检索结果-南通市图书馆

作者：任莉琼江南大学

学位级别：硕士

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,EC.3.1.20)又叫α-D-葡萄糖苷水解酶,可从寡糖底物非还原端切开α-1,4糖苷键,将释放的葡萄糖单元以α-1,6键转移到麦芽三糖、麦芽糖或葡萄糖等分子上,获得异麦芽三糖、潘糖、异麦芽糖等低聚糖产物。它存... 详细信息

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,EC.3.1.20)又叫α-D-葡萄糖苷水解酶,可从寡糖底物非还原端切开α-1,4糖苷键,将释放的葡萄糖单元以α-1,6键转移到麦芽三糖、麦芽糖或葡萄糖等分子上,获得异麦芽三糖、潘糖、异麦芽糖等低聚糖产物。它存在于自然界中,种类繁多,性质各异。目前,α-葡萄糖苷酶已广泛应用于低聚异麦芽糖生产、代谢生理研究、疾病预防治疗等各个领域。本研究从数据库中筛选获得转苷能力强而水解能力弱的构巢曲霉(Aspergillus nidulans,***)α-葡萄糖苷酶。将***来源α-葡萄糖苷酶基因AgdB连接到表达载体pPIC9K上,于Pichia pastoris KM71中表达,同时共表达N-乙酰转移酶,对重组菌株在3.6 L发酵罐中的发酵进行优化,并研究重组α-葡萄糖苷酶的酶学性质及其在合成低聚异麦芽糖和提高焦糊精中抗性含量的应用工艺。主要研究结果如下:(1)针对数据库中α-葡萄糖苷酶的转苷和水解能力特性,比较不同α-葡萄糖苷酶的遗传进化分类特性和三维结构特征结合文献报道,预测***来源的α-葡萄糖苷酶(氨基酸序列GenBank:BAB39856.1)可能具有较强的转苷能力和较弱的水解能力的特点。根据NCBI已报道***α-葡萄糖苷酶基因进行密码子优化后合成目的基因AgdB,并构建重组质粒pPIC9K-AgdB,整合到*** KM71中成功表达。(2)为提高目的蛋白的表达量和酶活,共表达N-乙酰转移酶Mpr1,以构建重组菌株*** KM71/pPIC9K–AgdB/pPICZ A–Mpr1,将该重组菌进行摇瓶诱导发酵,酶活达到22.56 U?mL,是未共表达Mpr1菌株的1.92倍。对该菌株进行3.6 L罐发酵培养条件优化,结果表明:当诱导温度25°C,诱导阶段甲醇浓度为1%时,酶活最高达到128.12U?mL,是摇瓶酶活的5.68倍。(3)对重组α-葡萄糖苷酶进行蛋白分离纯化以及酶学性质分析。研究结果表明,重组α-葡萄糖苷酶最适反应pH为5.5,最适反应温度为45°C,该重组酶在pH 3.5-8.0较稳定,在50°C下半衰期为24 h。重组***α-葡萄糖苷酶对麦芽糖和麦芽三糖转苷动力学参数K值分别为1.78 mM和2.09 mM,其对麦芽糖、麦芽三糖亲和力分别是黑曲霉(Aspergillus niger,***)α-葡萄糖苷酶的10.42和1.56倍。重组***α-葡萄糖苷酶对麦芽糖、麦芽三糖的水解动力学参数K为2.91 mM和5.39 mM,***α-葡萄糖苷酶对麦芽糖、麦芽三糖水解亲和力是***α-葡萄糖苷酶的5.49和7.19倍,结果表明***α-葡萄糖苷酶具有转苷能力强而水解能力弱的特点。(4)优化***α-葡萄糖苷酶制备低聚异麦芽糖的工艺。以30%麦芽糖为底物制备低聚异麦芽糖的最优条件为:pH 5.5,45°C,α-葡萄糖苷酶加酶量为5.1 U·g麦芽糖,低聚异麦芽糖产量能达到最大值216.36 g·L,转化率为72.12%,是目前报道的以麦芽糖为底物合成低聚异麦芽糖的最高水平。以焦糊精为底物提高抗性含量的工艺进行优化,优化后的条件为:pH 5.5,45°C,加酶量2.75 U·g焦糊精,反应6 h后可以使焦糊精中抗性含量由44.10%提高至63.10%。对Thermuobifida fusca来源的分支酶(TfSBE)、Bacillus stearothermophilus来源的环糊精转移酶(CGTase)和重组α-葡萄糖苷酶复配进一步提高焦糊精抗性含量的工艺进行研究,优化后条件为:在20%(w·v)焦糊精底物浓度下,首先反应条件调控在40°C,pH 6.5,TfSBE加酶量1500 U·g焦糊精,反应12小时后,重新调整pH至5.5,同时加入5 U·g焦糊精的α-葡萄糖苷酶和CGTase,在45°C下反应12 h,焦糊精的抗性含量由原先的44.10%提高至70.44%。

