检索结果-南通市图书馆

作者：肖霞河北医科大学

学位级别：硕士

目的:细胞周期素(cyclins)是一种细胞周期调控子,其表达水平随细胞周期各时相的转换而改变。不同的cyclins在不同时期通过与相应的周期素依赖性激酶(CDK)结合和分离,导致其底物磷酸化及去磷酸化,对细胞周期的各阶段进行调控。cyclin H... 详细信息

目的:细胞周期素(cyclins)是一种细胞周期调控子,其表达水平随细胞周期各时相的转换而改变。不同的cyclins在不同时期通过与相应的周期素依赖性激酶(CDK)结合和分离,导致其底物磷酸化及去磷酸化,对细胞周期的各阶段进行调控。cyclin H与其他cyclins所不同的是,cyclin H的表达在整个细胞周期过程中不呈周期性变化。cyclin H是一种新的细胞周期素,可以增强CDK7的磷酸化功能并激活其他CDKs。因此,人们推测,CDK7/cyclin H复合物极有可能是细胞周期CDK/cyclins级联反应进程中的上游元件。目前的研究资料显示:cyclin H、CDK7在肿瘤组织中的表达水平明显高于非肿瘤组织,其过度表达可催化CDK分子的异常活化,导致细胞过度增殖。故此,可将它作为一种新的增殖指标对指导临床化疗及判断肿瘤转归及预后有重要意义。现阶段国内外学者大多涉及实体瘤(如胃癌、结肠癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤等)的研究,关于在白血病中的研究资料很少,国内尚未见报道。本研究旨在检测CDK7/cyclin H mRNA在白血病中表达并分析其临床意义。希望为探讨白血病的发病机制、判断疗效及指导治疗有帮助。方法:研究对象为101例急性白血病(AL)患者(其中包括69例初治患者、13例复发患者和19例持续完全缓解期患者),15名健康人做正常对照。应用半定量RT-PCR方法检测骨髓单个核细胞cyclin H、CDK7 mRNA表达水平及P53、cyclin E2、CDK2 mRNA表达水平。结果: 1在白血病细胞株HL60、K562中cyclin H mRNA均呈阳性表达。在AL患者中,69例初治组患者阳性率为66.7%(46/69),表达水平为(0.9100±0.6559);13例复发组患者阳性率为76.9%(10/13),表达水平为(0.9600±0.5045);19例缓解组患者阳性率为36.8%(7/19),表达水平为(0.5505±0.2663);而用同一实验条件在15名正常人中仅有3例呈阳性表达,阳性率为20%,表达水平为(0.3420±0.2352)。初治组和复发组阳性率和表达水平明显高于缓解组和正常对照组(P0.05),缓解组和对照组比较没有统计学意义(P>0.05)。对69例初治AL患者进行疗效评估,45例获得CR,CR率为65.2%。其中cyclin H mRNA阳性表达的AL患者其CR率(56.5%)明显低于cyclin H阴性表达者的CR率(82.6%),(χ2=4.600,P0.05),差别没有统计学意义,这可能与观察时间较短,复发例数少有关系,尚需进一步随访观察。2在白血病细胞株HL60、K562中CDK7 mRNA均呈阳性表达。在AL患者中,初治组患者阳性率为65.2%(45/69),表达水平为(1.0612±0.5786);13例复发组患者阳性率为84.6%(11/13),表达水平为(1.1908±0.6863);19例缓解组患者阳性率为36.8%(7/19),表达水平为(0.7532±0.1738);而用同一实验条件在15名正常人中仅有3例呈阳性表达,阳性率为20%,表达水平为(0.6453±0.2523)。初治组和复发组阳性率和表达水平明显高于缓解组和正常对照组(P0.05),缓解组和对照组比较没有统计学意义(P>0.05)。对69例初治白血病患者进行疗效评估,其中45获得CR,CR率为65.2%。其中CDK7 mRNA阳性表达的AL患者其CR率(55.6%)明显低于CDK7阴性表达者的CR率(83.3%),(χ2=5.324,P0.05),差别没有统计学意义,这可能与观察时间较短,复发例数少有关系,尚需进一步随访观察。3在所同时检测69例AL患者中,用pearson相关分析发现cyclin H mRNA与CDK7 mRNA之间有相关性(r=0.388,P=0.00

