检索结果-南通市图书馆

作者：王梦园青岛大学

学位级别：硕士

目的沙雷菌（Serratia）是临床常见的机会致病菌之一。近年来,因其临床菌株易对常用抗生素产生耐药性,且偶可导致院内感染的爆发,故而逐渐引起人们的重视。细菌中成簇规律性间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas）和毒素-抗毒素... 详细信息

目的沙雷菌（Serratia）是临床常见的机会致病菌之一。近年来,因其临床菌株易对常用抗生素产生耐药性,且偶可导致院内感染的爆发,故而逐渐引起人们的重视。细菌中成簇规律性间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas）和毒素-抗毒素（TA）系统分别以特异性切割降解核酸序列及顿挫感染的方式发挥噬菌体防御的功能,前者被认为可影响移动元件在细菌间的水平转移,后者则与细菌对不良环境的耐受有关。本研究旨在对沙雷菌CRISPR-Cas系统及Ⅱ型TA系统的结构和分布特征进行系统分析,研究其与沙雷菌的可移动元件、耐药基因及耐药表型的关系;同时,探究部分TA系统表达后对细菌生长产生的影响。方法1.自Nucleotide数据库下载了88株沙雷菌的全基因组序列,使用CRISPRCasfinder软件预测基因组所含CRISPR阵列及cas基因簇;由Meg Aline软件进行cas基因的序列比对并构建系统发育树;由DNAMAN8分析前导序列的AT碱基含量和序列,并使用BPROM预测启动子;所得重复序列与CRISPRmap数据库进行比较分析,使用RNAfold预测其最小自由能（MEF）及二级结构;由Blast N和CRISPRTarget进行间隔序列靶向基因的预测;使用PHASTER、ICEfinder、Ori Tfinder、CARD等软件分别对前噬菌体、整合接合元件（ICE）、可接合转移质粒及菌株所含耐药基因进行预测,并分析其与CRISPR-Cas系统之间的关联。2.使用TAfinder预测上述菌株基因组中所含Ⅱ型TA系统,并将所得毒素与抗毒素分别构建数据库,根据Blast P的E-value值再分组,将TA系统重新配对组合,分析其操纵子特征;由Origin软件展示新组合的TA系统在沙雷菌中的分布情况;确定沙雷菌TA系统的侧翼基因,同时预测染色体中的基因组岛（GI）、ICE、前噬菌体的位置以分析TA系统与移动元件的关系。3.基于上述分析结果设计Ⅰ-E、Ⅰ-F型cas1基因及10对TA系统的扩增引物,对收集的98株黏质沙雷菌临床分离株进行鉴定,分析这些系统的存在与细菌耐药表型之间的关系。4.将上述10对TA系统中的毒素与部分抗毒素编码基因的扩增产物分别连接至p BAD33与p ET28表达载体中,使其在大肠埃希菌Top10株及BL21株中单独表达、共同表达,以初步验证其生物学功能。5.统计学分析由SPSS 20.0完成,差异分析主要采用卡方检验及非参数秩和检验。结果1.本研究共在17株（19.32%）沙雷菌的全基因组序列中预测到41个确定的CRISPR阵列;9株菌（10.23%）同时含有cas基因簇。CRISPR-Cas系统型别主要为Ⅰ-E或Ⅰ-F型,cas基因簇中的cas1基因序列最为保守,其系统发育与CRISPRCas系统分型一致。前导序列保守性低,富含“AAAA”及“TTTT”序列,且多数都预测到启动子的存在。41个CRISPR阵列含14种重复序列,它们在型别内高度保守、序列差异较小,且都可以形成稳定的“茎环”结构。间隔序列多在30～34bp之间;靶向分析发现大多数与噬菌体同源,少数与质粒同源,这些质粒和噬菌体多来自肠杆菌科。含完整CRISPR-Cas系统沙雷菌的前噬菌体数量显著低于仅含CRISPR阵列组及不含CRISPR阵列组,但ICE在上述组别中的分布无差异;仅含CRISPR阵列沙雷菌可接合转移质粒存在率较高。沙雷菌染色质携带的耐药基因多为自主突变或固有存在,可移动的耐药基因主要分布于质粒,这些耐药质粒的存在与其CRISPRCas系统并无关联。***共在沙雷菌中预测出1820个Ⅱ型TA系统、31个Ⅳ型TA系统和182个外排泵组分相关的蛋白序列,菌株间所含TA数量的差异较大,在6～32个之间。沙雷菌TA系统的毒素序列可被分为16大类50类,其中Rel E类和GNAT类所含数量较多。抗毒素多为转录调节物,以RHH和Xre家族居多,可被分为53类,其蛋白序列和结构域较毒素更加复杂多变。沙雷菌的TA系统被重新分为78种,并进一步归为16类,其在沙雷菌中的分布极不均匀,系统结构也高度复杂多变。沙雷菌中的Ⅱ型TA系统大多位于染色体上,同一系统在同一菌种内具有相似的基因背景;少部分位于质粒、前噬菌体、GI等可移动元件上,可随之进行水平转移。3.仅1株临床黏质沙雷菌（1%）扩增出cas1基因;10对TA系统在临床分离菌中的存在率与数据库大致相符;耐药菌所含TA系统的数量明显低于非耐药菌,该差异由Rel1、Rel2、Ccd AB、Hic AB、GNAT、MNT/HEPN 6对TA系统所致。4.临床菌株中所含的Ⅱ型TA系统序列与数据库中序列有较高相似度。TA系统的初步功能验证发现Rel1、Rel2、Rel3、PIN1、PIN2、Hic AB系