关键词：构巢曲霉 α-葡萄糖苷酶表达发酵优化低聚异麦芽糖抗性糊精

基于DSP的TCR型动态无功补偿装置控制器的研究与设计

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基于DSP的TCR型动态无功补偿装置控制器的研究与设计

作者：唐巍东南大学

学位级别：硕士

电弧炉、电焊机等冲击性负荷大量接入电网严重影响电网供电质量。本文研究并设计了基于DSP的TCR型动态无功补偿装置控制器,抑制快速波动性负荷造成的电压波动和闪变,改善负荷不平衡状况。本文基于不平衡负荷的平衡化原理(即Steinmetz原... 详细信息

电弧炉、电焊机等冲击性负荷大量接入电网严重影响电网供电质量。本文研究并设计了基于DSP的TCR型动态无功补偿装置控制器,抑制快速波动性负荷造成的电压波动和闪变,改善负荷不平衡状况。本文基于不平衡负荷的平衡化原理(即Steinmetz原理)的补偿导纳模型,采用负荷电流电压瞬时值采样的方法补偿无功功率,并将该方法应用于SVC样机的设计,结果表明,它们是快速有效和准确的,具有实际的工程应用价值。TCR型动态无功补偿装置中触发控制角的计算精度直接影响无功补偿的效果。作者提出并实现了有理插值法作为晶闸管触发控制角的计算方法,通过仿真表明该方法与多项式逼近相比,计算量相当,但精度大大提高。本文利用MATLAB中的simulink建立了TCR的单相和三相模型,分析晶闸管控制角、触发脉冲与基波电流的关系。本文设计的控制器以TMS320F2812 DSP芯片为核心,加上检测电路(包括采样电路、调理电路、锁相环等)和其它外围控制和驱动电路构成。利用电焊机与电弧炉相似的用电特性,以电焊机为负载,开发一套低压TCR-SVC样机,设计完整的软、硬件系统,并校验其性能。

关键词：动态无功补偿 TCR 无功电流检测有理插值 DSP

Trichoderma viride β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达、发酵优化及应用研究

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Trichoderma viride β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达、发酵优化...

作者：汪飞江南大学

学位级别：硕士

低聚龙胆糖是葡萄糖单元通过β-1,6糖苷键连接而组成的功能性低聚糖,它是一种混合物,以龙胆二糖为主同时含有少量的龙胆三糖和龙胆四糖。低聚龙胆糖有着众多优良的生理功能,低热、低甜、低水活性,不能被人体的消化酶所降解。目前,被广... 详细信息

低聚龙胆糖是葡萄糖单元通过β-1,6糖苷键连接而组成的功能性低聚糖,它是一种混合物,以龙胆二糖为主同时含有少量的龙胆三糖和龙胆四糖。低聚龙胆糖有着众多优良的生理功能,低热、低甜、低水活性,不能被人体的消化酶所降解。目前,被广泛的应用到巧克力、冰淇凌、咖啡、调味品、烘烤食品、饮料等产品当中。本研究将Trichoderma viride来源的β-葡糖糖苷酶基因bgl1连接到表达载体pPIC9K上,在Pichia pastoris KM71中表达,同时共表达二硫键异构酶pdi,成功地获得了能够高效分泌表达β-葡糖糖苷酶的重组Pichia pastoris菌株,并将其在3.6 L发酵罐中进行发酵优化。研究了重组β-葡糖糖苷酶的酶学性质,并优化了利用重组β-葡糖糖苷酶的转苷和逆水解活性来合成低聚龙胆糖的工艺条件。主要研究结果如下:(1)采用重叠PCR的方法从Trichoderma viride中获得β-葡萄糖苷酶的目的基因bgll,构建重组质粒pPIC9K-bgl1,整合到Pichia pastoris KM71中。为了帮助二硫键的形成从而提高蛋白折叠效率,共表达二硫键异构酶pdi,获得重组*** KM71/pPIC9K-bgl1/pPICZA-pdi菌株,将该重组菌进行摇瓶诱导发酵,酶活达到143U·mL-1,是未共表达pdi菌株的1.7倍。(2)对重组菌*** KM71/pPIC9K-bgl1/pPICZ A-pdi所产的β-葡萄糖苷酶进行蛋白分离纯化以及酶学性质分析。研究结果表明,重组β-葡萄糖苷酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为60 ℃,在该条件下重组酶的半衰期为6 h。重组β-葡萄糖苷酶对ρNPG的 Km、kcat 以及kcat/Km 分别为 0.19mM、516.0s-1、2.70×106M-1·s-1,比活为 610 U·mg-1;对纤维二糖的 Km、kcat以及 kcat/Km分别为 0.38 mM、23.0 s-1、6.1×104M-1·s-1;对龙胆二糖的Km、kcat以及kcat/Km分别为0.61 mM、15.0 s-1、2.5×104 M-1·s-1。表明该重组β-葡萄糖苷酶对上述三种底物的亲和力由大到小依次为ρNPG、纤维二糖、龙胆二糖。(3)对重组菌*** KM71/pPIC9K-bgl1/pPICZ A-pdi 3.6 L罐发酵培养条件进行优化,结果表明:当诱导温度28 ℃,初始诱导菌体浓度OD600为150,诱导阶段甲醇浓度为1%时,酶活最高,达到1452 U·mL-1,是摇瓶水平的10.2倍,是目前报导的Trichoderma viride β-葡萄糖苷酶表达最高水平的23.4倍。(4)对重组β-葡萄糖苷酶酶转化制备低聚龙胆糖的工艺条件进行了优化。以葡萄糖为底物利用β-葡萄糖苷酶的逆水解活性合成低聚龙胆糖的最优条件为:在pH 5.0,60 ℃,β-葡萄糖苷酶加酶量为900 U·g-1葡萄糖,底物葡萄糖浓度为800 g·L-1时,低聚龙胆糖产量能达到最大值130 g·L-1,转化率为16.25%。以葡萄糖和纤维二糖为底物利用β-葡萄糖苷酶的转苷活性合成低聚龙胆糖的最优条件为:在pH 5.0,60 ℃,底物摩尔比为1:1,β-葡萄糖苷酶加酶量为400 U·g-1纤维二糖,底物浓度为200 g·L-1葡萄糖、400 g·L-1纤维二糖时,低聚龙胆糖的产量能达到116 g·L-1,转化率为19.4%。