关键词：白血病 cyclin H CDK7 聚合酶链反应细胞周期

西达本胺联合硼替佐米对套细胞淋巴瘤株增殖抑制的影响及其相关机制的研究

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西达本胺联合硼替佐米对套细胞淋巴瘤株增殖抑制的影响及其相关机...

作者：王晓阳河北医科大学

学位级别：硕士

目的:套细胞淋巴瘤(MCL)是一种具有独特临床病理特征的B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL),大多数患者在临床就诊时就已多属晚期,常规治疗难以达到根本治愈。现阶段,世界范围内MCL尚无标准的一线治疗方案。临床上治疗方案的选择通常基于年龄、... 详细信息

目的:套细胞淋巴瘤(MCL)是一种具有独特临床病理特征的B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL),大多数患者在临床就诊时就已多属晚期,常规治疗难以达到根本治愈。现阶段,世界范围内MCL尚无标准的一线治疗方案。临床上治疗方案的选择通常基于年龄、体能状况积分以及预后危险度分层等多因素综合判断。虽大多数患者对大剂量密集型化疗方案如R-CHOP方案或R-hyper-CVAD等化疗方案有效,但化疗相关毒副作用大,治疗相关死亡率高,且大部分患者最终会复发、耐药。异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)是目前唯一有可能治愈MCL的方法,但移植相关死亡率较高,且多数患者缺乏HLA匹配的供者,导致Allo-HSCT在临床上难以大范围实施;因此寻找有效治疗MCL的新药物和新方法迫在眉睫。西达本胺是一种新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACi),它通过提高细胞内组蛋白的乙酰化水平,进而调控基因的表达而产生细胞周期阻滞、促进细胞凋亡等生物学效应,发挥抗肿瘤作用;硼替佐米(Bortezomib,BTZ)是一种蛋白酶体抑制剂,可通过下调Cyclin D1表达、抑制NF-Kb途径等机制发挥抑制肿瘤细胞生长、播散及血管生成等,发挥抗肿瘤作用。因其毒副作用小,且与常规化疗药物无交叉耐药性而备受临床瞩目。近年来,体内外实验均证实了蛋白酶体抑制剂单药或组蛋白去乙酰化酶抑制剂单药对实体瘤(如肺癌、大肠癌、卵巢癌)和血液系统恶性肿瘤(如白血病、淋巴瘤等)均具有治疗作用,且据相关文献报道显示HDACi可通过增强对NF-Kb活性的抑制而发挥与BTZ协同抗肿瘤作用,但两者联合作用对MCL的增殖抑制及凋亡影响,国内外鲜有报道。本实验通过体外细胞培养技术,分别应用西达本胺、硼替佐米单药以及两药联合对人套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1细胞、Grant-519细胞)进行处理,然后观察各组细胞增殖抑制程度以及凋亡作用的影响,并探索其可能的作用机制,为将来临床上采用西达本胺联合硼替佐米治疗复发难治MCL提供理论依据。