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人源抗-HBs Fab表达系统的转换与制备研究

人源抗-HBs Fab表达系统的转换与制备研究

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作者：陆慧琦第二军医大学

学位级别：硕士

随着重组抗体技术的发展，人鼠嵌合抗体、人源化抗体在临床的使用已初显成效。治疗用抗体的核心问题是抗体蛋白的完全人源化，以消除用于人体时产生的HAMA反应或其他并发症，而完全的人源抗体完全避免了鼠源成分，是未来临床应用的必要... 详细信息

随着重组抗体技术的发展，人鼠嵌合抗体、人源化抗体在临床的使用已初显成效。治疗用抗体的核心问题是抗体蛋白的完全人源化，以消除用于人体时产生的HAMA反应或其他并发症，而完全的人源抗体完全避免了鼠源成分，是未来临床应用的必要形式。人源抗体得以有效应用的关键在于其低免疫原性以及保留了对抗原的特异性结合的生物学特性，正成为当前研究的热点。以噬菌体表面呈现技术制备抗体片段，如Fabs或单链Fv，是1990年由McCafferty等最先报道的。通常利用各种噬菌体载体、基因融合技术，连同PCR扩增技术，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库，是近年来形成的最新方法，从而回避了杂交瘤技术和免疫。人源抗体制备的瓶颈是获得高表达、高产量、高活性抗体。前期的研究表明，以pComb3为载体的抗体片段表达无法避免较高的基础表达，难以达到上述的理想制备。本课题引入了一个新的策略，即以pBAD/gⅢ为载体重新克隆抗—HBs Fab基因。这个系统的主要特点在于①在无诱导剂的条件下，表达水平很低，②存在诱导剂的情况下，获得适度地高表达水平，③调节表达地诱导剂浓度范围很宽，④表达系统控制严格。故通过改变诱导方式与表达条件，提升原核表达人源抗体片段的经济性与实用性。另一方面，培养和诱导表达的条件对重组蛋白的纯化有很大的影响。洗涤液的最适盐浓度和咪唑浓度对不同的蛋白有轻微的差异，必须加以确定。本课题共分两个部分：一、人源生物工程抗—HBsFab的克隆与表达以pComb3/anti-HBsFab菌株的质粒为模板，根据pBAD载体的要求与Fab基因结构分别设计引物，分别扩增Fd与λ轻链。依据Fd与λ轻链两端所引入的特异性酶切位点，以相同的内切酶分别酶切载体，分别以连接酶与相应的Fd与入轻链片段连接，构建pBAD-Fd和pBAD-Lc单链抗体片段表达载体。连接产物转化Top10细菌后，经PCR法或酶切鉴定，筛选目的单链抗体片段基因阳性克隆，形成pBAD单肽表达模式。设计特异引物，以基因扩增方式制备包含λ轻链抗体片段基因和启动子、引导序列的核苷酸序列。双酶切已克隆有抗体第二军医大学硕士学位论文中文摘要片段基因PBAD干d载体及上述扩增制备的核着酸序列，以连接酶连接。连接产物转化T叩细菌后，增菌，经测序和酶切鉴定，筛选阳性克隆，琼脂糖电泳证实Fab基因的正确插入。增菌培养所选克隆，在阿拉伯糖诱导条件下表达融合蛋白，进行双启动表达试验，验证双肽同步表达的可行性。筛选阳性菌株进行人源抗体片段的批量制备。挑取正确插入的单克隆转化菌落，于100ml含AmP＊叭）的LB培养基中生长，至OD。。为 1．0时，加入终浓度为 0．02％ara3inose，37℃诱导表达 6 小时，表达上清浓缩至5ml，行12％的SDS－PAGE并转印至硝酸纤维素膜，经封闭后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人laG Fab结合，于50Kd处可见明显蛋白区带，证实该区带确为Fab，HBsAg特异blot结果表明表达产物具有较好的抗原结合活性。比较原pComb3表达系统，改变后的pBAD表达系统明显提高了抗一HBsFab 的表达量并保持了原有抗体活性。二、人源性抗叫BsPab下BAD伯m表达和纯化条件的优化 l．人源性抗一HBsFab－＂BAD／sill表达条件的选择原核表达己克隆的pBAD一抗HBsFab，分别比较不同的菌体密度（OD。。二0．7， OD。二1．0，OD。＝1．2）、诱导剂（阿拉伯糖）终浓度（0．002％，0．02％，0．2％）及诱导时间（4h，6h）对表达的影响。三组变量经统计学分析无显著差异（P＞0．05）。从实验数据的直观分析，在本实验所设定的三组参数，以OD。＝1．0，阿拉伯糖终浓度为0．02％，诱导表达 6h的表达产物吸光度值最佳。 SDS－PAGE电泳和免疫印迹结果显示，与用噬菌体载体pComb3表达的抗一HBsFab相比，具有相同的抗原结合活性。 2．优化应用Ni－NTA柱亲和纯化人源抗HBsFab抗体片段 pBAD一抗HBs重组蛋白通过结合的His标签，应用Ni－NTA金属资合柱纯化，以阿拉伯糖诱导表达制备出抗叫BsFab上清。该融合蛋白带有6 X His标签，利用多聚组氨酸与过渡态金属离子的高亲和力性质，经镍亲和层析柱州 i个TA）对表达产物进行纯化。分别应用含不同浓度咪哩和不同浓度盐的洗涤液洗柱，最后用一定浓度咪哇的洗脱液洗脱目的蛋白，通过