关键词：绿色木霉 β-葡萄糖苷酶低聚龙胆糖毕赤酵母发酵优化酶转化

Thermococcus sp.B1001来源环糊精酶重组表达、性能表征及发酵优化

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Thermococcus sp.B1001来源环糊精酶重组表达、性能表征及发酵优化

作者：武权江南大学

学位级别：硕士

麦芽七糖(Maltoheptaose)是由7个葡萄糖基通过α-1,4糖苷键连接而成的直链麦芽寡糖,与麦芽三糖、四糖相比,具有更低渗透压,更高黏度,更好保湿作用,更强成膜性能。此外,麦芽七糖还具有包埋小分子功能,可广泛用于食品、医药、化妆品等领... 详细信息

麦芽七糖(Maltoheptaose)是由7个葡萄糖基通过α-1,4糖苷键连接而成的直链麦芽寡糖,与麦芽三糖、四糖相比,具有更低渗透压,更高黏度,更好保湿作用,更强成膜性能。此外,麦芽七糖还具有包埋小分子功能,可广泛用于食品、医药、化妆品等领域。酶法制备麦芽七糖具有反应条件温和、绿色环保等优点,逐渐成为研究热点。环糊精酶可水解β-环糊精中α-1,4糖苷键,使β-环糊精发生开环反应,从而特异性生成麦芽七糖。本研究通过序列比对分析和蛋白质同源建模,挖掘两种环糊精酶基因在大肠杆菌中进行重组表达及酶学性质研究,并对制备麦芽七糖性能进行表征和条件优化。然后,选取Thermococcus sp.B1001来源的环糊精酶基因tscd在枯草芽孢杆菌中重组表达、纯化和制备麦芽七糖。最后对重组枯草芽孢杆菌摇瓶优化和3-L罐发酵。主要研究结果如下:(1)环糊精酶的基因挖掘、重组表达及酶学性质研究:通过序列分析及不同特异性的环糊精酶特征分析,发现高特异性环糊精酶在序列结构上比一般环糊精酶多一段N’结构域,该区域与酶分子构成完整催化结合凹槽,不需要通过寡聚化就能结合催化环糊精水解,此外,N’结构域限制了淀粉等长链分子的结合,使得环糊精酶对环糊精的水解专一性提高。选取了具有N’结构域的Thermococcus sp.B1001和Thermococcus litoralis来源环糊精酶基因在大肠杆菌中克隆表达,热处理和镍柱纯化后纯酶比活分别为1208.04 U·mg和409.06 U·mg,最适温度均为为90℃,最适pH分别为5.5和6.0,在90℃下的半衰期分别为120 min和60 min,在pH 8.0和6.5条件下稳定性最好。在α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、可溶性淀粉和普鲁兰多糖5种底物中,两种酶TsCDase和TlCDase对环糊精都有很好的特异性,最适底物分别为β-环糊精和γ-环糊精,而对可溶性淀粉和普鲁兰多糖均没有水解活力。(2)TsCDase制备麦芽七糖性能表征和条件优化:通过加酶量,反应时间,初始pH,底物浓度等优化,确定最适酶转化条件:以80 g·Lβ-环糊精为底物,反应温度为90℃,反应pH为5.5-6.0,Ts CDase加酶量为25 U·g底物,反应时间为4 h时,麦芽七糖得率为81.19%和85.95%,七糖占产物麦芽寡糖的比例为95.24%和92.92%。(3)环糊精酶基因tscd在枯草芽孢杆菌中重组表达、纯化与应用:构建了重组菌*** WS9/pUB110-tscd,摇瓶发酵24 h后测得胞内酶活为5.9 U·m L,SDS-PAGE结果显示在大于66 kDa处有对应条带,表明来源于环糊精酶基因tscd在枯草芽孢杆菌中成功表达。环糊精酶纯化后的比活为637.95 U·mg,低于大肠杆菌表达的环糊精酶。以80 g·Lβ-环糊精,反应温度为90℃,反应pH为5.5,加酶量为25 U·g底物,反应4 h时,麦芽七糖得率为82.33%,七糖占产物麦芽寡糖比例为94.55%,与大肠杆菌的酶转化结果基本一致。(4)重组枯草芽孢杆菌发酵条件优化:摇瓶优化后最优培养基为安琪玉米浆10 g·L,酵母浸膏10 g·L,甘油5 g·L,Mg1 mmol·L,KHPO·3HO 16.43 g·L,KHPO 2.31g·L,该条件下重组酶活力达到13.93 U·mL。以摇瓶优化结果为基础,重组菌3-L发酵罐产酶,当补料培养基中的碳源为400 g·L葡萄糖,氮源为50 g·L安琪玉米浆和50g·L酵母浸膏,发酵70 h后,酶活达到最高,即总酶活为481.75 U·m L,胞内酶活为390.83 U·mL,胞外酶活为90.92 U·m L,约为摇瓶优化结果的34.58倍。