方法:1人套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1细胞,Grant-519细胞)的体外培养及传代人套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1细胞、Grant-519细胞购自中国科学院上海细胞库,将上述两种细胞接种于含有20%胎牛血清(以色列BI公司),1%青-链霉素混合液的RMPI 1640(美国Gibco公司)培养基,然后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,每2-3天传代一次,取对数生长期细胞用于后继实验。台盼兰拒染法证实实验活细胞率在95%以上。2 CCK-8法检测西达本胺、硼替佐米及两药联合分别作用于Jeko-1细胞,Grant-519细胞对细胞增殖的影响取Jeko-1细胞、Grant-519细胞悬液,随机分为空白对照组、阴性对照组、不同浓度西达本胺单药组、不同浓度硼替佐米单药组及二药联合组,分别作用24h,48h及72h后观察Jeko-1细胞及Grant-519细胞生长抑制情况;应用金正均公式计算联合用药是相加、协同还是拮抗作用。3流式细胞术Annexin V/PI标记法检测西达本胺、硼替佐米单药及两药联合作用于Jeko-1细胞和Grant-519细胞对细胞凋亡率的影响取Jeko-1细胞及Grant-519细胞悬液,随机分为西达本胺组、硼替佐米组、西达本胺+硼替佐米组、对照组,培养箱中孵育48h后收集细胞,按BD凋亡试剂盒步骤进行。4 RT-PCR法检测西达本胺、硼替佐米及两药联合作用于Jeko-1细胞和Grant-519细胞对NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1及Caspase3/9m RNA表达水平的影响取Jeko-1细胞及Grant-519细胞悬液,随机分为西达本胺组、硼替佐米组、西达本胺+硼替佐米组、对照组,培养箱中孵育48h后收集细胞,根据Trizol法提取RNA、c DNA反转试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒具体实验操作步骤检测NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1及Caspase3/9 m RNA的表达水平。5 Western Blot法检测西达本胺、硼替佐米及两药联合作用于Jeko-1细胞和Grant-519细胞对NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1及Caspase3/9蛋白表达水平的影响取Jeko-1细胞及Grant-519细胞悬液,随机分为西达本胺组、硼替佐米组、西达本胺+硼替佐米组、对照组,培养箱中孵育48h后收集细胞,提取各组细胞的总蛋白,取50ug(或20ug)蛋白上样,SDS-PAGE电泳,印迹转膜后,分别加入抗NF-Kb(p65)、Bcl-2、Bax、CCND1、Caspase3/9抗体孵育,后加入二抗,用双色红外激光扫描仪进行扫膜成像。结果1 CCK-