关键词：抗-HBsFab pBAD载体蛋白的原核表达 Ni-NTA亲和纯化抗体活性

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Micro RNA对原发性胆汁性肝硬化患者来源Th17细胞的调控机制研究

Micro RNA对原发性胆汁性肝硬化患者来源Th17细胞的调控机制研究

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作者：唐裕杰第二军医大学

学位级别：硕士

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一种以肝小叶汇管区淋巴细胞浸润、小胆管特异性破坏、血清特征性抗线粒体抗体(AMA)为特征的自身免疫性肝病,常伴有其它系统、器官的自身免疫症状,发病机理尚不明确。近年来PBC发... 详细信息

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一种以肝小叶汇管区淋巴细胞浸润、小胆管特异性破坏、血清特征性抗线粒体抗体(AMA)为特征的自身免疫性肝病,常伴有其它系统、器官的自身免疫症状,发病机理尚不明确。近年来PBC发病率不断上升,在北美国家40岁以上妇女中高达1/1000;在我国,尚没有系统性的原发性胆汁性肝硬化的流行病学数据资料,但是从文献报道和来院就医的患者数量来看,原发性胆汁性肝硬化患病率在逐年上升。目前国际上对PBC尚没有特殊有效的治疗方法,对早中期患者通常认为熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是最有效的药物。虽然熊脱氧胆酸可以明显改善胆汁淤积症状,但却不能阻断疾病进程,原发性胆汁性肝硬化发展到晚期只能通过肝移植来解决。由于原发性胆汁性肝硬化发病机理尚不完全清楚,因此,深入研究PBC发病机制和调控途径,找到其发病原因和重要调控靶点,不仅具有重要的学术价值,而且具有巨大的应用前景和社会效益。 PBC是一种典型的器官特异性自身免疫性疾病,国外流行病学调查发现,PBC患者的自身抗原为位于线粒体内膜的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶复合物(2-OADC),其中以丙酮酸脱氢酶复合体的E2亚基(pyruvate dehydrogenase copmlex–E2 subunit,PDC-E2)为主,大约90-95%PBC患者的血清中抗PDC-E2为阳性,PBC患者体内还可以检测到针对该抗原的细胞免疫反应异常。PBC的病因目前还不是十分清楚,遗传和环境等多种因素可能在PBC的发病中具有关键作用,分子模拟和外源化学物质可能参与PBC的发病,大肠杆菌某些组分和其他一些外源物质与自身抗原之间的分子模拟可能诱发自身免疫性疾病。越来越多的研究表明,T细胞在PBC发病中起关键性作用,但其具体调控机制还有待深入研究。最近,一类新的以分泌IL-17为主要特征而又不同于Th1和Th2的CD4+T细胞亚群Th17被发现,并被认为在机体的免疫炎症性疾病中起着重要的作用,特别是在自身免疫性疾病中起着重要的作用。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)动物模型中,发现过继输注Th17细胞比输注Th1细胞更能有效诱发EAE,注射IL-17也能加重EAE动物的症状和严重程度,而采用IL-17-/-缺陷小鼠则可以减弱疾病的进程。