关键词：环糊精酶麦芽七糖枯草芽孢杆菌发酵优化

普鲁兰酶的重组表达、发酵优化及其在海藻糖制备中的应用

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普鲁兰酶的重组表达、发酵优化及其在海藻糖制备中的应用

作者：杨向会江南大学

学位级别：硕士

普鲁兰酶是一种脱支酶,能够专一性切割淀粉、普鲁兰多糖等聚合物中的α-1,6糖苷键。普鲁兰酶在淀粉加工工业中可提高底物利用率,降低产品成本。实验室前期研究中以淀粉为底物,使用Arthrobacter ramosus S34来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶... 详细信息

普鲁兰酶是一种脱支酶,能够专一性切割淀粉、普鲁兰多糖等聚合物中的α-1,6糖苷键。普鲁兰酶在淀粉加工工业中可提高底物利用率,降低产品成本。实验室前期研究中以淀粉为底物,使用Arthrobacter ramosus S34来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)制备海藻糖,由于该两种酶都不能水解底物中的a-1,6糖苷键,因此加入性质与这两种酶吻合(温度45℃,pH 5.5)的普鲁兰酶能够大幅度提高底物的利用率和海藻糖的转化率。嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶(BapulA)和长野芽孢杆菌普鲁兰酶(BnpulB)和上述两种酶性质相符,可用于海藻糖的制备。本研究将普鲁兰酶BapulA和BnpulB,分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达,并优化重组菌的发酵条件以及海藻糖酶转化过程中的影响因素。主要研究结果如下:(1)将嗜酸芽胞杆菌普鲁兰酶基因密码子优化后人工合成,得到重组质粒pET-20b(+)-BapulA。将该质粒转化大肠杆菌,构建重组菌*** BL21(DE3)/pET-20b(+)-BapulA;在摇瓶中进行发酵,最高酶活达到 201.0 U·mL-1。在 3L发酵罐水平进行发酵条件的优化,结果表明,重组菌***21(DE3)/pET-20b(+)-BapulA在生长阶段的最适温度和pH分别是30℃和7.0,最佳诱导时间点是菌体OD600为50,诱导阶段的最适温度和pH分别是25℃和6.2,乳糖的诱导流速为0.4 g·L-1·h-1;在OD600分别达到15,45和75时,加入1.5 g·L-1的甘氨酸,OD600达到105时加入3 g·L-1的甘氨酸,最高酶活达到 1910.1 U·mL-1。(2)构建重组质粒 pHY300PLK-BapulA,并转化宿主菌 *** CCTCCM 2016536,得到重组菌*** CCTCCM2016536/pHY300PLK-BapulA。将该菌株进行摇瓶发酵,发酵液上清的酶活为0.8 ***-1。对重组菌的培养条件进行优化,摇瓶最高酶活达到23.4 U·mL-1,相比优化前提高28倍。(3)将长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因密码子优化后人工合成,得到重组质粒pET-22b(+)-BnpulB。将该质粒转化大肠杆菌,构建重组菌***21(DE3)/pET-22b(+)-BnpuB;在摇瓶中进行发酵,最高酶活达到568.5 U·mL-1。(4)构建重组质粒 pHY300PLK-BnpulB,并转化宿主菌 *** CCTCCM2016536,获得重组菌*** CCTCC M 2016536/pHY300PLK-BnpulB,并进行摇瓶发酵,发酵液上清的酶活为80.4U·mL-1。在摇瓶中优化了发酵培养基的碳源和氮源的种类,最佳碳源是葡萄糖,最佳复合氮源为酵母浸粉与磷酸二氢铵(NH4H2PO4)。进而在3 L发酵罐水平优化补料培养基,当400g·L-1葡萄糖为碳源,100g·L-1酵母浸粉为唯一氮源时,酶活最高为2361.1 U·mL-1,是摇瓶酶活的29倍。(5)以淀粉为初始底物,分别添加两种普鲁兰酶(BapulA和BnpulB)与麦芽糖基海藻糖合成酶和水解酶复配反应生成海藻糖,考察了酶转化过程中温度、初始pH、底物浓度以及普鲁兰酶加酶量等条件对转化率的影响,最佳反应温度是45℃,最佳初始pH为6.0,最适底物浓度为15%,BapulA最优加酶量是15U g-1淀粉,底物转化率为66.7%;BnpulB最优加酶量是2 U·g-1淀粉,底物转化率为67.9%。