关键词：套细胞淋巴瘤组蛋白去乙酰化酶抑制剂蛋白酶体抑制剂 Cyclin D1 NF-Kb Caspase3途径

转录因子GATA2及辅转录因子CREB结合蛋白在正常核型急性髓系白血病中的表达调控及意义

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转录因子GATA2及辅转录因子CREB结合蛋白在正常核型急性髓系白血...

作者：马小莉河北医科大学

学位级别：硕士

目的：急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一组异质性很强的恶性克隆增殖性肿瘤，随着分子生物学技术的普及，近几年在正常核型急性髓细胞白血病(cytogenetically normal acute myeloid leukemia，CN-AML)患者中发现一些... 详细信息

目的：急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一组异质性很强的恶性克隆增殖性肿瘤，随着分子生物学技术的普及，近几年在正常核型急性髓细胞白血病(cytogenetically normal acute myeloid leukemia，CN-AML)患者中发现一些基因突变和基因异常表达(包括FLT3突变、NPM1和CEBPA等)，并显著影响临床预后。分子标志的发现和研究为CN-AML的诊断、治疗、预后提供了重要依据，有重要的临床应用价值。GATA2为转录因子家族成员，在造血干/祖细胞的增殖分化中起着重要作用。GATA2在血细胞生成过程中的生物学功能以及其表达的平衡性可能与白血病的发生有关。在分化过程中各种不同的造血细胞谱系内GATA-2的表达逐渐降低，因而过表达及活化的GATA2可抑制造血细胞正常分化的能力，同时可促进白血病的转化。CREB结合蛋白（CBP）是GATA-2的辅激活因子，CBP通过与基本转录因子和一些序列专一的转录激活因子相互作用,为二者提供了一个相互作用的“桥”。不论是在体内还是在体外CBP均能与GATA-2结合，并能够以剂量依赖的方式提高GATA-2转录激活的活性。同时CBP蛋白与GATA-2选择性结合时可维持造血细胞的非分化状态,故对此状态下造血祖细胞的发育机制的研究将有助于我们控制白血病和与造血祖细胞分化异常相关的疾病。本实验旨在探讨GATA-2基因及CBP的表达与白血病的转归及二者共同作用与CN-AML发病的关系。同时从细胞发育、增殖、分化等方面多角度深入研究GATA-2及CBP在CN-AML发生发展中的表达特性，从中逐步明确其发生机理，为CN-AML的治疗提供新的思路并为提高CN-AML的治愈率及长期无病生存率打下基础。方法：1收集2011.4-2012.1部分在河北医科大学第二医院血液内科住院及门诊的AML患者骨髓液标本共87例，将其分为初治组（34例）、复发组（8例）、缓解组（45例），其中初治组及复发组经染色体检测均为正常核型;并设11例非恶性血液病患者为对照组。2使用淋巴细胞分离液提取骨髓液中单个核细胞。3应用半定量逆转录-聚合酶链反应（semi-quantity reversetranscription-polymerase chain reaction, RT-PCR）检测各组GATA2、CBPmRNA的表达水平。4统计学处理;结果：1GATA2mRNA在各组中的表达1.1GATA2mRNA在34例初治CN-AML患者中33例表达阳性，基因相对表达水平（GATA2-actin）为1.299（1.496），阳性率为97.1%;在8例复发CN-AML患者中8例表达阳性，相对表达水平为1.367（1.734），阳性率为100%。初治组和复发组表达水平与表达率无差别，但初治组表达水平明显高于对照组（11例非恶性血液病患者中6例表达阳性，阳性率为54.5%，平均水平为0.592（0.916）），结果具有显著性差异（P0.05），但表达水平和阳性率均低于初治CN-AML组，且差别有显著性（P0.05）。2CBP mRNA在各组中的表达2.1CBP mRNA在34例初治CN-AML患者中33例表达阳性，阳性率为97.1%，表达水平为1.070（1.661）;在8例复发CN-AML患者中8例表达阳性，阳性率为100%，表达水平为1.546（0.347）;CBP mRNA在45例缓解患者中42例表达阳性，阳性率为93.3%，表达水平为0.451（0.908）;在11例对照组中11例表达阳性，阳性率为100%，表达水平为0.591(0.358)。经统计学分析，除初治-复发组、强化-正常组外，CBP mRNA在其余各组中表达水平均有显著差异（P<0.05）。2.2CBP表达与治疗缓解率及预后的关系：在34名初治CN-AML患者中，CBP表达阳性者33例，阳性表达率为97.1%。其中，CBP高表达组（CBP表达水平

关键词：染色体核型正常的急性白血病 GATA2 CREB结合蛋白(CBP) 聚合酶链反应

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恶性血液病患者医院感染状况及疗效分析

恶性血液病患者医院感染状况及疗效分析

作者：徐伟格河北医科大学

学位级别：硕士

目的：分析我院血液科恶性血液病患者院内感染特点、病原菌分布特征以及治疗转归情况，为优化临床抗感染治疗效果提供依据。方法：统计河北医科大学第二医院血液科病房2009年3月至2013年12月诊断为恶性血液病(急性白血病AL、骨髓增生异... 详细信息