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克雷伯菌属CRISPR-Cas系统基因结构的分析及其与耐药性的关系

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作者：张蒙蒙青岛大学

学位级别：硕士

目的克雷伯菌属（Klebsiella）为无芽胞、无鞭毛的革兰阴性杆菌,主要包括肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等,常寄生于人或动物呼吸道及肠道,是引起人类肺炎的病原菌之一,此外还可导致子宫炎、乳房炎及其他化脓性炎症,甚至败血症。近年来,克... 详细信息

目的克雷伯菌属（Klebsiella）为无芽胞、无鞭毛的革兰阴性杆菌,主要包括肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等,常寄生于人或动物呼吸道及肠道,是引起人类肺炎的病原菌之一,此外还可导致子宫炎、乳房炎及其他化脓性炎症,甚至败血症。近年来,克雷伯菌属细菌的耐药性逐年增高,甚至出现了泛耐药菌株,给临床感染的控制和治疗带来严峻的挑战。CRISPR-Cas系统是细菌基因组中可抵御外源遗传物质入侵的适应性免疫防御系统。本研究旨在对克雷伯菌属细菌基因组中CRISPR-Cas系统的分布概况及其基因结构等进行系统的分析,并以临床常见的肺炎克雷伯菌为研究对象探讨CRISPR-Cas系统与细菌耐药性之间的关系,为控制细菌间耐药基因的水平传播提供新的思路。方法本研究主要分为两部分。第一部分研究中,部分克雷伯菌的CRISPR阵列信息直接收集于CRISPRdb数据库,其余NCBI下载的细菌的CRISPR基因座的查找通过CRISPRFinder进行;cas基因的查找均通过CRISPR-Cas Finder进行。利用MEGA7.0对所有cas基因及重复序列进行多序列比对和遗传进化分析,并构建系统发育树。重复序列的系统发育分析结果提交到CRISPRmap在线软件中进行分析;重复序列的二级结构及最小自由能（MFE）的预测通过RNAfold进行。间隔序列靶向的外源基因序列的查找通过Blastn进行,靶向的标准定为同源性大于或等于85%。通过DNAStar的EditSeq软件截取前导序列,并利用promoter2.0对截取序列中的启动子进行预测。前导序列的保守性通过Weblogo预测。通过MLST数据库查找肺炎克雷伯菌的MLST分型。检索肺炎克雷伯菌基因组的注释以获得耐药基因信息。利用卡方检验、Fishers’确切概率法等统计学方法研究肺炎克雷伯菌基因组中CRISPR-Cas系统与耐药基因的携带率之间的关系。第二部分对临床分离的肺炎克雷伯菌的CRISPR-Cas系统的分布概况进行了研究,并探讨了其与细菌耐药表型之间的关系;该部分菌株大部分收集于青岛大学附属医院检验科。首先以第一部分生物信息学分析的数据为基础设计引物;通过对肺炎克雷伯菌基因组中cas1基因的分析,利用Primer premier 5软件分别在I-Ea型和I-Eb型cas1基因内部设计了两对引物。进一步通过统计学的方法分析临床分离株CRISPR-Cas系统的存在与细菌耐药表型之间的关系。结果1.441株克雷伯菌属细菌的确定CRISPR阵列的存在比例为37.64%,cas基因簇的存在率为27.21%。肺炎克雷伯菌基因组中含有确定CRISPR阵列的比例为40.53%,cas基因簇为31.95%。克雷伯菌的CRISPR阵列大多数位于染色体上,但有少数位于质粒上。本研究收集的肺炎克雷伯菌临床分离株中cas1基因的携带率为34%。克雷伯菌属的CRISPR-Cas系统大多数属于I-E型,少数为I-F型,肺炎克雷伯菌的CRISPR-Cas系统全部属于I-E型,并且根据其cas基因的系统发育分析结果可分为I-Ea和I-Eb两个亚型。2.441株克雷伯菌基因组中共发现242条确定重复序列,去除相同及反向互补序列后共发现28种,长度为24～48bp,以30bp最多见,平均为29bp。对这28种确定重复序列进行了多序列比对及系统发育分析发现,其大致可分为两类。肺炎克雷伯菌I-Ea亚型中的重复序列较保守,而I-Eb中的重复序列变异较大。441株克雷伯菌的确定CRISPR阵列中共发现4350条间隔序列,经过多序列比对分析去除相同序列后共筛选出1050条不同的间隔序列。将这1050条间隔序列在Genbank中进行Blast检索发现,24.8%的序列与噬菌体同源,26%与质粒同源,41.2%与非克雷伯菌属的细菌基因序列同源,此外,本研究还发现9%的间隔序列靶向其他物种的基因序列。3.通过多序列比对去除了194条假定前导序列中的相同序列,筛选出33种不同的前导序列,系统发育分析结果发现其大致可分为两类,每类又可分为多个亚类,表明克雷伯菌属基因组中位于染色体上的I-E型CRISPR-Cas系统的前导序列之间并不保守。利用Promoter2.0对33种不同的前导序列进行预测,结果未发现启动子结构。I-Ea亚型前导序列75～95bp间AT含量较为丰富,有连续的“AAAA”存在,而I-Eb亚型前导序列中整体的AT含量较低,但在90～95bp间也有“AATAT”存在。4.对肺炎克雷伯菌的MLST分型与CRISPR-Cas系统的分型之间的关系进行分析发现,含有I-Ea亚型CRISPR-Cas系统的细菌的集中分布在ST147、163、253、273、34、383、392、45、485、66、67、941型别,I-Eb亚型CRISPR系统集中分布在ST11

