检索结果-南通市图书馆

作者：詹艺凌北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bt)是分布广泛的革兰氏阳性菌,能够在生长过程中产生具有杀虫活性的晶体蛋白。几丁质结合蛋白(Chitin binding protein,CBP)是能够与几丁质发生特异性结合的一类蛋白质。几丁质是昆虫围食膜的重要组成成分,围食膜是昆虫... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bt)是分布广泛的革兰氏阳性菌,能够在生长过程中产生具有杀虫活性的晶体蛋白。几丁质结合蛋白(Chitin binding protein,CBP)是能够与几丁质发生特异性结合的一类蛋白质。几丁质是昆虫围食膜的重要组成成分,围食膜是昆虫防御病毒、细菌等侵害的重要的保护屏障。研究表明,几丁质结合蛋白能够促进多种杀虫蛋白的杀虫活性,提高杀虫效率。Bt HD73基因组编码两种几丁质结合蛋白,CBP-3189和CBP-3152。实验室前期研究表明CBP-3189能够与昆虫围食膜、HD73细胞壁结合且不具有几丁质酶活性。实验室前期已经成功获得含有CBP-3189蛋白与GFP蛋白融合表达载体的工程菌株HD73(pHT-3189-gfp)。本文旨在对几丁质结合蛋白的功能进行研究。首先,通过生物信息学分析了解蛋白结构信息,预测蛋白功能,为实验研究提供一定基础;其次,通过激光共聚焦显微镜观察,分析蛋白的表达及定位;同时模拟昆虫中肠碱性环境,通过激光共聚焦显微镜观察及QPCR分析研究碱诱导对基因转录的影响;最后,通过突变株构建及突变株特性研究,研究HD73几丁质结合蛋白的相关功能特性,为进一步研究苏云金芽胞杆菌的昆虫侵染机理提供一定的理论基础和参考意义。生物信息学分析预测CBP-3189蛋白具有N端信号肽,一个N端CBD,两个FN3及一个C端CBM2四个结构域,并且预测亚细胞定位为细胞壁及底物结合位点为GLU-312,TRP-334,ILE-341和VAL-382;预测CBP-3152蛋白不具有信号肽,亚细胞定位未知且只具有一个CBD结构域,底物结合位点为TRP-183,GLU-184,ILE-185和PHE-192。蛋白定位研究表明,CBP-3189蛋白在稳定期T8时期开始表达并聚集于菌体形成晶体的一端,随着时间的推移,蛋白表达逐渐加强至细胞裂解前最多;细胞起始裂解,蛋白表达也开始减少直至停止表达;碱诱导对基因转录的影响研究表明,碱诱导明显影响基因的表达,CBP-3189蛋白在诱导后开始表达并随着诱导时间的推移,蛋白表达量逐渐加大;实验成功构建了敲除载体pRN5101Ω3152和pRN5101Ω3189。突变株HD73(?3189)的特性研究表明,CBP-3189基因与Bt HD73的生长没有密切关系;突变株的围食膜结合能力与野生型无明显差异。

关键词：苏云金芽胞杆菌几丁质结合蛋白碱诱导表达

苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白Cry1le和亚洲玉米螟围食膜结合机理的研究

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苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白Cry1le和亚洲玉米螟围食膜结合机理的研究

作者：冯冬梅北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）可以在其芽胞形成时期产生特异性很强的杀虫晶体蛋白。cry1Ie基因在苏云金芽胞杆菌中由于其上游存在转录终止子而沉默不表达，将该基因克隆于大肠杆菌中可表达由719个氨基酸组成的Cry1Ie... 详细信息