目的：分析我院血液科恶性血液病患者院内感染特点、病原菌分布特征以及治疗转归情况，为优化临床抗感染治疗效果提供依据。方法：统计河北医科大学第二医院血液科病房2009年3月至2013年12月诊断为恶性血液病(急性白血病AL、骨髓增生异常综合症MDS、多发性骨髓瘤MM、恶性淋巴瘤ML)伴发医院感染的605例患者的临床资料。回顾性分析（1）恶性血液病患者医院感染率、病原菌分布及多药耐药情况;粒缺伴发热治疗情况;血培养阳性的血流感染治疗转归情况;（2）肺部真菌感染危险因素、分层诊断、治疗策略及疗效分析。单因素分析、两个或多个率的比较采用卡方检验。多因素分析采用Logistic回归分析。以P＜0.05作为具有统计学意义的标准。结果：1恶性血液病患者发生医院感染及病原菌分布恶性血液病患者发生医院感染605例，感染率18.63%，感染率在急性非淋巴细胞白血病（ANLL）>急性淋巴细胞白血病（ALL）>MDS>ML>MM。感染部位以呼吸道最为常见，肺部58.35%，上呼吸道26.28%，血流6.94%，肛周5.62%，皮肤软组织4.96%，口腔3.8%，泌尿系2.31%，肠道1.49%，鼻窦1.16%，腹腔0.33%，急性阑尾炎0.33%，感染性心内膜炎0.17%，肝脓肿0.17%，无法明确感染部位11.41%。共有123例患者检出病原菌，共检出真菌菌株70株，其中念珠菌为常见检出菌。共检出细菌菌株224株，常见的有：大肠埃希菌21.88%，铜绿假单胞菌15.63%，肺炎克雷伯菌11.61%，嗜麦芽窄食单胞菌10.27%，屎肠球菌10.27%，鲍曼不动杆菌6.7%，凝固酶阴性葡萄球菌4.91%。多重耐药（MDR）菌株占检出细菌的16.52%。血培养阳性血流感染患者53例次，血流感染以体温升高为单一表现、无其它感染灶的16例（38.10%），合并一个或多个其它部位感染的，肺部18例次，上呼吸道和口腔9例次，皮肤和皮下软组织5例次，肛周2例次，肠道2例次，泌尿系1例次。治愈或好转33例，控制不佳放弃治疗4例，死亡5例。原发病未缓解状态、既往1个月有抗生素使用史、粒缺高危情况、合并多脏器衰竭可能为恶性血液病伴血流感染预后不良的影响因素（P7d（P=0.028，OR=1.039）、应用广谱抗生素（P=0.001，OR=3.286）为患者发生肺部真菌感染的独立危险因素。3.3恶性血液病合并肺部真菌感染治疗疗效及预后初级预防治疗2例，选择药物为氟康唑，均以发生突破性真菌感染更换药物而宣告失败。再次预防治疗3例，1例选择氟康唑，2例选择伏立康唑片，治疗后均未有新发真菌感染。经验治疗124例次，单药有效率73.15%，低于联合用药的75%，但差别无统计学意义（P≥0.05）。诊断驱动治疗115例次，单药治疗有效率75.26%低于联合用药的88.89%，但差别无统计学意义（P≥0.05）。以诊断真菌感染并给予抗真菌治疗后2个月为观察点，治疗有效的181例（80.09%），加重或死亡的40例（17.7%），经验性抗真菌治疗和诊断驱动治疗的有效率分别为80.02%、84.89%，差别无统计学意义（P≥0.05）。经验治疗组真菌感染临床诊断率低于诊断驱动治疗组。在未予以抗感染治疗调整情况下，有14例患者（6.22%）影像学加重后又逐渐好

关键词：恶性血液病医院感染肺部真菌感染治疗策略

C/EBPα基因突变对急性髓系白血病（AML）临床预后影响

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C/EBPα基因突变对急性髓系白血病（AML）临床预后影响

作者：王爱先河北医科大学

学位级别：硕士

研究背景:AML的发病基础一般认为是由多因素诱导基因突变导致细胞增殖、分化和细胞凋亡途径发生改变的结果。作为C/EBP(CCAAT/ enhancer binding protein, C/EBP)家族成员之一的髓系转录因子CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)是髓系祖... 详细信息

