苏云金芽胞杆菌的分泌蛋白组研究

作     者：王智文 

作者单位：北京理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭淑元

授予年度：2016年

学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：苏云金芽胞杆菌 分泌蛋白质 胞外蛋白酶 信号肽 

摘      要：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在产生芽胞的同时可以产生具有杀虫活性的晶体蛋白,是一种应用广泛的微生物杀虫剂。作为一种革兰氏阳性菌,细胞壁成分简单,胞外蛋白分泌到培养基时无需穿过细胞壁外膜,是一种良好的分泌表达外源蛋白的候选宿主。然而Bt分泌的蛋白水解酶可能会影响目标蛋白的产量。因此,研究Bt分泌蛋白组,可为后续敲除蛋白水解酶基因,构建苏云金芽胞杆菌分泌表达宿主奠定基础。将Bt在对数期与过渡期的转折点定为T0,T0前1 h为T-1,T0后1 h为T1、2h为T2,依此类推。本研究探索制备Bt胞外蛋白样品的方法,并对其进行了优化,采用电泳切胶的方式去除培养基中的干扰蛋白,经胶内酶解后质谱检测了BtD73在LB培养基中T-1、T1、T5、T14、T21等5个时期的分泌蛋白质,并以BtD73基因组数据库对质谱结果进行检索,分析各时期分泌蛋白的种类、含量。结果表明,BtD73各时期共鉴定得到177个胞外蛋白,在T-1和T1时产生的胞外蛋白质大部分为酶类,且主要为水解酶,在T5时期产生的胞外蛋白种类最丰富,而在T21时期,胞外蛋白种类显著减少,噬菌体蛋白含量最多。对分泌蛋白酶作进一步分析发现,HD73118(peptidase P60),HD73638(peptidase M24),HD73859(peptidase M24),HD73744(peptidase M6),HD73513(peptidase M6)和HD73219(leucyl aminopeptidase)含量较多,构建苏云金芽胞杆菌分泌表达宿主,可敲除这些蛋白水解酶基因,避免对目标蛋白产生降解作用。本研究成功构建筛选得到蛋白酶缺失菌株HD73-Δ0859。信号肽库是提高分泌表达效率的重要工具,本研究利用生物信息学软件预测分泌蛋白的信号肽和信号序列,总结了经典途径分泌的蛋白的Sec型信号肽、Tat型信号肽、脂蛋白信号肽以及非经典途径分泌的蛋白的信号序列,建立了Bt信号肽库。本研究致力于研究苏云金芽胞杆菌在丰富培养基的生长过程中分泌蛋白的类型和含量,尤其是胞外蛋白酶,并建立了制备BtD73胞外蛋白样品的方法,构建了Bt信号肽库,为后续将Bt作为分泌表达候选宿主、优化分泌表达及提高分泌效率奠定了基础,对充分了解该菌的杀虫机理和扩大该菌的应用具有重要意义。