌属(Fusarium sp.),毛壳菌属(Chaetomium sp.),附球孢属(Epicoccum sp.),节菱孢属(Arthrinium sp.),刺毛霉属(Actinomucor sp.),链格孢属(Alternaria sp.)等。3.运用HPLC-UV和LC-MS/MS方法,确定了木豆产牡荆苷内生真菌的检测条件,色谱条件为：色谱柱：HiQ sil C18W (4.6 mmψ×250 mm,5μm);流动相为乙腈：1%乙酸水溶液=20：80(v/v);检测波长：332 nm;流速：1 mL/min;进样量：15 μL。通过HPLC技术分析与检测,发现两株产牡荆苷的内生真菌,分别是镰刀菌属(Fusarium sp.)的G6和毛壳属(Chaetomium sp.)的Y3。4.利用单因素-响应面中心组合设计方法对液体发酵培养基的种类、组分、初始pH值及培养条件进行优化,以G6菌株为实验对象,考察了影响内生真菌牡荆苷产量的主要因素,包括不同种类培养基、碳源浓度、氮源浓度、培养时间、培养温度及培养基初始pH值等。确定了最佳的木豆内生真菌G6菌株发酵培养条件：培养基为PDB液体培养基、添加2%的葡萄糖为碳源、添加1%的硫酸铵为氮源、培养基初始pH值为5、培养时间为6天、培养温度为28℃,该条件下培养G6获得牡荆苷的量达到18.51 mg/L。5.通过利用MTT法研究内生真菌产牡荆苷菌株提取物对成骨细胞MC3T3-E1促进增殖的效果,采取牡荆苷标准品为阳性对照,木豆产内生真菌粗提物为待测样品,结果如下：产牡荆苷内生真菌对成骨细胞MC3T3-E1的增殖产生不同程度的影响,从时间和浓度梯度来看,药物浓度为1×10-4μg/mL的内生真菌产牡荆苷发酵液粗提物对细胞作用12 h时的增殖效果最显著,最大增殖率达到33.46%。本文以木豆植株作为宿主植物,分别从根、茎、叶中分离内生真菌,通过形态学和分子生物学方法鉴定内生真菌的种属分类;利用HPLC方法筛选出产牡荆苷的内生真菌并计算其产量;通过响应面中心组合设计实验对牡荆苷内生真菌液体培养条件进行优化;以成骨细胞MC3T3-E1为体外模型,考察内生真菌产牡荆苷菌株对MC3T3-E1成骨细胞增殖率的影响。本研究首次从木豆中获得了产牡荆苷的内生真菌菌株G6和Y3,利用该菌株生产牡荆苷时间短产量高,易于实现规模化生产,应用前景广阔。

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木豆内生放线菌的分离鉴定及其抗菌活性研究

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作者：郑文艺东北林业大学

学位级别：硕士

抗菌药物的滥用导致了耐药病原菌的不断增加和扩散,成为威胁人们健康的一个重要因素,因此急需寻求新型生物活性化合物。药用植物内生放线菌特殊的生活环境决定了其具有多方面的应用潜力,作为不同于土壤环境的特殊生境中的微生物,植物内... 详细信息