研究背景:AML的发病基础一般认为是由多因素诱导基因突变导致细胞增殖、分化和细胞凋亡途径发生改变的结果。作为C/EBP(CCAAT/ enhancer binding protein, C/EBP)家族成员之一的髓系转录因子CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重要的转录因子,C/EBPα在AML造血干细胞增殖与分化进程中扮演着极为重要的角色,最新公布的WHO白血病分类标准强调在初诊评估时就应对AML患者骨髓样本进行C/EBPα突变以及与之预后相关的FLT3和NPM1基因突变分析。C/EBPα已成为AML重要的预后参考指标之一,可能成为新的治疗靶点,其功能的破坏、丧失常与AML的发生有关,恢复C/EBPα表达可以作为诱导分化治疗手段。研究表明,AML患者C/EBPα基因突变主要为N-端移码突变和C-端bZIP区域结构性突变,这种突变的存在对提高患者的EFS、OS和RD具有重要意义。有基因突变与低复发率和高存活率密切相关,C/EBPα突变检测的准确性对于AML患者治疗与预后的风险分级具有重要意义。目的:检测AML患者中C/EBPα基因突变情况;比较PCR直接测序法和多重PCR片段法在C/EBPα基因突变检测中的性能;分析C/EBPα突变与患者临床特征之间的关系;观察突变患者和非突变患者接收诱导缓解治疗后的临床疗效。方法:首先采用聚合酶链式反应(PCR)直接测序法分别检测60例AML患者骨髓样本和10例体检健康志愿者外周血样本。而后用多重PCR片段分析法再次检测C/EBPα突变AML患者的骨髓样本。采用独立样本t检验分析C/EBPα突变与患者临床特征之间的关系;采用Chi-square检验分析患者CR率;用Kaplan-Meier进行患者生存分析,分析患者的RD和OS;采用log-rank检验分析突变患者和非突变患者的RD和OS之间差异。结果:①PCR直接测序分析结果表明,60例AML患者中的C/EBPα突变患者8例(发生率13.3%),包括双等位基因突变5例(发生率62.5%),单基因突变患者3例(发生率37.5%),其中仅有1例出现N-端移码突变;②多重PCR片段分析法分析检测8例C/EBPα突变AML患者骨髓样本,与PCR直接测序法相比,1例患者未检测到N-端移码突变,准确度为93%;③有无C/EBPα突变与AML患者的性别、年龄、白细胞计数、骨髓原始细胞数和血小板计数无关,但突变患者的血红蛋白数要高于非突变患者;④本研究尚未发现CD7和C/EBPα-WT之间的负相关关系,AML患者中C/EBPα-CD7+和C/EBPα+CD7-并不是交替出现,无统计学意义(P=0.926),60例患者中除了C/EBPα-CD7+和C/EBPα+CD7-类型的患者还有其它类型的患者,但C/EBPα突变患者中尚未检测到CD7+表达;⑤C/EBPα基因突变患者的CR、OS和RD较非突变患者要高,但其差异无统计学意义(P值分别为0.569、0.130和0.510);⑥C/EBPα+CD7-患者的CR率(87.5%)和RD(9.25,95% CI:7.78-10.72)要明显高于C/EBPα-CD7+的CR率(25%)和RD(5.188, 95% CI:3.325-7.050),两组差异有统计学意义(P值分别为0.012和0.008)。结论:①本研究表明AML患者C/EBPα基因突变发生率约13.3%,其中双等位基因发生率为62.5%;②尽管PCR直接测序是一种准确度高的C/EBPα突变检测方法,但综合运用PCR直接测序法和多重PCR片段分析法是未来临床应用的一个趋势;③C/EBPα突变的AML患者与非突变患者在性别、年龄、白细胞计数、骨髓原始细胞计数和血小板计数等临床指标的差异不大;④本研究中C/EBPα突变患者和非突变患者的CR率、OS和RD上差异不大,需要进一步观察;⑤C/EBPα+CD7-可作为AML临床预后良好的指标。