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）可以在其芽胞形成时期产生特异性很强的杀虫晶体蛋白。cry1Ie基因在苏云金芽胞杆菌中由于其上游存在转录终止子而沉默不表达，将该基因克隆于大肠杆菌中可表达由719个氨基酸组成的Cry1Ie蛋白，对小菜蛾(Plutella xylostella)、玉米螟(Ostrinia furnacalis)和大豆食心虫(Leguminivora glycinivorel)具有较高的杀虫活性。克隆并表达于大肠杆菌的IE648蛋白对应于Cry1Ie蛋白N-端的648个氨基酸残基，相比于全长蛋白具有更高的杀虫活性。Cry蛋白通过与昆虫中肠上皮上的受体结合发挥毒性，围食膜是Cry毒素在与中肠作用之前必须穿过的一层重要的半透性保护屏障，主要由几丁质和蛋白质组成。本论文主要围食膜的组成出发，从蛋白质和几丁质结合两个方面，研究了Cry1Ie蛋白与昆虫围食膜的结合。从围食膜整体出发，本研究组前期竞争性结合研究结果表明IE648及Cry1Ie蛋白结构域Ⅲ都能与亚洲玉米螟围食膜发生结合，但是结构域II由于表达为沉淀没有确定其在结合中的作用。本论文通过包涵体溶解复性的方法将结构域II溶解并通过亲和层析进行纯化，竞争性结合实验结果表明结构域II能够与IE648竞争结合围食膜。同时，通过合成肽段的竞争性结合实验研究了保守肽段、部分非保守肽段、在与中肠结合中发挥作用的特殊肽段以及结构域Ⅲ的loop区肽段在与昆虫围食膜结合中的作用，实验结果显示结构域Ⅲ的loop区L8肽段能够与IE648竞争围食膜的结合位点，其余大部分肽段不能够竞争围食膜上的作用靶点。在蛋白质结合方面，结构域Ⅱ与玉米螟围食膜的体外结合印迹实验显示它也可以与围食膜蛋白发生结合,与之结合的围食膜蛋白分子量大小在25-35kDa之间，情况与IE648及结构域Ⅲ吻合，但结合条带较为单一。牛血清白蛋白（Bovine SerumAlbumin，BSA）与玉米螟围食膜的体外结合印迹实验表明BSA也可与之发生结合，但仔细分析发现与BSA结合的围食膜蛋白和与Cry蛋白结合的围食膜蛋白分子量大小差异显著。表明外源蛋白与围食膜蛋白的结合存在特异和非特异性结合，且结合位点不同。在几丁质结合方面，本论文通过体外结合实验，发现IE648及Cry1Ie蛋白的三个结构域都能够与不溶于水的几丁质发生结合，对Cry蛋白与几丁质结合的研究并未见文献报导过，本研究尚属首次。通过基于氨基酸序列的活性位点预测、结构预测、空间结构比对等信息学分析方法研究了三个结构域和围食膜结合的结构基础，分析结果印证了结构域Ⅱ和结构域Ⅲ可能参与糖结合作用，但其具体作用机制和特异性还需要进一步实验研究。