抗菌药物的滥用导致了耐药病原菌的不断增加和扩散,成为威胁人们健康的一个重要因素,因此急需寻求新型生物活性化合物。药用植物内生放线菌特殊的生活环境决定了其具有多方面的应用潜力,作为不同于土壤环境的特殊生境中的微生物,植物内生放线菌有着丰富的功能多样性,因此在微生物药物开发方面有着很好的应用前景。木豆(Cajanus cajan)是一种具有多种药理活性的药用植物,目前关于木豆微生物资源的报道多限于根瘤菌共生固氮方面和木豆内生细菌及真菌的研究,对木豆内生放线菌认识和研究有限,属于尚未被挖掘的潜在农用与药用微生物资源,有必要对其应用开发潜力进行研究。本论文拟从木豆植株的根、茎、叶和根瘤组织当中,采用不同的培养基分离内生放线菌,并筛选抗菌活性菌株,为筛选生物活性化合物提供菌种资源。通过高分辨质谱(HRMS)、超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)、气相色谱-串联质谱(GC-MS)对生物活性代谢物进行分析,并以活性为指导对抗菌活性物质进行分离、纯化和鉴定以阐明其活性的物质基础。具体研究结果如下:1.以木豆健康植株的根、茎、叶及根瘤组织为材料,采用稀释涂布法在腐殖酸培养基(HV)、高氏一号培养基(GS)、纤维素-脯氨酸培养基(CPA)、淀粉酪蛋白琼脂培养基(SCA)和酵母麦芽琼脂培养基(ISP2)五种培养基上进行分离和纯化,最终获得纯化菌株36株。其中在根中分离得7株,茎中分离得8株,叶中分离得3株,根瘤中分离得18株。参照《放线菌的分类和鉴定》和16S r RNA序列分析对36株木豆内生放线菌进行鉴定,结果表明所有菌株均属于链霉菌属,其中包括Streptomyces phaeochromogenes、Streptomyces sanglieri、Streptomyces atratus、Streptomyces olivaceus、Streptomyces gilvifuscus和Streptomyces camponoticapitis。2.以8株植物病原菌和8株人类病原菌为指示菌,对36株木豆内生放线菌的体外抗菌活性进行筛选。结果表明,36株分离菌株中,有15株对至少一株植物病原菌有抑菌活性,占比41.67%,且15株放线菌中有11株菌株对至少一株人类病原菌有抑制作用,其中菌株J10、Y2对8株植物病原菌和8株人类病原菌具有较为广谱的体外抗菌活性,因此,选择菌株J10和Y2进一步分析验证其抗菌功能。通过形态学、培养特征和16S r RNA序列分析对两株菌进行鉴定,经鉴定菌株J10为暗黑链霉菌(Streptomyces atratus),菌株Y2为橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)。3.通过HRMS和GC-MS对放线菌菌株J10和Y2的乙酸乙酯(EA)提取物进行分析。经HRMS分析:菌株J10和Y2的发酵产物中的生物活性代谢物主要包括有机酸类、生物碱类和酯类物质,这些化合物已被认为具有抗菌、抗植物致病性和生物防治特性;经GC-MS分析:菌株J10的发酵产物含有11种不同的化合物,麦角胺和环(脯氨酸-亮氨酸)二肽为主要活性成分;菌株Y2含有21种不同的化合物,其中包含脂肪酸类和苯乙酰胺、α-蒎烯等活性成分。两者共同揭示了菌株J10和Y2发挥抗菌作用的可能物质基础。并通过PCR检测发现,菌株J10的基因组中含有编码Ⅰ型聚酮合成酶(PKS-Ⅰ)和非核糖体肽类合成酶(NRPS)的相关基因,菌株Y2的基因组中含有编码NRPS合成的相关基因,表明菌株J10和Y2可能通过生产非核糖体肽类抗生素或聚酮类物质发挥抗菌作用。4、采用UPLC-MS/MS定性检测牡荆苷、荭草苷、木犀草素等十种黄酮类物质,结果表明:菌株J10的EA提取物中含有鹰嘴豆芽素A、木犀草素和荭草苷,菌株Y2发酵产物中含有鹰嘴豆芽素A、芒柄花素、芹菜素、染料木素和柚皮素。确证了分离于木豆茎中的菌株J10和分离于木豆叶中的菌株Y2均能产生与宿主植物木豆相同的代谢产物,进一步证实了“内共生理论”,也为菌株的广谱抗菌活性提供物质基础。5、以活性为指导,选取革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌粘质沙雷氏菌作为指示菌,通过薄层色谱(TLC)、制备型薄层色谱和高效液相色谱(HPLC)对菌株J10的EA提取物进行分离纯化,并利用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、高分辨质谱(HRMS)和核磁共振波谱(H NMR和C NMR)等技术对分离的活性物质进行鉴定。最终鉴定出菌株J10能产生抗生素:(+)-Ochromycinone。综上所述,我们对木豆内生放线菌进行了分离和纯化,并进行了形态学和分子生物学鉴定。通过体外活性实验最终筛选出两株对植物病原菌和人类病原菌同时具有抗菌活性的菌株J10和Y2。通过多方法分析其抗菌的物质基础以及对主要抗菌活性物质进行分离鉴定以充分验证

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一株大豆促生菌Bacillus safensis J2的分离、筛选及其促生功能研究

一株大豆促生菌Bacillus safensis J2的分离、筛选及其促生功能研...