在一系列基因敲除小鼠中发现IL-23-/-缺陷小鼠中EAE受抑制,而IL-6-/-和TGF-βR-/-小鼠对EAE产生耐受,并且发现RORγt是Th17细胞发生过程中一个重要转录因子。本实验室前期的工作证明,PBC患者外周血中Th17细胞显著增多,单个核细胞IL-17mRNA水平和血清IL-17水平升高,提示Th17细胞在PBC的发病机制中具有重要的作用。微小RNA(microRNA,miRNA)为一类长度约为22-24个核苷酸(nt)、内源性的非编码RNA分子。它存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中,进化上高度保守。miRNA可通过调节mRNA半衰期(降解作用)或通过与3’UTR区的结合抑制靶基因翻译,从而对基因表达、细胞分化、生长发育等进行精细调控。研究显示在一些疾病中某些特定的miRNA与疾病的发生发展和预后转归密切相关。新近有研究发现细菌脂多糖(LPS)和病毒双链RNA均能诱导表达miR-155;而miR-155敲除小鼠抗感染能力低、肺组织发生疤痕样变化,与人类自身免疫病病情相似;进一步研究发现miR-155能负调控对T细胞功能特别重要的c-Maf基因。因此,某些特定的microRNA可能在T细胞功能调控中发挥重要作用,然而其具体作用机制尚待深入研究。本课题组前期经过microRNA芯片检测和聚类分析、northern blot和荧光定量PCR证实,PBC患者T细胞micro RNA谱发生显著变化。基于以上情况,我们提出了一些疑问,在变化的这些micro RNA中是否也有调控PBC自身免疫功能变化的?他们是通过何种机制影响免疫功能的?特别是是否对新发现的Th17细胞也有调控能力?调控的机制是怎样的?为了解决以上问题,我们进行了以下三部分研究:1、首先利用生物信息学手段,预测可能作用于IL-17基因并且在PBC中异常表达的micro RNA,进一步在T细胞系Jurkat细胞上验证其作用;2、诱导培养并纯化来源于PBC患者的Th17细胞;3、将候选的miRNA前体和抑制体转染入PBC患者来源Th17细胞,研究其对Th17细胞的调控作用及可能机制。第一部分利用生物信息学技术分析作于IL-17的microRNA 人们在研究micro RNA与靶基因相互作用的过程中发现,micro RNA和靶

关键词：原发性胆汁性肝硬化 micro RNA micro RNA-26a 白介素17

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不同时段睡眠剥夺对健康男性睡眠结构、血清皮质醇及认知功能影响的研究

不同时段睡眠剥夺对健康男性睡眠结构、血清皮质醇及认知功能影响...

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作者：吴惠涓第二军医大学

学位级别：硕士

目的:研究短期不同时段睡眠剥夺对健康青年男性睡眠结构、血清皮质醇及认知功能的影响,并探讨睡眠结构、皮质醇与认知功能之间的关系。方法:为交叉设计的自身前后对照性试验研究。选择10名健康男性(21.9±1.2岁)志愿者,随机进入上半夜... 详细信息