关键词：苏云金芽胞杆菌 Cry1Ie 亚洲玉米螟围食膜结构域肽段

苏云金芽胞杆菌的蛋白分泌系统分析及蛋白分泌表达研究

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苏云金芽胞杆菌的蛋白分泌系统分析及蛋白分泌表达研究

作者：陈海波北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)和Bt制剂是目前世界上应用最广泛的生物农药。Bt是革兰氏阳性细菌,只有一层细胞膜结构,并且能够产生大量的胞外蛋白,是潜在的蛋白分泌表达工程菌。目前以构建Bt蛋白分泌表达工程菌为目的的研... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)和Bt制剂是目前世界上应用最广泛的生物农药。Bt是革兰氏阳性细菌,只有一层细胞膜结构,并且能够产生大量的胞外蛋白,是潜在的蛋白分泌表达工程菌。目前以构建Bt蛋白分泌表达工程菌为目的的研究很少。本文从以下方面进行了研究:以signalP 4.1、TatP 1.0、LipoP 1.0分析Bt HD73全部蛋白的信号肽种类,psorb3.0.4分析蛋白的亚细胞定位。发现利用信号肽进行分泌和定位的蛋白中含Sec信号肽最多、Tat类次之,Lipo信号肽蛋白最少。Lipo途径的大部分蛋白含Sec信号肽。含信号肽蛋白种类分为:转运类蛋白、芽胞形成和萌发相关蛋白、毒力蛋白、环境适应蛋白、表达调控蛋白、能量代谢蛋白、细胞表面蛋白、酶类,大部分通过Sec和Tat信号肽分泌,表达调控和能量代谢蛋白只通过Tat途径分泌或定位。在构建Bt工程菌时,为减少原细胞胞外背景蛋白和分泌蛋白的降解,胶原酶、肽酶、淀粉酶、bacillolysin等分泌蛋白以及PlcR调节子均可以敲除。绘制了Bt HD73(WT)和Bt HD73(△PlcR)在LB中的生长曲线,两者的T0的OD≈2.6,对数生长期倍增时间分别为36min和39min,敲除PlcR对细胞生长和形态没有影响。对比Bt HD73(WT)和Bt HD73(△PlcR)不同时期胞外蛋白,敲除PlcR导致毒力类蛋白缺失;Bt的胞外蛋白量随培养时间增加而减少。通过Q-TOF确定了Bt HD73在T0前后产生量最多的11个蛋白,为高效分泌表达提供了信号肽信息。构建了pHT315-αA3-1661-his质粒,该质粒是大肠杆菌和Bt的穿梭质粒,含有组成型启动子αA3,pET21b的his tag和终止序列,BamH I和Sal I酶切位点。利用含HD733661质粒pHT315-αA3-1661-his转入Bt HD73进行表达分析,通过分析蛋白表达分泌情况、Ni柱亲和层析和Western Blot验证产生了带his tag分泌蛋白。本文对Bt HD73全部蛋白的信号肽种类进行了分析,比较了Bt HD73(WT)Bt HD73(△PlcR)产生的蛋白种类,确定了表达量最大的11个分泌蛋白,初步构建了在Bt HD73中的分泌表达载体并验证了功能。为研究Bt的分泌蛋白、构建高效的Bt分泌表达工程菌提供思路和基础。

关键词：苏云金芽胞杆菌分泌途径表达载体高效分泌表达工程菌

苏云金芽胞杆菌与鳞翅目昆虫围食膜的粘附研究

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苏云金芽胞杆菌与鳞翅目昆虫围食膜的粘附研究

作者：仝宗兴北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种昆虫病原菌,昆虫中肠内腔的高p H环境正是Bt发挥其杀虫活性的必要条件,目前的研究多关注于其产生的杀虫晶体蛋白的分子作用机理,而从细胞层面,在这种极端的环境条件下,菌体侵染昆虫宿... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种昆虫病原菌,昆虫中肠内腔的高p H环境正是Bt发挥其杀虫活性的必要条件,目前的研究多关注于其产生的杀虫晶体蛋白的分子作用机理,而从细胞层面,在这种极端的环境条件下,菌体侵染昆虫宿主的首要步骤是粘附,对于其粘附和生存的分子机制至今仍不清楚。昆虫的中肠有一层包裹食物的膜状结构,主要由几丁质和蛋白质组成,被命名为围食膜(Peritrophic Matrix,PM),是昆虫的第一道天然的保护屏障。Bt除了可以产生具有杀虫活性的伴胞晶体以外,还可以产生很多具有非杀虫活性的胞外大分子物质,例如几丁质结合蛋白(Chitin binding protein,CBP)、蛋白酶、脂肪酶等,这些大分子物质不仅可以促进Bt对昆虫毒性作用的发挥,同时也有利于Bt成功的在宿主体内生长和繁殖。Bt HD73菌株可以产生两种分泌型几丁质结合蛋白,分别由cbp3189基因和cbp3152基因编码,其中cbp3189基因可以在碱性条件下被诱导表达,我们将其命名为cbp A。将cbp A基因克隆后于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得由几丁质亲和层析纯化的CBPA蛋白,同时也证实了其具有几丁质结合能力,但是经几丁质酶活性测定实验可知,该蛋白不具有几丁质酶的活性。CBPA为分泌表达,通过构建与gfp基因的融合表达,检测到CBPA定位于细胞壁以及芽胞表面;通过构建与lac Z基因的融合表达,验证了cbp A基因启动子的碱诱导特性。为了进一步研究CBPA在Bt毒杀昆虫中的作用,我们通过体内实验对比了HD73野生株与Δcbp A突变株粘附围食膜的差异以及杀死昆虫的毒性差异,结果显示,HD73野生株可以粘附于大蜡螟的围食膜上,而Δcbp A突变株不能粘附,且对于亚洲玉米螟来说,HD73野生株的晶胞混合物的杀虫活性远远高于Δcbp A突变株。所以,在昆虫中肠的碱性环境下,CBPA可以被顺利诱导,表达于细胞壁和芽胞表面,通过与围食膜上的几丁质相结合,帮助Bt粘附于昆虫肠道,进一步发挥其毒性。