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仿树叶型静态混合元件流动与混合特性研究

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作者：蔡巧梅中国计量学院

学位级别：硕士

选择性催化还原法(SCR)脱除锅炉烟气中NOX是目前脱硝效率最高、应用最广泛的方法。静态混合器是SCR脱硝系统中常见的混合装置,其混合效果的好坏直接关系着SCR脱硝效果。为了解决快速混合问题,本文试图研究开发一种能够短时间内实现烟气... 详细信息

选择性催化还原法(SCR)脱除锅炉烟气中NOX是目前脱硝效率最高、应用最广泛的方法。静态混合器是SCR脱硝系统中常见的混合装置,其混合效果的好坏直接关系着SCR脱硝效果。为了解决快速混合问题,本文试图研究开发一种能够短时间内实现烟气与还原剂良好混合的静态混合装置。本文以仿树叶型混合元件为研究对象,采用数值模拟与实验研究相结合的研究方法,研究气体流过时混合元件内部的流动特性及混合性能。对三种典型叶形(柳叶、枫叶、松叶)的静态混合元件的流场进行数值模拟,结果表明:仿松叶型混合元件引起的速度扰动范围较小,仿柳叶型混合元件引起的速度扰动范围最大;混合元件叶片的尾迹处流体湍流强度和湍动能耗散率相当大,其中,仿柳叶型混合元件叶片下游的湍动能和耗散率最大,介观和宏观混合最强,仿松叶型混合元件最小;仿松叶型混合元件对管道内流体的压降基本无影响,仿柳叶型混合元件和仿枫叶型混合元件使管道内流体的压降发生明显的变化,且仿枫叶型混合元件使压降增大的趋势更明显。用湍动能原理初步选定仿柳叶型混合元件为最优叶形的混合元件。对仿柳叶型混合元件的流动特性和混合特性进行数值模拟和实验研究,并分析研究叶片与轴线所呈角度及叶片数量对混合效果的影响。采用同一数学模型的速度场数值模拟计算结果和试验数据基本吻合。当混合元件叶片与轴线所呈角度变大时,叶片下游湍动能变大,混合元件在L=26cm处产生的涡数量变多,沿程高速度标准偏差系数持续的距离变长,出口的速度标准偏差系数和浓度标准偏差系数均变小,混合作用增强。随着混合元件叶片数量增加,叶片下游湍动能变大,沿程浓度标准偏差系数下降变快,出口处的速度标准偏差系数减小。混合元件下游产生的小涡变少,介观混合减弱。混合元件叶片数量一定时,沿程压降随着叶片与轴线所呈角度变大而增加;混合元件叶片与轴线所呈角度一定时,沿程压降随着叶片数量增多而增加。

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Lvis/Lvis jr支架与Solitaire AB支架早期辅助栓塞颉内破裂动脉瘤的对比研究

Lvis/Lvis jr支架与Solitaire AB支架早期辅助栓塞颉内破裂动脉瘤...

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作者：肖玉明青岛大学

学位级别：硕士

目的:回顾性分析我院区神经外科早期经支架辅助栓塞治疗的破裂颅内动脉瘤病人的病历资料,比较Lvis/Lvis Jr支架和Solitaire AB支架治疗的并发症发生率、手术效果及其预后,根据两种支架对比研究进一步指导临床实践。方法:收集青岛大学附... 详细信息