目的:研究短期不同时段睡眠剥夺对健康青年男性睡眠结构、血清皮质醇及认知功能的影响,并探讨睡眠结构、皮质醇与认知功能之间的关系。方法:为交叉设计的自身前后对照性试验研究。选择10名健康男性(21.9±1.2岁)志愿者,随机进入上半夜睡眠剥夺组或下半夜睡眠剥夺组。每组都进行连续7天研究,其中包括第1天的正常睡眠、第2～5天的睡眠剥夺和第6～7天的睡眠剥夺后恢复睡眠。在两组睡眠剥夺之间,进行7天正常睡眠洗脱期。总研究时间共计21天。睡眠剥夺方法:上半夜睡眠剥夺组在24h中允许睡眠的时间为3:00 a.m.-6:00 a.m.,下半夜睡眠剥夺组在24h中允许睡眠的时间为0:00 p.m.-3:00 a.m.。在每组睡眠剥夺期间进行7夜的多导睡眠图(PSG)监测,动态分析连续7夜睡眠进程及睡眠结构的变化。第2、3、4、5、6、7天7:00 a.m.抽空腹血,进行血清皮质醇的检测。第2、3、4、5、6、7天12:00 a.m.行焦虑状态-特质问卷、精神运动警觉性作业、快速击打键盘、单词记忆和单词识别测试。结果:(1)睡眠剥夺后随着剥夺时间的延长,出现NREM 2期睡眠百分比减少,NREM 3期睡眠百分比、NREM 4期睡眠百分比增加,REM睡眠百分比分化、REM睡眠潜伏期缩短(均为P<0.05)。SWS百分比、REM睡眠百分比和REM睡眠潜伏期在两种睡眠剥夺方式之间有差异(P<0.05)。所有这些变化在睡眠剥夺第4天达高峰。剥夺下半夜睡眠组REM睡眠百分比在恢复睡眠首夜出现反弹。在恢复睡眠第2夜的PSG中,各期睡眠百分比均接近剥夺前状态。(2)睡眠剥夺均导致血清皮质醇浓度的下降(P<0.05),睡眠剥夺4天后下降尤为明显(P<0.01),剥夺下半夜睡眠组皮质醇下降较剥夺上半夜睡眠组更为明显(P<0.05)。在恢复睡眠2夜后,皮质醇恢复至未剥夺前状态。(3)睡眠剥夺对认知行为学的影响:均导致记忆、操作能力、注意力的下降(P<0.05),剥夺上半夜睡眠组注意力下降更为明显(P<0.01)。在恢复睡眠2夜后,各认知功能恢复至未剥夺前状态。(4)睡眠剥夺均可使焦虑状态评分增加(P<0.05),随睡眠剥夺时间延长,焦虑状态渐加重,但两种剥夺方式之间没有差别意义。结论:无论是上半夜睡眠剥夺还是下半夜睡眠剥夺均对机体均产生不利的影响,随着剥夺时间的延长,受试者的各项认知行为学测试成绩下降,外周循环皮质醇分泌水平下降,焦虑状态分值增加,在恢复睡眠后慢波睡眠增加,这些变化在部分睡眠剥夺4天后达到高峰。横向比较上半夜睡眠剥夺和下半夜睡眠剥夺发现:剥夺上半夜睡眠对认知行为学的影响较大;剥夺下半夜睡眠对人体血清皮质醇的影响较大。短期的部分睡眠剥夺经恢复正常睡眠2天后,各项生理指标基本恢复至未剥夺前状态,提示短期睡眠剥夺对机体产生的影响是可逆性的。

关键词：睡眠剥夺多导睡眠图皮质醇认知功能

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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在原发性胆汁性肝硬化肝损伤中的作用研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在原发性胆汁性肝硬化肝损伤中的作...

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作者：梁艳第二军医大学

学位级别：硕士

本研究主要是探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在原发性胆汁性肝硬化肝损伤中的作用,从新的角度揭示原发性胆汁性肝硬化的病理机制。首先应用自行建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测了原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞TRAIL基因... 详细信息

本研究主要是探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在原发性胆汁性肝硬化肝损伤中的作用,从新的角度揭示原发性胆汁性肝硬化的病理机制。首先应用自行建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测了原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞TRAIL基因的表达;然后分别用流式细胞术及酶联免疫吸附术检测膜型及可溶型TRAIL蛋白,分析TRAIL与反映原发性胆汁性肝硬化严重程度的γ-谷氨酰转移酶和碱性磷酸酶的相关性。接着利用体外正常人肝细胞培养,与不同浓度的TRAIL蛋白和/或胆汁作用,在不同时间点,应用MTT法观察对细胞增殖能力的影响,PI染色法检测DNA含量及细胞周期,Annexin V/PI法检测早晚期凋亡细胞,荧光染色分析线粒体损伤,细胞免疫化学染色法检测bcl-2分子的表达情况。本研究发现原发性胆汁性肝硬化患者外周血TRAIL基因与蛋白表达均明显增高,这种异常表达与原发性胆汁性肝硬化的发生和严重程度密切相关。重组表达的人TRAIL蛋白对正常人肝细胞具有凋亡作用,且有浓度和时间依赖性;胆汁可以促进其凋亡作用。线粒体损伤及bcl-2分子表达降低可能参与TRAIL和/或胆汁诱导正常人肝细胞损伤的作用。