关键词：苏云金芽胞杆菌粘附碱性环境围食膜几丁质结合蛋白

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苏云金芽胞杆菌伴胞晶体的微胶囊制备

苏云金芽胞杆菌伴胞晶体的微胶囊制备

作者：贺晓琳北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)能够产生具有杀虫活性的伴胞晶体,该类伴胞晶体对系列靶标昆虫幼虫具有特异性的杀虫活性,而对脊椎动物和植物无害,是一类环境友好型生物杀虫剂,在植物保护领域占有相当大的比重。然而,高... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)能够产生具有杀虫活性的伴胞晶体,该类伴胞晶体对系列靶标昆虫幼虫具有特异性的杀虫活性,而对脊椎动物和植物无害,是一类环境友好型生物杀虫剂,在植物保护领域占有相当大的比重。然而,高温、干燥、紫外辐射等外界不良环境都有可能导致伴胞晶体的杀虫活性降低甚至失活,影响其商业应用。为了增强伴胞晶体对环境的抵抗力,延长杀虫持效期,多种Bt剂型相继发展。基于此,本研究进行了一种新的伴胞晶体微胶囊剂型的研究。分别以苏云金芽胞杆菌Cry8Ca2球形晶体和Cry1Ac菱形晶体为核心,以壳聚糖、海藻酸钠和羧甲基纤维素钠等生物聚合物材料为壁材,通过层层自组装技术成功制备新型晶体微胶囊。扫描电镜显示,Cry8Ca2晶体微胶囊尺寸约为0.6?0.8μm,Cry1Ac晶体微胶囊尺寸约为0.6?1.2μm,均适合喷洒与昆虫饲喂。Cry1Ac晶体微胶囊能够在与靶标昆虫中肠相似的pH 9.0以上的环境中大量释放晶体蛋白,而在水环境中保持对伴胞晶体的稳定包封,延长了杀虫持效期。Cry8Ca2晶体微胶囊能够在pH 10.2的碱性环境大量释放晶体蛋白,说明微胶囊的控释pH因其内部包裹的晶体种类不同而有所不同。杀虫活性测定表明,Cry1Ac晶体微胶囊剂型与Cry1Ac晶体芽胞混合物具有基本相同的杀虫活性,且应用的生物材料对幼虫无毒副作用。对环境的抵抗力研究表明,晶体微胶囊能够抵抗高温、紫外和干燥环境,提高囊内伴胞晶体杀虫活性的稳定性。本研究中直接以伴胞晶体为核心制备的微胶囊在一定程度上降低了微胶囊的制作成本,同时使用的壁材均为价格低廉的具有生物相容性和生物可降解性的生物聚合物材料。这是一种保护Bt晶体蛋白的新方法,为提高Bt的应用稳定性提出新的解决策略,并奠定了良好的实验基础。