关键词：普鲁兰酶重组表达发酵优化海藻糖

Pantoea dispersa蔗糖异构酶的重组表达及应用研究

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Pantoea dispersa蔗糖异构酶的重组表达及应用研究

作者：刘军彤江南大学

学位级别：硕士

蔗糖异构酶(EC 5.***.99.11),能够将底物蔗糖转化成其同分异构体异麦芽酮糖和海藻酮糖。已报道的大部分蔗糖异构酶酶反应的主产物为异麦芽酮糖。由于异麦芽酮糖具有甜度较高、易溶于水、预防糖尿病及不致龃齿等性质,因此适用于儿童及糖尿... 详细信息

蔗糖异构酶(EC 5.***.99.11),能够将底物蔗糖转化成其同分异构体异麦芽酮糖和海藻酮糖。已报道的大部分蔗糖异构酶酶反应的主产物为异麦芽酮糖。由于异麦芽酮糖具有甜度较高、易溶于水、预防糖尿病及不致龃齿等性质,因此适用于儿童及糖尿病患者等,能应用于糖果、糕点等食品领域。本研究将来源于Pantoea dispersa UQ68J的蔗糖异构酶基因在Escherichia coli和Bacillus brevis中重组表达,优化培养条件提高蔗糖异构酶的表达量。此外,本实验对蔗糖异构酶粗酶液进行分离纯化,并研究了蔗糖异构酶的相关酶学性质及应用特性。主要研究内容如下。(1)将*** UQ68J来源的蔗糖异构酶基因(含信号肽及成熟蛋白)进行密码子优化后,与无信号肽的表达载体pET-24a(+)连接。将构建正确质粒转入*** BL21(DE3)构建表达菌株—ORI菌株。采用TB培养基发酵培养,胞外酶活及总酶活分别达到65、85 U·mL-1。为提高蔗糖异构酶产量,研究了PelB、Omp A信号肽及不同的成熟蛋白起始位点对蔗糖异构酶的影响,发现从天然信号肽开始第22位氨基酸作为成熟蛋白的起始,连接PelB信号肽构建的P22菌株总酶活最高,达到143 U·mL-1,是ORI菌株总酶活的1.5倍;同时其发酵上清与周质空间中蔗糖异构酶酶活之和是ORI菌株相应酶活的1.3倍。由于P22菌株发酵时,其周质空间及细胞浆内分布大量蔗糖异构酶,为进一步提高蔗糖异构酶的胞外产量,3 L发酵罐中,研究甘氨酸浓度和诱导时间对蔗糖异构酶酶活的影响。当补加0.5%甘氨酸,DCW为18 g·L-1开始诱导,P22菌株的蔗糖异构酶胞外酶活最高达1981 U·mL-1,同时总酶活达到2640 U·m L-1。(2)将去除信号肽序列的蔗糖异构酶基因(起始位点为第22或34位氨基酸)与Bacillus brevis胞外表达载体pSVEB连接,构建的重组表达载体转入宿主***中,构建重组菌株B22、B34菌株。摇瓶中,经TM培养基发酵培养48 h,B22菌株胞外酶活达到50U·m L-1,B34菌株胞外酶活为35 U·m L-1。对B22菌株进行摇瓶培养基优化,蔗糖异构酶胞外酶活达到138 U·m L-1。为进一步提高蔗糖异构酶产量,在3 L发酵罐中研究了氮源含量及搅拌恒转速对蔗糖异构酶的影响。当氮源含量为30 g·L-1,恒转速为400 r·min-1时,蔗糖异构酶的胞外酶活提升至190 U·m L-1。(3)将不同宿主菌表达的胞外蔗糖异构酶经分离纯化后,研究相关酶学性质。大肠杆菌和短小芽孢杆菌表达的胞外蔗糖异构酶,两者最适温度及pH都是30℃和6.0。而且,两者比活分别是597.0、555.0 U·mg-1。此外,对动力学进行研究:大肠杆菌及短小芽孢杆菌表达的蔗糖异构酶Vmax分别为660.9、657.2 U·mg-1;Km分别为21.3、20.6 m M;Kcat分别为730、724 s-1及Kcat/Km分别是34.3、35.1 mM-1·s-1。(4)研究了不同条件对蔗糖异构酶催化蔗糖形成异麦芽酮糖的影响,获得最优的酶转化条件为,加酶量20 U·g-1,初始pH 6.5,35℃及底物浓度为400 g·L-1,转化率最高达到92.0%;同时,底物浓度提升至700 g·L-1,转化率仍然高于90%。

关键词：蔗糖异构酶异麦芽酮糖大肠杆菌短小芽孢杆菌发酵优化

Bacillus circulans ATCC 31382 β-半乳糖苷酶转糖苷产物特异性分子改造及发酵优化

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Bacillus circulans ATCC 31382 β-半乳糖苷酶转糖苷产物特异性...