关键词：原发性胆汁性肝硬化肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应肿瘤坏死因子流式细胞术酶联免疫吸附术细胞增殖细胞周期凋亡线粒体

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β-arrestin 2在原发性胆汁性肝硬化中的分子调控机制研究

β-arrestin 2在原发性胆汁性肝硬化中的分子调控机制研究

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作者：吴传勇第二军医大学

学位级别：硕士

本课题旨在研究β-arrestin 2对原发性胆汁性肝硬化(PBC)中自身免疫反应以及自身免疫相关基因的调节作用,阐明β-arrestin 2在PBC疾病进程中的分子调控机制,为探讨有效治疗PBC的新途径提供依据。首先采用实时荧光定量PCR和Western-blott... 详细信息

本课题旨在研究β-arrestin 2对原发性胆汁性肝硬化(PBC)中自身免疫反应以及自身免疫相关基因的调节作用,阐明β-arrestin 2在PBC疾病进程中的分子调控机制,为探讨有效治疗PBC的新途径提供依据。首先采用实时荧光定量PCR和Western-blotting技术,分别从基因转录和蛋白表达水平分析β-arrestin 2在PBC患者外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达;再通过注射poly I:C,在β-arrestin 2转基因和β-arrestin 2基因敲除鼠中建立PBC动物模型,确认β-arrestin 2在PBC发病中的作用;然后培养来源于PBC患者PBMCs的PDC-E2特异性自身反应性细胞毒性T细胞( CTLs ),并通过转染pcDNA3/β-arrestin 2质粒和pBS/U6/β-arrestin 2siRNA质粒,研究β-arrestin 2对细胞增殖反应、细胞毒活性、AICD和自身免疫相关基因TNFSF8、CCL2等表达及其启动子区域组蛋白乙酰化的影响,探讨β-arrestin 2对PDC-E2特异性自身反应性CTLs的调控作用。结果表明,β-arrestin 2在PBC患者PBMCs,尤其是CD4+T、CD8+T和单核细胞中的表达明显降低;β-arrestin 2能够抑制polyI:C诱导PBC样病变的产生;在来源于PBC患者PBMCs的PDC-E2特异性自身反应性CTLs中,β-arrestin 2能够负调节细胞的增殖反应、细胞毒活性和AICD,并通过调节启动子区域组蛋白H4的乙酰化水平进而对TNFSF8、CCL2等自身免疫相关基因的表达进行调控。因此,β-arrestin 2在PBC疾病进程中可能起负调节作用,并通过负调节自身免疫相关基因启动子区域组蛋白H4的乙酰化水平,进而影响PBC疾病进程。

关键词：原发性胆汁性肝硬化 β-arrestin 2 自身免疫自身反应性细胞毒性T细胞动物模型细胞增殖细胞毒活性活化诱导的细胞凋亡组蛋白乙酰化染色质免疫沉淀

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Toll样受体在多发性骨髓瘤患者的表达研究

Toll样受体在多发性骨髓瘤患者的表达研究

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作者：曹伟娟第二军医大学

学位级别：硕士

本研究主要探讨Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)在外周血白细胞上的表达及其在多发性骨髓瘤中的意义。首先,应用自行建立的实时荧光定量PCR法检测了外周血细胞上TLRs基因的表达,然后采用流式细胞术检测多发性骨髓瘤患者及健康对照... 详细信息

本研究主要探讨Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)在外周血白细胞上的表达及其在多发性骨髓瘤中的意义。首先,应用自行建立的实时荧光定量PCR法检测了外周血细胞上TLRs基因的表达,然后采用流式细胞术检测多发性骨髓瘤患者及健康对照者外周血淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞TLRs的表达,并检测了多发性骨髓瘤患者血浆中Ig浓度。本研究发现TLR1、TLR2、TLR4、TLR6基因在删患者PBMC表达水平明显降低,且基因表达与删分型无关,而TLR5基因表达水平与正常对照组比较降低,但差异无统计学意义:TLR1、TLR2、TLR4、TLR6蛋白在外周血淋巴细胞和中性粒细胞的表达率较低,而在单核细胞的阳性表达率多发性骨髓瘤患者组显著低于健康对照组,而且阳性率高低与MM分型无关。