关键词：苏云金芽胞杆菌微胶囊 Cry8Ca2晶体 Cry1Ac晶体

苏云金芽胞杆菌中M23/37家族蛋白酶的结构和功能研究

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苏云金芽胞杆菌中M23/37家族蛋白酶的结构和功能研究

作者：王丹丹北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)作为目前世界上应用最广泛的生物农药，自发现以来一直备受关注。但Bt在田间的应用仍然面临很大困难，其中最大的问题是杀虫晶体蛋白容易受到各种环境因素的影响而降解。随着科学的发展... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)作为目前世界上应用最广泛的生物农药，自发现以来一直备受关注。但Bt在田间的应用仍然面临很大困难，其中最大的问题是杀虫晶体蛋白容易受到各种环境因素的影响而降解。随着科学的发展，越来越多的新技术和新思路被提出并应用到杀虫蛋白的保护研究中，其中构建抑制细胞裂解的工程菌是一种天然、理想的途径。细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，所以找到关键的肽聚糖水解酶基因并构建相应突变株，就有可能在不影响杀虫活性的前提下实现对杀虫蛋白的保护。M23/37家族蛋白酶具有水解肽聚糖的功能，因此表现出很大的潜力和前景。 BtD73菌株的全基因组序列已经公布，一些与母细胞裂解有关的基因也得到了初步研究，但是Bt中的M23/37家族蛋白酶尚未得到探索，本论文即在此背景下对Bt中M23/37家族蛋白酶的结构和功能做了初步研究。首先对BtD73中两个M23/37家族蛋白酶(HD73859、HD73661)进行了二级结构、三级结构、催化结构域、活性位点等方面的生物信息学分析，并预测这两个分泌蛋白酶为肽聚糖水解酶，可能具有酶解肽聚糖和弹性蛋白的潜力。然后分别克隆表达了HD73859、HD73661蛋白及对应的一系列截短蛋白，通过酶解实验和体外细胞壁结合实验证明，这两个蛋白都可以结合BtD73细胞壁，但对细胞壁、Cry1Ac晶体、BSA蛋白没有明显的水解现象，这可能是因为M23家族蛋白酶在异源宿主中表达不出活性形式所致。针对遇到的上述问题改变了研究方法，一方面通过构建HD73661-GFP融合表达蛋白，在原宿主BtD73中对HD73661蛋白进行了定位，结果显示该蛋白主要结合于细胞的细胞壁、芽胞壁;另一方面构建了基因HD73661的突变株HD(1661)并对其部分性状进行了初步的实验分析，结果显示，突变株在细胞分裂分离方面与野生株存在比较明显差异。这些结果一定程度上从侧面验证了这两个酶是肽聚糖水解酶。总之，本实验初步研究了M23/37家族蛋白酶在Bt中的结构和功能，为进一步研究Bt分泌蛋白酶的功能提供了一定的理论和实验依据;同时为构建新一代抗逆性强、持效期长、高效广谱的Bt工程菌提供了思路和线索。

关键词：苏云金芽胞杆菌肽聚糖水解酶 HD730859 HD731661 M23/37家族

苏云金芽胞杆菌LM1212晶体细胞分化相关转录因子的鉴定

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苏云金芽胞杆菌LM1212晶体细胞分化相关转录因子的鉴定