目的:回顾性分析我院区神经外科早期经支架辅助栓塞治疗的破裂颅内动脉瘤病人的病历资料,比较Lvis/Lvis Jr支架和Solitaire AB支架治疗的并发症发生率、手术效果及其预后,根据两种支架对比研究进一步指导临床实践。方法:收集青岛大学附属医院崂山院区神经外科2012年1月1日-2016年7月31日经早期支架辅助栓塞治疗的颅内破裂动脉瘤患者的病历资料。纳入标准为:1、经CT或腰穿诊断为蛛网膜下腔出血病例;2、经CTA或DSA诊断为颅内动脉瘤病例;3、使用Lvis/Lvis Jr支架或Solitaire AB支架辅助栓塞病例;排除标准为:1、多发动脉瘤病例;2、未破裂动脉瘤病例;3、开颅与介入联合治疗病例;4、SAH发病72小时以后经血管内治疗的病例;5、6个月随访失访病例。将2014年11月1日-2016年7月31日期间使用Lvis/Lvis Jr支架治疗的30人归入Lvis/Lvis Jr支架组;2012年1月1日-2014年10月30日期间使用Solitaire AB支架治疗的33人归入Solitaire AB支架组。两组病人均由同一术者完成手术。把上述两组资料输入SPSS22.0进行统计分析,定量资料采用t检验,定性资料采用卡方检验。采用双侧检验P值<0.05作为具有统计显著性水平的标准。结果:Lvis/Lvis Jr支架组与Solitaire AB支架组病人的年龄、性别、Hunt-Hess分级、Fisher分级、动脉瘤位置、动脉瘤大小的P值分别为:0.25、0.96、0.46、0.75、0.91、0.78,两组的年龄、性别、Hunt-Hess分级、Fisher分级、动脉瘤位置、动脉瘤大小均没有统计学差异,两组具有可比性。术后即刻结果完全栓塞率Lvis/Lvis Jr支架组为56.67%,Solitaire AB支架组为51.52%,P=0.68,两组没有统计学差异。Lvis/Lvis Jr支架组5例发生了围手术期并发症,发生率为16.67%,Solitaire AB支架组发生了4例,发生率为12.12%,P=0.88,两组没有统计学差异;其中两组均没有发生术中死亡、支架移位、支架膨胀不全情况。术中出血事件Lvis/Lvis Jr支架组发生了1例,发生率为3.33%,Solitaire AB支架组发生了1例,发生率为3.03%,P=1.0,两组没有统计学差异;术中血栓Lvis/Lvis Jr支架组发生了2例,发生率为6.67%,Solitaire AB支架组发生了1例,发生率为3.03%,P=0.93,两组没有统计学差异;血管痉挛Lvis/Lvis Jr支架组发生了2例,发生率为6.67%,Solitaire AB支架组发生了2例,发生率为6.06%,P=1.00,两组没有统计学差异;Lvis/Lvis Jr支架组没有发生中期(6个月随访)复发,Solitaire AB支架组复发1例,复发率为3.33%,P=1.00,两组没有统计学差异;中期预后良好(m RS≦2分)率Lvis/Lvis Jr支架组为67.69%,Solitaire AB支架组为60.71%,P=0.82,两组没有统计学差异。中期动脉瘤完全栓塞率Lvis/Lvis Jr支架组为86.67%,Solitaire AB支架组为60.61%,P=0.02,两组差异有统计学意义。结论:1、Lvis/Lvis Jr支架的术中并发症发生率、术后即刻结果完全栓塞率、中期(6个月随访)复发率、中期良好预后率与Solitaire AB支架相似。2、Lvis/Lvis Jr支架比Solitaire AB支架有更高的动脉瘤中期完全栓塞率。3、Lvis/Lvis Jr支架是一款安全有效的颅内支架。

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16S rDNA高通量测序分析滴虫性阴道炎患者阴道菌群多样性

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作者：郭双双青岛大学

学位级别：硕士

目的滴虫性阴道炎是由阴道毛滴虫引起的一种常见的阴道炎症。滴虫性阴道炎与阴道菌群的联系是明确该病发病机制和阴道菌群变化不可或缺的部分。本研究以滴虫性阴道炎患者为研究对象,观察该病状态下的阴道微生态特征,并同时利用高通量测... 详细信息

目的滴虫性阴道炎是由阴道毛滴虫引起的一种常见的阴道炎症。滴虫性阴道炎与阴道菌群的联系是明确该病发病机制和阴道菌群变化不可或缺的部分。本研究以滴虫性阴道炎患者为研究对象,观察该病状态下的阴道微生态特征,并同时利用高通量测序技术分析滴虫性阴道炎患者阴道微生物群落的组成与结构,以期为滴虫性阴道炎的发病机制及其与阴道菌群的关系的进一步研究奠定基础。方法2016年3月至2016年9月于青岛大学附属青岛市妇女儿童医院、青岛大学附属青岛市立医院,严格按照疾病诊断和研究对象筛选标准,收集育龄期健康妇女和滴虫性阴道炎患者阴道分泌物样本,分别为对照组和滴虫组。测定滴虫组和对照组阴道分泌物p H值。利用革兰染色阴道分泌物涂片比较两组阴道分泌物菌群多样性、乳酸杆菌密集度,评价两组阴道微生态状况。使用乳酸杆菌选择性培养基分离培养滴虫组和对照组阴道分泌物中乳酸杆菌并进行菌落计数。提取阴道细菌总基因组DNA,利用通用引物分别扩增滴虫组和对照组阴道细菌16S r DNA V3和V4高变区。PCR扩增产物经Illumina-Misq高通量测序平台测序,测序长度为450 bp。优化处理序列数据,以97%的相似性阈值划分分类操作单元,进行生物信息学分析,比较两组的菌属构成、Alpha多样性、Beta多样性,寻找组间差异物种。结果滴虫性阴道炎患者阴道分泌物pH值高于对照组,阴道菌群多样性增加、乳酸杆菌密集度显著降低、菌落计数显著低于对照组。滴虫组的阴道分泌物p H值为5.45±0.61,对照组为4.47±0.44,两组差异有统计学意义(p0.001),滴虫感染时阴道菌群α多样性无显著变化。高通量测序分析发现两组菌群构成在属水平存在显著差异。两组菌群组成差异菌属包括纤毛菌属、普雷沃菌属、乳杆菌属、支原体属、阿波罗菌属、巨球菌属等。结论滴虫性阴道炎患者阴道微环境中菌群多样性增加,乳酸杆菌减少、杂菌增加。高通量测序表明,滴虫性阴道炎患者的阴道菌群多样性与对照组健康女性阴道菌群组成具有一定的相似性,但滴虫性阴道炎患者阴道菌群结构发生变化,乳酸菌属减少,纤毛菌属、普雷沃菌属等其他厌氧菌增多。乳酸杆菌与阴道微生态健康密切相关。高通量测序法与传统的菌群分析法相比,能更精确地反应阴道菌群的结构组成及变化,并能为进一步研究女性阴道滴虫感染机制与防治奠定基础。