作者：许俊勇江南大学

学位级别：硕士

低聚半乳糖(GOS)作为一种在食品、保健品及医药行业有着广泛应用的益生元,具有刺激肠道蠕动、提高免疫力、促进益生菌增值和防止骨质疏松等功效,近年来市场需求量不断增加。工业上生产GOS主要利用β-半乳糖苷酶进行酶法制备,β-半乳糖... 详细信息

低聚半乳糖(GOS)作为一种在食品、保健品及医药行业有着广泛应用的益生元,具有刺激肠道蠕动、提高免疫力、促进益生菌增值和防止骨质疏松等功效,近年来市场需求量不断增加。工业上生产GOS主要利用β-半乳糖苷酶进行酶法制备,β-半乳糖苷酶的性能是影响GOS生产的关键。本研究将环状芽孢杆菌(Bacillus circulans ATCC 31382)来源的β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达,研究其酶学性质以及制备GOS的能力,并通过分子改造获得五个优势突变体。之后将野生型(WT)及优势突变体在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行异源表达和发酵条件优化,并进行3-L罐的高密度发酵。主要研究结果如下:(1)β-Gal-Ⅱ在***中的表达、酶学性质表征及制备GOS能力的研究。合成*** ATCC 31382来源的β-Gal-Ⅱ并转入*** BL21(DE3)-Δlac Z菌株,摇瓶酶活为6.57 U·m L-1,比活为15.59 U·mg-1;其最适温度、p H分别为60℃和5.0;在60℃下放置30 min几乎完全失活,50℃下半衰期在3 h左右,40℃下放置24 h还能维持95%以上的活性;p H 5.0-7.0内具有很好的稳定性,4℃下放置24 h还能维持99%的活性;对其以乳糖为底物制备GOS进行优化,最终在最佳反应条件(50℃、加酶量2.50 U·m L-1、40%底物浓度、p H 5.0)下反应24 h左右可获得最大转化率61.59%,其中异乳糖和长链GOS(DP≥3)产率分别为23.33%和31.79%,占总GOS的37.88%和51.84%。(2)筛选系统的构建、突变体的筛选及酶转化产物分析。构建了一套以转苷产物异乳糖为响应物的筛选系统,并对突变体文库进行筛选,最终获得两个突变体Y406F和Y563F。对这两个突变体与WT的酶转化产物的成分进行比较,Y406F和Y563F异乳糖转化率从WT的23.33%分别提升到29.12%和30.09%。(3)对β-Gal-Ⅱ进行理性设计以提高DP≥3的GOS转化率。选取β-Gal-Ⅱ活性中心的五个氨基酸进行十六个突变体的构建及表达,最终获得三个优势突变体,分别是R333M、N467S和R441K;对这三个突变体的酶转化产物进行分析,结果表明,R333M、N467S和R441K在长链GOS的转化率上相比WT明显提高,从31.93%分别提高到41.36%、43.96%和38.55%。(4)β-Gal-Ⅱ在***中的异源表达、发酵条件优化及3-L罐发酵。将β-Gal-Ⅱ基因转入*** WS9菌株获得重组菌WS9/β-Gal-Ⅱ,发酵后测得酶活3.63 U·m L-1;在摇瓶水平优化发酵氮源的种类、浓度和复合氮源浓度及配比。结果显示,以7.5 g·L-1安琪酵母粉和玉米浆干粉为发酵氮源时,摇瓶总酶活为6.82 U·m L-1,是TB培养基发酵的1.5倍,单一氮源发酵的2-2.5倍;在3-L罐上进行发酵温度的优化,37℃优于33℃,总酶活最高为138.29 U·m L-1,是摇瓶发酵总酶活的20.3倍;对WS9/N46S和WS9/Y563F进行3-L罐的发酵,最高总酶活分别是摇瓶发酵的19.3倍和24.1倍。

关键词： β-半乳糖苷酶低聚半乳糖分子改造枯草芽孢杆菌发酵条件优化

Sirococcus conigenus角质酶的重组表达及在短链芳香酯制备中的应用研究

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Sirococcus conigenus角质酶的重组表达及在短链芳香酯制备中的应...

作者：郭小杰江南大学

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角质酶(EC 3.***.1.74),一种丝氨酸酯酶,能够催化多种脂肪酸与醇发生酯合成反应,以及不同类型的酯与醇发生酯交换反应,获得的产物包括短链芳香酯、线性烷基酯以及聚酰胺等多种聚合物,普遍被用于医药、食品保健、化妆品及饮料等行业。本研... 详细信息