作者：马丽霞北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)LM1212菌株的芽胞和晶体在不同细胞内产生,具有细胞分化现象。使用Pacbio RSII测序平台对LM1212菌株进行了测序,得到了6320549bp的全基因组图谱。LM1212菌株有1个genome和8个质粒,共有12个cry... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)LM1212菌株的芽胞和晶体在不同细胞内产生,具有细胞分化现象。使用Pacbio RSII测序平台对LM1212菌株进行了测序,得到了6320549bp的全基因组图谱。LM1212菌株有1个genome和8个质粒,共有12个cry/cyt基因分别位于质粒pLM248、pLM158及pLM113上。采用高温法对含有cry35-like基因启动子与lacZ基因融合质粒的LM(p35’Z)菌株的内源大质粒基因进行缺失。筛选得到两株质粒基因缺失突变株LM(p35’Z)-W菌株和LM(p35’Z)-DB菌株,且cry35-like基因启动子P的活性在这两株菌中受到影响;激光共聚焦扫描显微镜和光学显微镜观察、芽胞形成率分析及利用SDS-PAGE和LC-MS/MS(Q-TOF)质谱分析质粒基因缺失对LM1212细胞分化和晶体蛋白表达的影响,结果表明LM(p35’Z)-DB菌株形成更多晶体产生细胞,LM(p35’Z)-W菌株形成较少晶体产生细胞;LM(p35’Z)-DB菌株晶体蛋白产量提高,LM(p35’Z)-W菌株晶体蛋白产量减少。基于pLM248的orf设计了一系列引物鉴定缺失区域,发现在LM(p35’Z)-W菌株中的pLM248上缺失的orf28-32可能对P启动子表达起着重要的作用。为了验证orf28-32片段在LM1212中的功能,选取缺失orf28-32片段的LM(p35’Z)-W菌株作为实验菌株,通过高温无抗性培养筛选到缺失p35’Z载体的LM(p35’Z)-W?p35’Z菌株。将pHT304-orf28-29载体及pHT304-orf28-32转进LM(p35’Z)-W?p35’Z菌株,结果表明orf28-29及orf28-32均可提高晶体细胞比例,对LM1212细胞分化产生影响。SDS-PAGE分析发现orf28-29及orf28-32均可提高晶体蛋白产量。将orf28编码的转录因子命名为CpcR(Crystal producer cell regulator)。LM(p35’gfp)菌株携带P启动子融合gfp的表达载体,使用激光共聚焦扫描显微镜观察LM(p35’gfp)菌株从T0到T4共5个时间点的gfp基因表达情况,结果表明LM1212菌株在T2开始了分化。分别提取LM(p35’gfp)菌株,LM(p35’Z)-W菌株和LM(p35’Z)-DB菌株从T0到T4的总RNA进行测序,分别得到了以上三株菌分化前后5个时间点的转录组数据,为后续分析转录因子CpcR的调控基因及通过分析差异表达基因的结合蛋白进而找出其它调控分化的转录因子奠定了基础。

关键词： LM1212菌株质粒基因缺失晶体蛋白细胞分化转录因子CpcR

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苏云金芽胞杆菌的分泌蛋白组研究

苏云金芽胞杆菌的分泌蛋白组研究

作者：王智文北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在产生芽胞的同时可以产生具有杀虫活性的晶体蛋白,是一种应用广泛的微生物杀虫剂。作为一种革兰氏阳性菌,细胞壁成分简单,胞外蛋白分泌到培养基时无需穿过细胞壁外膜,是一种良好的分泌表达... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在产生芽胞的同时可以产生具有杀虫活性的晶体蛋白,是一种应用广泛的微生物杀虫剂。作为一种革兰氏阳性菌,细胞壁成分简单,胞外蛋白分泌到培养基时无需穿过细胞壁外膜,是一种良好的分泌表达外源蛋白的候选宿主。然而Bt分泌的蛋白水解酶可能会影响目标蛋白的产量。因此,研究Bt分泌蛋白组,可为后续敲除蛋白水解酶基因,构建苏云金芽胞杆菌分泌表达宿主奠定基础。将Bt在对数期与过渡期的转折点定为T0,T0前1 h为T-1,T0后1 h为T1、2h为T2,依此类推。本研究探索制备Bt胞外蛋白样品的方法,并对其进行了优化,采用电泳切胶的方式去除培养基中的干扰蛋白,经胶内酶解后质谱检测了BtD73在LB培养基中T-1、T1、T5、T14、T21等5个时期的分泌蛋白质,并以BtD73基因组数据库对质谱结果进行检索,分析各时期分泌蛋白的种类、含量。结果表明,BtD73各时期共鉴定得到177个胞外蛋白,在T-1和T1时产生的胞外蛋白质大部分为酶类,且主要为水解酶,在T5时期产生的胞外蛋白种类最丰富,而在T21时期,胞外蛋白种类显著减少,噬菌体蛋白含量最多。对分泌蛋白酶作进一步分析发现,HD73118(peptidase P60),HD73638(peptidase M24),HD73859(peptidase M24),HD73744(peptidase M6),HD73513(peptidase M6)和HD73219(leucyl aminopeptidase)含量较多,构建苏云金芽胞杆菌分泌表达宿主,可敲除这些蛋白水解酶基因,避免对目标蛋白产生降解作用。本研究成功构建筛选得到蛋白酶缺失菌株HD73-Δ0859。信号肽库是提高分泌表达效率的重要工具,本研究利用生物信息学软件预测分泌蛋白的信号肽和信号序列,总结了经典途径分泌的蛋白的Sec型信号肽、Tat型信号肽、脂蛋白信号肽以及非经典途径分泌的蛋白的信号序列,建立了Bt信号肽库。本研究致力于研究苏云金芽胞杆菌在丰富培养基的生长过程中分泌蛋白的类型和含量,尤其是胞外蛋白酶,并建立了制备BtD73胞外蛋白样品的方法,构建了Bt信号肽库,为后续将Bt作为分泌表达候选宿主、优化分泌表达及提高分泌效率奠定了基础,对充分了解该菌的杀虫机理和扩大该菌的应用具有重要意义。