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嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统GspF、E基因的序列测定及smp基因同源重组载体的构建

嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统GspF、E基因的序列测定及smp基...

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作者：辛晓妮青岛大学

学位级别：硕士

目的本实验室在2003年从海洋生物沙蚕消化道中分离出嗜麦芽寡养单胞菌D2,该菌能够大量胞外分泌某蛋白酶（protease of S. maltophilia, SMP）,且纯度高;课题组前期研究已获得了其完整的编码基因（smp）,并分析发现其可能通过Ⅱ型分泌系... 详细信息

目的本实验室在2003年从海洋生物沙蚕消化道中分离出嗜麦芽寡养单胞菌D2,该菌能够大量胞外分泌某蛋白酶（protease of S. maltophilia, SMP）,且纯度高;课题组前期研究已获得了其完整的编码基因（smp）,并分析发现其可能通过Ⅱ型分泌系统分泌。为了能够明确D2株SMP蛋白的分泌表达机制,为该菌的进一步开发与利用奠定基础,本课题组拟利用同源重组技术使外源基因替换D2菌中的smP基因,通过研究突变菌株分泌表达生物活性物质的情况,对D2株SMP蛋白表达机制和嗜麦芽寡养单胞菌Ⅱ型分泌系统的基因结构及功能进行分析。因此,本文旨在构建用于D2株smp基因敲除的重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B;同时在上述过程中获得了D2株Ⅱ型分泌系统GSP基因簇GspF和GspE两个编码基因的完整序列并进行分析。方法1.通过药敏试验（MicsroScan W/A-40全自动微生物鉴定及药敏分析系统检测和稀释法）检测嗜麦芽寡养单胞菌D2株的耐药性,以筛选同源重组实验方案中合适自杀质粒和筛选标记基因。2.根据smp基因序列和GenBank收录的K279a和R551株的高保守序列设计引物,通过基因移步法分别PCR扩增获得其上下游的基因序列。3.对在smp上游序列中发现的Ⅱ型分泌系统GSP基因簇GspF和GspE两个基因进行序列和生物信息学分析。4.根据获得的卿基因的上、下游基因序列设计引物,并引入合适的酶切位点,分别扩增获得同源臂A和B;同时依据Genbank上收录的pBR322的四环素抗性基因（tet）设计引物,扩增获得筛选标记tet的完整ORF基因片段;以上各引物设计时同时引入适当长度的互补序列,以用于SOE-PCR连接。***-PCR连接扩增同源臂A、基因tet和同源臂B,得到三段的嵌合基因序列A-tet-B。6.分别用Not I酶切自杀质粒pDS132NotI和pMD18T-A-tet-B,连接构建重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B,并进行测序分析。结果1.两种药敏试验方法检测显示D2株对氯霉素和四环素敏感,对多种抗生素耐药,故选择pDS132质粒（catr）和DH5αλpir株（cat-）为同源重组的载体系统,选择tet基因为同源重组的筛选标记。2.在D2株smp基因5’拼接三段序列含有两个完整开放读码框架（ORF）,分别为1200bp GspF基因（GenBank收录号GU377212.1）和1434bpGspE基因（GenBank（?）录号HM151387）。在GenBank中BLAST分析发现,D2株与嗜麦芽寡养单胞菌R551-3株的GspF基因及氨基酸序列同源性分别为93%和98%;GspE基因及氨基酸序列同源性分别为92%和99%。3.酶切鉴定证实SOE-PCR产物A-tet-B与自杀质粒pDS132NotI成功连接,测序分析发现同源臂A序列与设计完全一致,筛选基因tet部分与GenBank收录质粒pBR322的四环素抗性基因（tet）完全一致,同源臂B片段与原序列只有5个碱基不同,保真性达98%。结论检测出D2株敏感性抗生素氯霉素（MIC为25μg/ml）、四环素（MIC为12.5μg/ml）;克隆出嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统基因簇中的GspF和GspE完整编码序列;嗜麦芽寡养单胞菌GspF和GspE种内高度保守,而对其他细菌差异显著,提示其Ⅱ型分泌机制可能与其他革兰阴性菌有一定差异。SOE-PCR连接扩增三段基因A-tet-B。构建了用于下一步基因敲除重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B。

