木豆内生放线菌的分离鉴定及其抗菌活性研究

作     者：郑文艺 

作者单位：东北林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：顾成波

授予年度：2022年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：木豆 内生放线菌 抗菌活性 生物活性代谢物 (+)-Ochromycinone 

摘      要：抗菌药物的滥用导致了耐药病原菌的不断增加和扩散,成为威胁人们健康的一个重要因素,因此急需寻求新型生物活性化合物。药用植物内生放线菌特殊的生活环境决定了其具有多方面的应用潜力,作为不同于土壤环境的特殊生境中的微生物,植物内生放线菌有着丰富的功能多样性,因此在微生物药物开发方面有着很好的应用前景。木豆(Cajanus cajan)是一种具有多种药理活性的药用植物,目前关于木豆微生物资源的报道多限于根瘤菌共生固氮方面和木豆内生细菌及真菌的研究,对木豆内生放线菌认识和研究有限,属于尚未被挖掘的潜在农用与药用微生物资源,有必要对其应用开发潜力进行研究。本论文拟从木豆植株的根、茎、叶和根瘤组织当中,采用不同的培养基分离内生放线菌,并筛选抗菌活性菌株,为筛选生物活性化合物提供菌种资源。通过高分辨质谱(HRMS)、超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)、气相色谱-串联质谱(GC-MS)对生物活性代谢物进行分析,并以活性为指导对抗菌活性物质进行分离、纯化和鉴定以阐明其活性的物质基础。具体研究结果如下:1.以木豆健康植株的根、茎、叶及根瘤组织为材料,采用稀释涂布法在腐殖酸培养基(HV)、高氏一号培养基(GS)、纤维素-脯氨酸培养基(CPA)、淀粉酪蛋白琼脂培养基(SCA)和酵母麦芽琼脂培养基(ISP2)五种培养基上进行分离和纯化,最终获得纯化菌株36株。其中在根中分离得7株,茎中分离得8株,叶中分离得3株,根瘤中分离得18株。参照《放线菌的分类和鉴定》和16S r RNA序列分析对36株木豆内生放线菌进行鉴定,结果表明所有菌株均属于链霉菌属,其中包括Streptomyces phaeochromogenes、Streptomyces sanglieri、Streptomyces atratus、Streptomyces olivaceus、Streptomyces gilvifuscus和Streptomyces camponoticapitis。2.以8株植物病原菌和8株人类病原菌为指示菌,对36株木豆内生放线菌的体外抗菌活性进行筛选。结果表明,36株分离菌株中,有15株对至少一株植物病原菌有抑菌活性,占比41.67%,且15株放线菌中有11株菌株对至少一株人类病原菌有抑制作用,其中菌株J10、Y2对8株植物病原菌和8株人类病原菌具有较为广谱的体外抗菌活性,因此,选择菌株J10和Y2进一步分析验证其抗菌功能。通过形态学、培养特征和16S r RNA序列分析对两株菌进行鉴定,经鉴定菌株J10为暗黑链霉菌(Streptomyces atratus),菌株Y2为橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)。3.通过HRMS和GC-MS对放线菌菌株J10和Y2的乙酸乙酯(EA)提取物进行分析。经HRMS分析:菌株J10和Y2的发酵产物中的生物活性代谢物主要包括有机酸类、生物碱类和酯类物质,这些化合物已被认为具有抗菌、抗植物致病性和生物防治特性;经GC-MS分析:菌株J10的发酵产物含有11种不同的化合物,麦角胺和环(脯氨酸-亮氨酸)二肽为主要活性成分;菌株Y2含有21种不同的化合物,其中包含脂肪酸类和苯乙酰胺、α-蒎烯等活性成分。两者共同揭示了菌株J10和Y2发挥抗菌作用的可能物质基础。并通过PCR检测发现,菌株J10的基因组中含有编码Ⅰ型聚酮合成酶(PKS-Ⅰ)和非核糖体肽类合成酶(NRPS)的相关基因,菌株Y2的基因组中含有编码NRPS合成的相关基因,表明菌株J10和Y2可能通过生产非核糖体肽类抗生素或聚酮类物质发挥抗菌作用。4、采用UPLC-MS/MS定性检测牡荆苷、荭草苷、木犀草素等十种黄酮类物质,结果表明:菌株J10的EA提取物中含有鹰嘴豆芽素A、木犀草素和荭草苷,菌株Y2发酵产物中含有鹰嘴豆芽素A、芒柄花素、芹菜素、染料木素和柚皮素。确证了分离于木豆茎中的菌株J10和分离于木豆叶中的菌株Y2均能产生与宿主植物木豆相同的代谢产物,进一步证实了“内共生理论,也为菌株的广谱抗菌活性提供物质基础。5、以活性为指导,选取革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌粘质沙雷氏菌作为指示菌,通过薄层色谱(TLC)、制备型薄层色谱和高效液相色谱(HPLC)对菌株J10的EA提取物进行分离纯化,并利用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、高分辨质谱(HRMS)和核磁共振波谱(H NMR和C NMR)等技术对分离的活性物质进行鉴定。最终鉴定出菌株J10能产生抗生素:(+)-Ochromycinone。综上所述,我们对木豆内生放线菌进行了分离和纯化,并进行了形态学和分子生物学鉴定。通过体外活性实验最终筛选出两株对植物病原菌和人类病原菌同时具有抗菌活性的菌株J10和Y2。通过多方法分析其抗菌的物质基础以及对主要抗菌活性物质进行分离鉴定以充分验证