关键词：苏云金芽胞杆菌分泌蛋白质胞外蛋白酶信号肽

转录因子Crp调控的乳酸代谢在苏云金芽胞杆菌碱适应中的作用

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转录因子Crp调控的乳酸代谢在苏云金芽胞杆菌碱适应中的作用

作者：孙中芹北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thurigiensis,Bt）属革兰氏阳性菌,因其特异性的杀虫活性,成为目前应用最为广泛的微生物杀虫剂。鳞翅目昆虫是Bt的重要靶标之一,其中肠的碱性环境是Bt发挥其杀虫活性的必要条件,因此探索Bt在碱性条件下的适应... 详细信息

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thurigiensis,Bt）属革兰氏阳性菌,因其特异性的杀虫活性,成为目前应用最为广泛的微生物杀虫剂。鳞翅目昆虫是Bt的重要靶标之一,其中肠的碱性环境是Bt发挥其杀虫活性的必要条件,因此探索Bt在碱性条件下的适应机制具有重要意义。本研究分析了L-乳酸代谢在Bt碱适应性中的作用,以及转录因子Crp对L-乳酸代谢的调控作用。前期研究发现,在碱刺激条件下,芽胞杆菌的生长先出现停滞现象,经过一段时间适应后恢复生长。本研究发现,在加入不同浓度NaOH时,Bt HD73菌株的恢复生长pH保持在8.9-9.1范围内,且随着加碱浓度的增加,所需恢复生长时间越长,说明碱适应性对Bt HD73菌株的恢复生长十分重要。前期研究表明,碱刺激诱导ldh2和crp基因的转录活性显著上调。利用前期构建的ldh2和crp基因的启动子与lac Z融合质粒,通过β-半乳糖苷酶活性测定证实了上述结果。5`-RACE实验表明ldh2基因的转录起始位点位于其起始密码子上游的第11个碱基“G”。生物信息学分析发现ldh2基因的启动子区域含有与转录因子Crp识别的保守结合位点。β-半乳糖苷酶活性的检测发现,与野生型HD73相比,在crp基因缺突变株HD（△crp）中ldh2基因的转录活性显著下调。本研究成功表达和纯化了Crp蛋白,通过凝胶阻滞实验发现Crp可以与ldh2基因启动子区域直接结合,说明转录因子Crp正调控ldh2基因的转录。通过培养基中乳酸含量的测定,发现在碱性条件下HD（△ldh2）及HD（△crp）菌株产生的乳酸明显低于野生型菌株;HD（△ldh2）及HD（△crp）菌株加碱后恢复生长变慢,说明乳酸代谢参与了苏云金芽胞杆菌的碱适应过程;通过生物活性检测对比了野生型菌株与突变体菌株对昆虫的杀虫活性,发现野生型菌株晶胞混合物的杀虫活性显著高于突变体。以上结果均说明碱适应性对于苏云金芽胞杆菌侵染昆虫十分重要。

关键词：苏云金芽胞杆菌乳酸代谢碱适应性 ldh2 转录因子Crp