关键词：多发性骨髓瘤 Toll样受体流式细胞术实时荧光定量PCR

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人颗粒溶素的克隆表达、抗体制备及其临床应用

人颗粒溶素的克隆表达、抗体制备及其临床应用

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作者：钱（王争）第二军医大学

学位级别：硕士

为了获得具有生物活性的GNLY蛋白质,并探讨其与某些临床疾病的相关性,本研究构建了重组原核表达质粒pE728a(+)-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达出GNLY蛋白,并获得纯化的GNLY;经Westen blot证实GNLY具有免疫原性;MTT鉴定GNLY具有杀伤肿瘤细胞... 详细信息

为了获得具有生物活性的GNLY蛋白质,并探讨其与某些临床疾病的相关性,本研究构建了重组原核表达质粒pE728a(+)-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达出GNLY蛋白,并获得纯化的GNLY;经Westen blot证实GNLY具有免疫原性;MTT鉴定GNLY具有杀伤肿瘤细胞的生物学活性。用GNLY免疫兔制备了高效价的抗人GNLY多克隆抗体;以初步建立的ELISA方法定量检测人血清中GNLY含量;结果表明原发性肝癌患者组的GNLY血清水平低于正常对照组(P<0.05),乙肝病毒感染急性期患者组的GNLY血清水平显著高于正常对照组(P<0.01)。以建立的实时荧光定量PCR方法对人PBMC中GNLY的mRNA表达水平进行定量检测,结果表明原发性肝癌患者组PBMC中GNLY的mRNA水平低于正常对照组(P<0.05),乙肝病毒感染急性期患者组PBMC中GNLY的mRNA水平显著高于正常对照组(P<0.01)。

关键词：颗粒溶素基因外周血单个核细胞发酵酶联免疫吸附实验乙型肝炎病毒原发性肝癌荧光定量反转录-聚合酶链反应

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自身免疫抗体噬菌体库的构建及初步鉴定

自身免疫抗体噬菌体库的构建及初步鉴定

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作者：吴炜霖第二军医大学

学位级别：硕士

研究目的: 自身免疫性疾病(autoimmune diseases, AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损伤所引起的疾病,是一类较常见的难治病。其突出特点是患者体内产生高滴度自身抗体,并通过免疫复合物等途径,产生针对自身组织的免... 详细信息