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铜绿假单胞菌CRISPR系统基因结构的研究与分析

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作者：刘兴雨青岛大学

学位级别：硕士

目的CRISPR系统是广泛分布在细菌和古生菌中的特殊结构,能提供对外来遗传元件的获得性免疫作用。铜绿假单胞菌的基因组庞大,基因型广泛多样,是抗生素难治性病原体,也是常见的医院机会致病菌。本研究中我们对数据库中铜绿假单胞菌基因组... 详细信息

目的CRISPR系统是广泛分布在细菌和古生菌中的特殊结构,能提供对外来遗传元件的获得性免疫作用。铜绿假单胞菌的基因组庞大,基因型广泛多样,是抗生素难治性病原体,也是常见的医院机会致病菌。本研究中我们对数据库中铜绿假单胞菌基因组中和临床分离株中CRISPR系统的分布和多样性进行了比较分析,包括CRISPR重复序列、间隔序列、前导序列和cas基因序列及系统结构,为铜绿假单胞菌CRISPR系统的进化、多样性、保守性以及菌株的耐药提供更多见解。方法本文我们通过两个方面分析了铜绿假单胞菌的CRISPR系统,包括数据库菌株基因组中CRISPR系统的生物信息学分析和临床分离株CRISPR基因座和cas1基因的研究。我们下载了95株铜绿假单胞菌的全基因组序列,并收集其CRISPR系统信息。重复序列和cas基因的比对分析通过DNAstar中Clustal W完成,cas1和cas3的系统发育树借助MEGA7完成,通过RNAfold进行重复序列RNA二级结构的预测。借助Gen Bank数据库对间隔序列进行BLAST,以找到与其高度同源的序列。选取第一重复序列上游与CRISPR系统cas基因之间的序列作为前导序列搜索对象,通过Clustal W反复比较分析找到保守区域;于青岛各大医院检验科收集108株铜绿假单胞菌及其耐药信息,PCR扩增CRISPR基因座和cas1基因片段并分析基因座中的重复序列和间隔序列。结果在95株铜绿假单胞菌中,我们发现了130个确定的CRISPR位点,分布在58个菌株中,其中47个具有结构完整的CRISPR系统,30个是I-F型,7个是I-C型,6个是I-E型,I-F型可以和I-C型或I-E型同时存在于同一株菌中,其他的不能分型。130个CRISPR位点中发现18种重复序列,重复序列有一定的保守性,基本上都可以形成保守的哑铃状RNA二级结构。不同类型的CRISPR系统的cas蛋白不同,所有的CRISPR-cas系统都具有cas1和cas3。cas1和cas3比较保守,可以作为分型的依据。不同位点中间隔序列的长度和数量不同,本文2132个间隔序列中,有526个与噬菌体序列同源,32个与质粒序列同源;108株铜绿假单胞菌的CRISPR基因座和cas1基因的PCR结果显示,在108株临床菌中,36.11%(39/108)可以检测到cas1基因,37.96%(41/108)可以检测到CRISPR基因座,30.60%可以同时检测到cas1基因和CRISPR基因座,CRISPR基因座的重复序列非常保守,但是基因座大小不同。铜绿假单胞菌抗生素耐药与CRISPR系统之间相关性的分析发现,其存在可以降低铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率。结论⑴数据库中铜绿假单胞菌基因组的CRISPR系统主要是I-F型,另外也发现了I-E和I-F型CRISPR系统;⑵cas1和cas3基因在同种类型的CRISPR系统中高度保守;⑶与间隔序列同源的外源基因主要是噬菌体,只有少数是质粒;⑷耐药性分析发现,铜绿假单胞菌基因组抗生素耐药相关基因的携带率很高,CRISPR基因座和完整系统的存在可以降低菌株对亚胺培南的耐药性。

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HDAC1抑制剂RG2833在多形性胶质母细胞瘤细胞中的作用

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作者：王旭青岛大学

学位级别：硕士

研究背景:一直以来,肿瘤作为影响全世界人口死亡的主要原因,已成为威胁人类健康的重大问题之一,也是医学难以解决的难题之一,作为神经系统恶性肿瘤,脑胶质母细胞瘤(GBM)占比率较高,且中位存活率较低,目前治疗尚未有有效的治疗方案,由于... 详细信息