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作者：唐佩佳东北林业大学

学位级别：硕士

木豆是具有药用、食用和生态等多种价值的木本豆科植物,主要分布于热带和亚热带地区,在我国主要分布在广西、海南、云南等地。目前木豆栽培生产粗放、产量低、生物量低,制约了木豆的产业化发展。化学肥料在提高土壤肥力、保障粮食安全... 详细信息

木豆是具有药用、食用和生态等多种价值的木本豆科植物,主要分布于热带和亚热带地区,在我国主要分布在广西、海南、云南等地。目前木豆栽培生产粗放、产量低、生物量低,制约了木豆的产业化发展。化学肥料在提高土壤肥力、保障粮食安全等方面曾发挥了不可替代的作用,但其过度施用会产生环境污染、土壤枯竭等问题。目前林业、农业提质增产的趋势是减少化学肥料使用,探索环境友好型生物促生菌剂。与化学肥料相比,微生物菌剂因具有安全、环保和有效等优点,逐渐代替化肥成为本领域的研究热点。目前,有关木豆的微生物资源尚未充分开发,本研究拟从木豆不同组织部位及根际土中筛选高效的植物生长促进菌(PGPB),并对其促生功能进行深入研究,为开发高效环保的微生物菌剂,提高作物产量提供科学依据。具体研究结果如下:1.以木豆根、茎、叶、根际土为材料,采用梯度稀释涂板法在NA、LB和TSA三种培养基上进行分离和纯化,最终获得纯化菌株41株。其中根在分离得4株,茎中分离得5株,叶中分离得4株,根际土壤中分离得28株。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和16S rRNA序列分析对41株木豆内生细菌进行分类,主要分为:假单胞菌属(Pseudomonas sp)、芽孢杆菌属(Bacillus sp)、嗜麦芽单胞菌属(Stenotrophomonas sp)、肠杆菌属(Enterobactersp)。2.对从木豆中分离的的41株内生细菌及根际细菌产IAA、产氨、溶磷、固氮、形成生物膜及产水解酶(蛋白酶、果胶酶、淀粉酶)等体外促生活性进行筛选。结果表明,其中14株菌具有一种或多种体外促生活性;5株菌具有产IAA(浓度范围在1.78-32.28 μg/ml)活性;10株菌具有溶磷(D/d值范围在1.25-6)活性;10株菌株具有固氮活性;11株具有产蛋白酶(D/d值的范围为1.4-2)活性;2株菌具有产淀粉酶(D/d值分别为2.2和1.7)活性;1株菌具有产生果胶酶(D/d值为3)活性;9株菌具有形成生物膜活性;10株菌株具有产生氨活性。3.以多种体外促生活性指标进行综合评价,最终获得一株具有体外促生活性优良的内生细菌菌株J2,经鉴定为Bacillus safensis。采用HPLC及UPLC-MS/MS分析鉴定*** J2产生促生活性的物质基础,结果表明:*** J2发酵液的乙酸乙酯提取物中存在IAA、KT及6-BA三种生长激素,其在发酵液中的含量分别为41.29μg/mL,46.36 μg/mL 和 27.06 μg/mL。4.采用GC/MS对*** J2发酵液中的挥发性促生活性物质进行研究,结果表明,J2能够产生双酮哌嗪类抗菌物质,经鉴定三种双酮哌嗪化合物分别为:六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮(Cyclo-(Gly-Pro))、六氢-3-异丁基吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮(cyclo-(Pro-Leu))、六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮(cyclo-(Pro-Phe))。并通过PCR检测发现,该菌株含有编码非核糖体肽合成酶的基因(NRPS)。5.以拟南芥、玉米和木豆三种植物为实验材料进行Bacillus safensis J2菌株的体内促生活性验证。结果表明J2处理的拟南芥幼苗的根系发育优于对照组。J2处理的木豆种子的出苗率、株高、鲜重、干重、结瘤及结荚数等生长参数相比于对照组均显著提高,J2处理的玉米幼苗根长、株高、鲜重和干重分别比对照组增长了 7.94%、44.13%、28.85%、26.67%。

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