研究目的: 自身免疫性疾病(autoimmune diseases, AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损伤所引起的疾病,是一类较常见的难治病。其突出特点是患者体内产生高滴度自身抗体,并通过免疫复合物等途径,产生针对自身组织的免疫病理性损伤,累及一个或全身多个器官、系统。自身免疫病发病机制十分复杂,涉及因素众多。一般认为以免疫活性细胞数量和功能的失常,导致免疫功能紊乱,从而产生大量自身抗体为主要机制,但具体机制并不明确。因而自身抗体的研究往往成为对自身免疫性疾病研究的关键点和切入点。目前,自身免疫病的诊断手段非常有限,主要是在结合临床的基础上,依赖实验室检查,在AID患者体内检测到一种或多种高效价的自身抗体为诊断该病的重要依据。自身免疫病缺乏特异的早期诊断指标及特效的治疗药物,这都直接影响了疾病的诊断和治疗。因此,获得纯化的可以满足不同需要的高亲和力、高特异性自身抗体对于研究自身免疫性疾病的发病机制及临床诊疗都具有非常重要的价值。抗体的制备工艺历经100多年的发展,经历了从多克隆抗体、单克隆抗体到人源化抗体的不同阶段。在人源单克隆抗体的制备技术中,噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体制备技术之一。利用此技术,外源蛋白或多肽的基因与噬菌体外壳蛋白的基因融合,外源产物表达在噬菌体的表面,从而实现了基因型与表现型的完美统一。目前,国内外已成功构建了针对乙肝病毒、肿瘤细胞等多种抗原的噬菌体抗体库,并从中筛选得到具有较高亲和力和特异性的抗体,潜藏着巨大的应用价值。本课题采用噬菌体抗体库技术,以50多例自身免疫病患者的外周血淋巴细胞为原料,构建出自身免疫性疾病的噬菌体抗体库,并以确定的自身抗原dsDNA作为固相抗原,从抗体库中筛选、富集出相关抗体,以鉴定所构建抗体库的有效性,为进一步利用该抗体库筛选出不同需要的抗体及其功能研究提供平台。研究方法: 1.从55名自身免疫性疾病患者(包括SLE、RA、强直性脊柱炎、干燥综合征、PBC等)外周血中分离出单个核细胞,抽提总RNA,反转录生成cDNA,以内参GADPH验证混合cDNA的质量;2.以上述cDNA为模板PCR扩增轻链和重链基因;3.挑取XL1-Blue的单克隆菌落,采用Hepes法制备感受态细胞;4.将轻链基因克隆入pComb3Hss载体以构建轻链库;5.将重链基因载入重组轻链库,构建组合文库H+L+pComb3Hss;6.将组合文库转化大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体M13KO7,随机的组合文库表达于噬菌体表面,完成噬菌体表面展示;7.用商品化anti-dsDNA ELISA试剂盒,对噬菌体抗体进行4轮亲和富集,测定抗体库滴度;8.间接ELISA法鉴定4轮淘选后的噬菌体抗体,提取阳性克隆的的噬菌粒,切除gIII片段,自连接后转化XL1-Blue,以IPTG诱导可溶性Fab片段的表达;9.分别用anti-dsDNA和anti-U1RNP检测试剂盒对制备好的Fab片段进行ELISA检测,鉴定其抗原特异性。结果: 1.抽取总RNA 7-10ug,抽提的RNA质量可靠,经GADPH验证的cDNA质量可靠;2. PCR扩增了大小为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了重组轻链库,菌落计数得轻链库的库容约4×105,酶切鉴定重组率为80%;3.同法测得噬菌体抗体库的库容为6×106,酶切鉴定重组率为70%,PCR鉴定证明轻重链均已转入,噬菌体抗体库构建成功;4.用抗原固相法对噬菌体抗体库进行了4轮亲和富集,第1轮洗脱的滴度为1.1×105,第2、3轮都较前有较大提高,第4轮产出率比第1轮加了218倍;5.通过固相化抗原吸附法筛选获得2个阳性克隆,切除gIII基因,实现了可溶性Fab片段的表达;6.间接ELISA法检测显示6株Fab片段克隆均呈dsDNA阳性,U1RNP阴性,证实获得的可溶性抗体Fab片段具有特异性抗原结合活性。结论: 利用自身免疫性疾病患者的外周血单个核细胞制备了混合cDNA,并在此基础上成功构建了自身免疫性疾病的噬菌体抗体库,经亲和富集后实现了抗体Fab段的可溶性表达,并具有较强的抗原特异性,因此该抗体库的建立为进一步筛选出其他高亲和力的自身抗体及其功能研究打下了基础,提供了良好的库源。

关键词：自身免疫性疾病噬菌体抗体库构建鉴定亲和富集 ELISA

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醛酮还原酶家族1的C1亚型在胆管癌发生发展中作用及机制

醛酮还原酶家族1的C1亚型在胆管癌发生发展中作用及机制

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作者：刘畅第二军医大学

学位级别：硕士

研究目的近年来,关于肿瘤代谢相关蛋白的研究越来越多,通过研究发现,这些代谢酶与肿瘤的发生、发展、复发及转移相关,且许多代谢蛋白已用作肿瘤诊断的标记物及治疗的靶点。消化系肿瘤胆管癌是指源于主要肝管和肝外胆管的癌,约占肿瘤发... 详细信息