研究背景:一直以来,肿瘤作为影响全世界人口死亡的主要原因,已成为威胁人类健康的重大问题之一,也是医学难以解决的难题之一,作为神经系统恶性肿瘤,脑胶质母细胞瘤(GBM)占比率较高,且中位存活率较低,目前治疗尚未有有效的治疗方案,由于胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤细胞具备可渗透到正常脑组织的固有能力,阻碍了手术根除性治疗,会导致较高的早期复发率。为了更好地了解GBM肿瘤进化和治疗耐药性的决定因素,癌症基因组图谱联盟(TCGA)对近600种GBM肿瘤进行了高维分析和分子分类,TCGA发现了三个与基因组异常密切相关的簇,称为经典(CL)、间充质(MES)和原神经(PN),前期的研究发现三种类型中PN型预后最好,分子层面的差异可能导致了表达亚型的不一致,最终决定预后的不同,近年来,研究发现组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的乙酰化修行为与体内多种肿瘤的发生、发展及预后存在着紧密关联。有研究表明,引起HDAC表达失衡的相关调节因子同时也调节着相关肿瘤细胞的发生,发展与转归,现如今,许多与HDAC相关的调节因子被认为是肿瘤治疗的新靶点,组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)是HDAC家族中的重要一员。近些年来,很多研究证明了,HDAC1影响着身体多种肿瘤的发生和发展,在这些肿瘤中可能发挥促癌或抑癌作用。同时组蛋白脱乙酰酶1的乙酰转移酶活性也有可能影响这些肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,对其生物学行为造成影响,进一步导致了恶性肿瘤的演变专归及预后,我们课题组前期研究发现HDAC1的抑制剂RG2833在GBM细胞生长与亚型表达方面发挥着重要作用,然而抑制剂RG2833发挥何种作用及其机制尚不明确。本研究先利用生物信息学的方法筛选影响肿瘤生存及预后的关键因素,然后观察抑制剂RG2833对脑GBM细胞的生长,侵袭,转移功能的影响,旨在探讨抑制剂RG2833在脑GBM细胞生长生存中的影响作用,研究目的:通过公共数据库筛选不同亚型的GBM,并分析其预后差异,通过细胞培养研究人脑GBM细胞培养的方法,明确HDAC1在不同亚型的GBM中的表达,以及在HDAC1的抑制剂RG2833的作用下对GBM细胞系生长、增殖及侵袭能力的影响。观察在RG2833影响下培养肿瘤细胞的生存生长活性与肿瘤级别之间的关系,探究RG2833与临床药物合用的可能性。研究方法:选取U251细胞系和LN229细胞系,通过基因组表达的不同,将二者划分为GBM不同类型中预后较好的PN型和预后较差的MES型,明确HDAC1在不同亚型的GBM中的表达,我们通过细胞培养,细胞传代,cck8实验,划痕实验,transwell侵袭实验探索在不同浓度RG2833的影响下两种分型的肿瘤细胞系的迁徙和侵袭能力的差别,对照不同亚型,我们比较影响肿瘤细胞生长的最佳抑制浓度。针对MES型胶质母细胞我们通过功能试验来验证RG2833对其的影响。结合临床用药替莫唑胺,研究与RG2833联合用药对GBM细胞的生长侵袭影响。研究结论:一、胶质母细胞瘤的分子亚型影响了肿瘤的转归和病人的预后。二、抑制剂RG2833可以影响胶质母细胞瘤细胞生长侵袭迁移能力且对MES型胶质母细胞瘤有明显的抑制作用。三、RG2833是通过组蛋白去乙酰化对MES型胶质母细胞瘤细胞发挥抑制作用。四、RG2833与替莫唑胺(TMZ)联合用药,抑制MES型胶质母细胞瘤细胞生长更明显。

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儿童急性呼吸道感染病原微生物特征分析及与气象和空气质量的关系

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作者：郑金菊青岛大学

学位级别：硕士

目的导致急性呼吸道感染的病原微生物有很多种,病原微生物的实验室检测对急性呼吸道感染的诊断和治疗起重要作用。了解本地区呼吸道感染病原微生物的分布特征,可以为确诊前的经验治疗提供有用的信息,为急性呼吸道感染的预防与监测提供... 详细信息