关键词： AML C/EBPα 基因突变检测预后 CD7

RNA干扰技术阻断S期激酶相关蛋白2表达对K562细胞增殖和凋亡的影响

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RNA干扰技术阻断S期激酶相关蛋白2表达对K562细胞增殖和凋亡的影响

作者：马兵河北医科大学

学位级别：硕士

肿瘤是一种细胞周期调控紊乱性疾病,其根本原因在于细胞的正性因子表达增强或负性因子表达减弱,导致细胞过度增殖、分裂,出现细胞生长失控。泛素蛋白酶体途径通过降解细胞周期调控因子参与对细胞周期的调控,在平衡细胞周期调控因子方面... 详细信息

肿瘤是一种细胞周期调控紊乱性疾病,其根本原因在于细胞的正性因子表达增强或负性因子表达减弱,导致细胞过度增殖、分裂,出现细胞生长失控。泛素蛋白酶体途径通过降解细胞周期调控因子参与对细胞周期的调控,在平衡细胞周期调控因子方面发挥着重要调节作用,与肿瘤的发生、发展密切相关。S期相关蛋白激酶2(S-phase kinase-associated protein 2, Skp2)属于泛素蛋白酶体系统的组成部分,通过其特异性接触将各种底物蛋白招募到泛素蛋白酶体进行泛素化降解而参与细胞周期的调控。Skp2作为一种与细胞周期调控关系密切的癌基因,参与调控抑癌基因p27kip1的表达。p27kip1是Cip/Kip家族(CDK-interacting protein/kinase inhibition protein)中的一员,是细胞周期的负性调控因子,能阻滞细胞周期于G1期。Skp2和p27kip1通过影响白血病细胞的增殖、分化、凋亡参与白血病的进程和预后。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是目前最有效的基因沉默技术,能特异性抑制靶基因的转录,进而下调相应蛋白水平及功能。为此,我们采用RNAi技术,以Skp2为切入点,构建了靶向Skp2的RNAi序列,在脂质体介导下将干扰质粒瞬时转染K562细胞,研究Skp2基因水平下调后,白血病细胞株K562中p27kip1的表达情况,初步探讨下调Skp2基因表达对白血病细胞增殖和凋亡的影响。实验内容包括以下两部分:第一部分:靶向Skp2特异性RNA干扰重组体的构建及筛选目的:利用pGenesil1.1质粒构建靶向Skp2的短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰重组体,并通过转染K562细胞筛选有效的干扰序列。方法:利用在线设计软件,分别设计三对针对Skp2的有短发卡结构的DNA序列及一对非特异对照序列,经退火成互补双链,再克隆至带有U6启动子及增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein, EGFP)的质粒pGenesil1.1中,构建重组体,转化大肠杆菌菌株DH5α,提取质粒进行酶切鉴定后,进行测序分析。在脂质体介导下,将构建成功的4组重组体转染白血病细胞系K562。采用荧光显微镜及流式细胞仪分析转染效果;通过RT-PCR技术检测各处理组Skp2 mRNA的变化,流式细胞法检测Skp2蛋白表达情况,筛选出有效抑制Skp2表达的序列。实验分7组:①空白对照组(简写为CON组);②脂质体lipofectamineTM2000转染试剂组(简写为LIP组);③质粒对照组(简写为KB组);④阴性对照组pGenesil1.1-NC shRNA(简写为NC组);⑤pGenesil1.1-Skp2 shRNA1质粒组(简写为shRNA1组);⑥pGenesil1.1-Skp2 shRNA2质粒组(简写为shRNA2组);⑦pGenesil1.1-Skp2 shRNA3质粒组(简写为shRNA3组)。结果:①酶切测序分析结果表明已成功构建了能表达Skp2 shRNA的三组重组体pGenesil1.1-Skp2 shRNA及阴性对照pGenesil1.1-NC shRNA;②转染后48h,利用荧光显微镜及流式细胞仪证实转染成功,转染效率约40%;③Skp2 shRNA下调Skp2 mRNA的表达:根据实验结果,选取Skp2 shRNA下调率最高的时间点,即转染后48h,收集各处理组的K562细胞测定Skp2基因和蛋白表达水平。RT-PCR结果显示,CON组、NC组、LIP组及KB组之间Skp2 mRNA表达无明显差异,Skp2 shRNA组Skp2 mRNA较NC组均显著降低,其中shRNA1组下调率为40.00%,shRNA2组下调率为76.36%,shRNA3组下调率为56.36%;④Skp2 shRNA抑制Skp2蛋白表达:流式细胞仪分析,CON组、NC组、LIP组及KB组之间Skp2蛋白表达无明显差异,shRNA组Skp2蛋白表达较NC组均显著降低,shRNA1组下调率为36.77%,shRNA2组下调率为67.25%,shRNA3组下调率为45.30%。Skp2 shRNA可显著下调Skp2基因和蛋白的表达,故选取pGenesil1.1-Skp2 shRNA2进行后续实验。结论:利用质粒载体pGenesil1.1可成功构建Skp2的shRNA干扰重组体,且可成功转染入K562细胞,其中pGenesil1.1-Skp2 shRNA2对Skp2的抑制效率较高。第二部分:Skp2短发卡RNA干扰重组体对K562细胞增殖和凋亡的影