研究目的近年来,关于肿瘤代谢相关蛋白的研究越来越多,通过研究发现,这些代谢酶与肿瘤的发生、发展、复发及转移相关,且许多代谢蛋白已用作肿瘤诊断的标记物及治疗的靶点。消化系肿瘤胆管癌是指源于主要肝管和肝外胆管的癌,约占肿瘤发生率的3%。目前,胆管癌的研究已成为热门,虽然有很多学说来解释说明其发病机制,但都并不全面和清楚,所以,继续深入研究胆管癌的发生机制,有可能为胆管癌的发生、发展、复发及转移提供新思路,为非手术治疗提供新的突破口。醛酮还原酶(Aldo-keto reductases AKRs)是参与氧化还原反应的三大酶类超家族之一,广泛地分布于原核生物和真核生物。AKRs以烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(triphosphopyridine nucleotide NADPH)为辅酶,参与氧化还原反应。本文旨在研究AKR1C1(Aldo-keto reductase family 1 member C1)在胆管癌中的表达,并初步探讨其在胆管癌发生、发展及转移中的作用。研究方法采用消化系肿瘤组织芯片和免疫组化分析方法,检测不同肿瘤患者癌组织及癌旁正常组织AKR1C1的表达;实时荧光定量PCR检测各肿瘤细胞株AKR1C1的表达,蛋白免疫印迹western blot检测各肿瘤细胞株及10例胆管癌病人肿瘤组织、癌旁正常组织AKR1C1的表达;在胆管癌细胞株QBC939中感染沉默AKR1C1的病毒质粒及空质粒,CCK-8(Cell Counting Kit-8)比色法检测各实验组细胞增殖。划痕实验和transwell检测各实验组细胞的迁移情况;流式细胞术技术检测各实验组QBC939细胞的周期阻滞和凋亡情况;RT-PCR和Western-blot方法分别检测各实验组QBC939细胞survivin、Bcl-2、Bax、caspase-3、β-catenin和E-cadherin的m RNA和蛋白表达情况。结果:肿瘤组织芯片和免疫组化结果显示,与正常组织相比,胆管癌组织中AKR1C1呈高表达;western blot验证10例胆管癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织AKR1C1表达,确定在AKR1C1在肿瘤组织中呈高表达;实时荧光定量PCR和western blot检测发现胆管癌细胞株QBC939高表达AKR1C1;CCK-8比色法检测感染沉默AKR1C1的病毒质粒组与空质粒对照组细胞增,沉默组细胞的增殖受到明显抑制,差异有统计学意义(p<0.05);流式细胞术技术检测结果显示,感染沉默AKR1C1的病毒质粒组出现细胞周期阻滞,凋亡增加;同时,RT-PCR和Western-blot方法分别检测各实验组QBC939细胞survivin、Bcl-2、Bax、caspase-3、β-catenin和E-cadherin的m RNA和蛋白表达发现,survivin、caspase-3和E-cadherin变化有统计学意义。证明了AKR1C1与胆管癌的发生、发展及转移有关,但具体通路仍然不能解释清楚,需要后续实验继续研究验证。结论:AKR1C1在胆管肿瘤组织与肝外胆管癌细胞株QBC939中高表达,其与胆管癌细胞的发生、发展及转移均相关,可能是其参与或间接参与了癌细胞的生长周期、凋亡及转移相关途径,为胆管癌的相关研究提供了新的思路和方向。

关键词： AKR1C1 QBC939细胞增殖细胞周期凋亡

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B淋巴细胞活化因子特异的适体进化及功能研究

B淋巴细胞活化因子特异的适体进化及功能研究

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作者：曾贤铭第二军医大学

学位级别：硕士

本研究目的是进化筛选与B淋巴细胞活化因子特异结合的单链DNA适体并鉴定其结合力。应用指数方式富集的配体系统进化(SELEX)技术,将随机寡核苷酸文库与B淋巴细胞活化因子相互作用,分离出结合的寡核苷酸配体,优化对称和非对称PCR实验条件... 详细信息

本研究目的是进化筛选与B淋巴细胞活化因子特异结合的单链DNA适体并鉴定其结合力。应用指数方式富集的配体系统进化(SELEX)技术,将随机寡核苷酸文库与B淋巴细胞活化因子相互作用,分离出结合的寡核苷酸配体,优化对称和非对称PCR实验条件,成功进行了13轮次进化筛选,并将进化产物克隆,随机选取42个阳性克隆测序,对测得的41序列根据同源性分为6类不同序列,应用斑点印迹法证实6类序列均与B淋巴细胞活化因子相结合;酶联法比较各适体序列对B淋巴细胞活化因子的相对结合力,对光密度值进行统计学分析,以序列44光密度值0.752最高(p<0.05),具有对B淋巴细胞活化因子相对最高结合力。本研究首次成功获得特异结合B淋巴细胞活化因子的单链DNA适体,为研发自身免疫病和肿瘤诊治新药物奠定了基础。

关键词： B淋巴细胞活化因子适体指数富集配体进化技术对称PCR 非对称PCR 自身免疫病

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