目的导致急性呼吸道感染的病原微生物有很多种,病原微生物的实验室检测对急性呼吸道感染的诊断和治疗起重要作用。了解本地区呼吸道感染病原微生物的分布特征,可以为确诊前的经验治疗提供有用的信息,为急性呼吸道感染的预防与监测提供病原学依据,为公共卫生决策的制定提供指导。本研究旨在分析青岛地区儿童急性呼吸道感染病原微生物分布特征,探讨其感染率与气象和空气质量的关系。方法研究对象为2017～2019年在青岛地区两医院就诊的14岁以下急性呼吸道感染儿童。研究分两部分,第一部分采用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence,IFA)检测血清中八种不易用培养法检测的病原微生物Ig M抗体,包括肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia,***)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia,***)、乙型流感病毒(Influenzavirus B,Flu B)、甲型流感病毒(Influenzavirus A,Flu A)、副流感病毒(parainfluenza virus,PIV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、腺病毒(adenovirus,ADV)和嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,***)。第二部分采用常规培养法分离鉴定痰标本中的病原菌。从中国气象局网站收集青岛地区的气象数据,从中国环境监测总站网站收集青岛市区的空气质量数据,统计分析不同性别、年龄、季节间病原微生物感染率的差异,以气象参数和空气质量指标为自变量,以月感染率为因变量,采用线性回归分析感染率与各气象参数和空气质量指标之间的关系。结果(1)Ig M抗体检测结果显示,纳入研究的39770例儿童总感染率58.11%(23111/39770),感染率最高的是肺炎支原体(46.78%),其次是Flu B(25.22%)、Flu A(8.54%)、RSV(4.86%)、PIV(4.32%)、ADV(1.50%)、肺炎衣原体(1.42%)和嗜肺军团菌(0.58%)。阳性病例中,54.75%(12654/23111)感染一种病原微生物,45.25%(10457/23111)感染两种及以上。总感染率女性高于男性(x=103.112,P<0.001),6～<10岁组最高(81.43%,4263/5235),新生儿组最低(4.48%,29/347)。RSV感染率1岁以内最高,其他7种病原微生物感染率1岁以内最低。肺炎支原体月感染率均在40%以上,呈全年高发趋势,线性回归分析显示与气象参数和空气质量指标间无相关性。RSV感染存在冬季感染高峰,与温度呈负相关(b=-0.127,P=0.003),与二氧化硫(SO)呈正相关(b=0.314,P<0.001)。Flu A感染与SO浓度负相关(b=-0.638,P<0.001),ADV感染与SO浓度正相关(b=0.136,P<0.001)。(2)2018～2019年共收集来自14942例儿童的痰标本16136份,其中阳性标本1435份,感染率8.89%(1435/16136)。最多的三种病原菌分别是肺炎链球菌(2.27%,367/16136)、金黄色葡萄球菌(1.97%,318/16136)和肺炎克雷伯菌(0.89%,143/16136)。冬春季为感染高峰。新生儿感染率最高(15.16%,224/1478),以金黄色葡萄球菌为主。金黄色葡萄球菌感染与风速正相关(b=1.184,P=0.001),肺炎链球菌感染与温度负相关(b=-0.077,P=0.001),与多数空气污染物PM、PM等呈弱正相关。结论(1)青岛地区儿童八种呼吸道病原微生物感染率58.11%,以肺炎支原体和流感病毒最常见。(2)SO浓度升高可增加RSV和ADV的感染风险,但不增加Flu A感染风险。(3)呼吸道病原菌感染率相对较低,感染率8.89%,肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌是最常见的病原菌。(4)多数空气污染物可增加肺炎链球菌的感染风险。

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大脑中动脉瘤开颅手术与血管内治疗效果的单中心对比分析

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作者：林强青岛大学

学位级别：硕士

背景:大脑中动脉瘤(Middle cerebral artery aneurysm,MCAA)是有较高的发病率的常见颅内动脉瘤。开颅手术治疗目前仍是治疗MCAA的首选方式。但近年来,随着介入材料和技术发展,血管内治疗是也成为治疗MCAA的重要选择,并逐渐被人们接受。... 详细信息

背景:大脑中动脉瘤(Middle cerebral artery aneurysm,MCAA)是有较高的发病率的常见颅内动脉瘤。开颅手术治疗目前仍是治疗MCAA的首选方式。但近年来,随着介入材料和技术发展,血管内治疗是也成为治疗MCAA的重要选择,并逐渐被人们接受。但目前两种手术各有优劣,因此MCAA治疗方式仍存在争议。目的:通过回顾我院大脑中动脉瘤开颅治疗和血管内治疗的患者的疗效,探讨两种手术方式对治疗大脑中动脉瘤的不同特点,并为今后治疗MCAA提供临床参考和指导。方法:回顾性分析青岛大学附属医院神经外科自2015年1月至2016年12月收治的大脑中动脉瘤患者的临床资料,对两种治疗方式的患者术前情况、术中术后不良事件的发生、出院时临床结果、随访结果等进行统计学分析。结果:共纳入Hunt-Hess3级及以下的83例大脑中动脉瘤的患者的信息,其中行开颅手术治疗54例,行血管内治疗29例患者,术前相关资料统计学无明显差异。出院临床预后不良率(mRS>3)中开颅治疗组为13.0%,血管内治疗组为3.4%;开颅治疗组手术相关不良事件发生率为31.5%,血管内治疗组为10.3%,两者比较P值<0.05,统计学有差异;半年随访不良预后率,开颅治疗组(5.6%)高于血管内治疗组;开颅治疗组复发率(1.9%)低于血管内治疗组(6.9%);住院时长和住院花费的比较,P值均<0.05,统计学有差异。结论:开颅手术治疗及血管内治疗对于大脑中动脉瘤患者的动脉瘤出院临床评估及半年随访评估没有明显差异,但是开颅手术治疗有着更高的预后不良率。开颅手术治疗有着较多术中及术后不良事件及长的住院时间,而血管内治疗则可能花费更过的住院费用。开颅手术治疗仍是MCAA治疗的主要治疗方式,但血管内治疗也是安全有效的治疗手段,且有着较好的发展前景。仍需大样本随机试验进一步验证。

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