角质酶(EC 3.***.1.74),一种丝氨酸酯酶,能够催化多种脂肪酸与醇发生酯合成反应,以及不同类型的酯与醇发生酯交换反应,获得的产物包括短链芳香酯、线性烷基酯以及聚酰胺等多种聚合物,普遍被用于医药、食品保健、化妆品及饮料等行业。本研究将来源于Sirococcus conigenus VTT D-04989的酸性角质酶(ScCutA)在毕赤酵母(Pichia pastoris KM71)中进行了重组表达,研究了其酶学性质;通过3 L罐发酵工艺优化、共表达*** N-乙酰转移酶(MprI)等手段以提高角质酶的表达量,并探究了重组ScCutA在制备短链芳香酯中的应用。主要研究结果如下:(1)将携带***角质酶基因的重组质粒pPIC9K-ScCutA经Sac I内切酶线性化后电转入*** KM71,获得重组菌*** KM71/pPIC9K-ScCutA,并将其在摇瓶发酵,经甲醇诱导120 h后ScCutA的酶活为28.6 U·m L-1。重组ScCutA经过分离纯化和酶学定性研究表明:重组ScCutA的比酶活由90.6 U·mg-1提高至149.1 U·mg-1,纯化倍数为1.6,回收率为31.1%;重组ScCutA的最适温度为65℃,在45℃和50℃条件下半衰期分别为12 h和3 h;最适p H为4.5,在pH 3.5-6.5范围内比较稳定;重组ScCutA在乙醇、丁醇等许多有机溶剂中仍保留较高的活性。对重组菌在3 L罐发酵制备ScCutA的条件进行了优化,获得的最优工艺为:当诱导剂甲醇浓度为1%(v·v-1),DCW达到38.4 g·L-1(OD600为100),28℃诱导138 h时酶活最高,为419.2 U·m L-1。(2)N-乙酰转移酶(MprI)能够使***细胞内的活性氧(ROS)水平降低,使***在胁迫环境下仍能发挥生理功能。为了提高***表达重组ScCutA时细胞抗ROS氧化胁迫的能力,将携带*** N-乙酰转移酶基因的重组质粒pPICZA-MprI线性化后转入*** KM71/pPIC9K-ScCutA,获得重组菌*** KM71/pPIC9K-ScCutA/pPICZA-MprI。经甲醇诱导120 h后ScCutA的酶活为39.4 U·m L-1,是对照组的1.4倍;然后对其在3 L罐发酵制备ScCutA的条件进行了优化,获得的最优工艺为:诱导剂甲醇浓度为1.5%(v·v-1),当DCW达到38.4 g·L-1(OD600为100),28℃诱导138 h时酶活为483.3 U·mL-1,是对照组的1.2倍。(3)考察了重组ScCutA在有机相、水相、原酒和清香型白酒短期固态发酵中合成短链芳香酯的研究,结果表明:在有机相中合成酯时,最优条件为初始水含量为0.04%,己酸浓度为0.1 mol·L-1,己酸/乙醇摩尔比为1:1.5,冻干ScCutA用量为40U·m L-1,50℃反应16 h时,己酸乙酯的酯化率达到98.3%;考察了ScCutA在水相中的酯合成能力,酯化率在5.7%-15.9%;考察ScCutA对原酒中主要芳香酯含量变化的影响,白酒原酒中的芳香酯含量明显降低,其中己酸乙酯的含量降低最明显,比对照组降低了34.3%,而黄酒原酒中芳香酯含量有不同程度的升高,其中乳酸乙酯含量变化最明显,比对照组提高了152.3%,因此添加ScCutA加速了原酒在陈化过程中芳香酯含量的变化;此外,考察了ScCutA在清香型白酒短期固态发酵中的应用研究,结果表明,当ScCutA用量为2%(kg·kg-1)时,酒中总酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量变化较明显,分别比对照组提高29.6%、25.3%和17.1%。

关键词：角质酶毕赤酵母发酵优化 N-乙酰转移酶短链芳香酯

Streptomyces canus氨肽酶的表达、酶学性质及其在大米肽制备中的应用

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Streptomyces canus氨肽酶的表达、酶学性质及其在大米肽制备中的...

作者：秦琴江南大学

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大米蛋白是营养价值高的膳食蛋白,但其低溶解性和高度变性限制了大米蛋白资源的开发。而大米肽除了保留大米蛋白原有的优良性质外,还具备调节人体免疫、缓解衰老、改善肠道菌群稳态等功效,被公认为优质食源性肽。目前,优质大米肽主要由... 详细信息

大米蛋白是营养价值高的膳食蛋白,但其低溶解性和高度变性限制了大米蛋白资源的开发。而大米肽除了保留大米蛋白原有的优良性质外,还具备调节人体免疫、缓解衰老、改善肠道菌群稳态等功效,被公认为优质食源性肽。目前,优质大米肽主要由蛋白酶与氨肽酶协同水解大米蛋白制备而成,即蛋白酶水解大米蛋白释放肽,随后氨肽酶去除肽N端引发苦味的疏水性氨基酸。目前,大米肽酶法制备的研究多集中在蛋白酶,有关脱苦的氨肽酶鲜有报道,以至于现有的氨肽酶对大米肽的脱苦效果并不显著。故亟需获得对大米肽脱苦效果显著的氨肽酶,并考察其与蛋白酶复配在大米肽制备中发挥的作用。本课题从实验室保藏的胞外有高氨肽酶酶活的天然菌株T20中获得氨肽酶ScAP,将其在食品级宿主菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中异源表达后进行酶学性质表征与序列结构分析。同时考察氨肽酶ScAP对大米肽的脱苦效果,随后氨肽酶ScAP与胰蛋白酶复配水解大米蛋白,并优化制备条件获得优质大米肽。主要研究成果如下:(1)完成菌株T20种属分析、产氨肽酶条件优化及酶的鉴定。鉴定了野生菌T20,其所属种为暗灰链霉菌(Streptomyces canus)。以不同蛋白/肽为唯一营养源诱导*** T20产氨肽酶,其中大米蛋白的诱导效果最佳,2%大米蛋白诱导发酵4 d后胞外氨肽酶酶活最高,达310.90 U·m L。从发酵液中分离的潜在氨肽酶经肽指纹图谱分析,与Streptomyces fulvoviolaceus来源氨肽酶(WP＿043454179.1)相似度最高,将其命名为氨肽酶ScAP。(2)完成*** T20氨肽酶ScAP克隆表达、酶学定性及序列结构分析。从*** T20基因组PCR扩增出目标基因scap,并在***中重组表达,重组菌发酵24 h后胞内氨肽酶ScAP酶活达271.03 U·m L。纯化的氨肽酶ScAP比活高达6216.67 U·mg,为文献报道链霉菌来源氨肽酶最高水平。氨肽酶ScAP最适温度为60℃,最适p H为8.0,在50℃半衰期为285 h,在p H 9.0半衰期为48 h。Ca和Co对酶有激活作用,在0.1 mmol·L浓度下,相比对照酶活分别增加至115.44%和104.03%。0.1 mmol·L EDTA可使其完全失活,重新添加Co、Zn和Mn可部分地恢复去除Zn的氨肽酶ScAP酶活。氨肽酶ScAP对N端的Leu、Met和Phe等疏水性氨基酸表现出高水解偏好性,ScAP的结构分析表明其底物结合区域表现出更高的疏水性。(3)验证氨肽酶ScAP制备高品质大米肽的能力。以大米肽为底物进行氨肽酶ScAP脱苦效果的评估,大米肽经氨肽酶ScAP(终浓度0.48 mg·m L)处理2 h,苦味下降50.68%,游离疏水氨基酸含量增加80倍,表明氨肽酶ScAP能够有效去除大米肽N端疏水氨基酸,进而有效降低肽的苦味。随后,氨肽酶ScAP与胰蛋白酶复配制备大米肽。经优化,最佳制备条件为:胰蛋白酶和氨肽酶ScAP分别以1:5和3.33%加酶量(w·w)在50℃以一步水解法酶解大米蛋白4 h。相比胰蛋白酶单独水解,双酶复配产物中小分子肽(180-1000 Da)含量提高了145.00%,达4.41 mg·m L,苦味下降15.76%。随后对制备的大米肽进行生物活性评价,其自由基清除能力、还原能力和血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性对比商品大米肽或商品氨肽酶参与制得大米肽具有整体优势。

关键词：暗灰链霉菌T20 氨肽酶大米肽脱苦生物活性

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先进的静止无功发生装置及在配网中应用

先进的静止无功发生装置及在配网中应用

作者：姚军东南大学

学位级别：硕士

随着社会进步和国民经济的发展,用电量快速增加,用电设备的种类亦日益增多,特性各不相同,直接或间接地造成了各种严重的电能质量问题。特别是用电设备中的感性负荷和冲击负荷给电网带来了大量的无功和谐波,造成电网功率因数降低,谐波成... 详细信息

随着社会进步和国民经济的发展,用电量快速增加,用电设备的种类亦日益增多,特性各不相同,直接或间接地造成了各种严重的电能质量问题。特别是用电设备中的感性负荷和冲击负荷给电网带来了大量的无功和谐波,造成电网功率因数降低,谐波成分增大,引起本身和其它用电设备不能正常高效的工作,为此,补偿电网的无功和谐波就成为人们及其关注的课题。在用户侧(低压侧)进行无功和谐波补偿是人们关注的一个非常活跃的领域。这样的补偿很灵活,很有效,补偿装置也经历了从最初的同步调相机到静止无功补偿装置(SVC)到现在的静止无功发生器(SVG)的发展。目前用于三相三线制的静止无功发生器已经较为成熟,但随着不对称负荷问题的日益突出,对零线电流的补偿显得十分重要,这就要求使用三相四线制的静止无功发生器。三相四线制静止无功发生器所用到的电流坐标变换理论虽然提出已有二三十年的时间了,但至今国内三相四线制静止无功发生器产的产品还不是很成熟。本文的任务就是研制一台三相四线制无功补偿发生器。本文首先论述了电能质量问题存在的普遍性和危害性,并对其中突出问题无功补偿和谐波抑制的意义作了分析,从而引出研制三相四线制静止无功发生器的重要性;再简要总结了无功补偿装置的发展历程、现状及趋势;然后是三相四线制无功补偿发生器的理论基础(主要是瞬时无功功率理论和IGBT脉冲产生的空间矢量法);最后是装置的仿真结果波形、硬软件研制、试验和调试。在仿真环节,利用PSCAD仿真软件较好地实现了对十八种不同情况的无功补偿,对整流桥负载所产生的谐波也有一定的抑制作用;硬件的研制方面由三大块组成,包括运算控制部分、信号调理部分和IGBT驱动部分,运算控制部分采用TMS320LF2407处理器加LPC2104控制器模式。

关键词：电能质量无功补偿三相四线制瞬时无功功率空间矢量法仿真波形 TMS320LF2407 LPC2104 μc/os-Ⅱ