关键词： K562细胞 Skp2 p27kip1 RNA干扰短发卡RNA 细胞增殖细胞凋亡

体外药敏实验在优化急性淋巴细胞白血病治疗中的作用

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体外药敏实验在优化急性淋巴细胞白血病治疗中的作用

作者：田甜河北医科大学

学位级别：硕士

目的:白血病细胞耐药性是制约化疗成功的重要因素。特别是针对复发难治患者,常规化疗方案效果往往不能令人满意。如能在化疗前预先对白血病细胞的药物敏感性进行检测,并根据其结果优化治疗方案,可有效提高化疗成功率,延长患者生存时间... 详细信息

目的:白血病细胞耐药性是制约化疗成功的重要因素。特别是针对复发难治患者,常规化疗方案效果往往不能令人满意。如能在化疗前预先对白血病细胞的药物敏感性进行检测,并根据其结果优化治疗方案,可有效提高化疗成功率,延长患者生存时间。对于急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL),现有国内外研究提示,其对常规化疗药物的耐药是非常普遍的,因此,寻找一些药物增敏剂,减少白血病细胞对化疗药物的耐药性将会极大地改善患者的预后。目前,临床前肿瘤模型体内试验已证实蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)能够显著遏制包括多发性骨髓瘤、ALL在内的多种肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制血管新生。此外,体外研究也显示硼替佐米可以增加化疗药的敏感性,并能克服骨髓瘤细胞对地塞米松、阿霉素和马法兰等药物的耐药。但迄今为止,硼替佐米能否在体外有效减少ALL细胞对化疗药物的耐药性,国内外尚缺乏相关报道。本研究拟通过体外试验检测原代ALL细胞对多种化疗药物的敏感性,来探讨其与临床化疗疗效的相关性,为临床治疗将体外药敏试验做为预后判断因素之一提供有力证据。同时结合现有的ALL预后分层指标对ALL患者的总体疗效和预后进行预测。此外,对于复发难治ALL,本研究拟将硼替佐米作为潜在的化疗增敏剂(一方面增加常规化疗药物的杀伤作用,另一方面逆转白血病细胞对化疗药物的耐药),来对比观察硼替佐米单药,硼替佐米+氟达拉滨+阿糖胞苷和硼替佐米+柔红霉素对耐药白血病细胞的作用,并探讨硼替佐米增加化疗药物抗肿瘤效应的具体作用机制,从而为临床治疗复发难治性ALL提供更多的联合化疗的选择方案,甚至为开发新型治疗策略提供相应理论依据。方法:1首先对36例初治ALL患者应用MTT法对单药及临床常用联合方案进行敏感性检测,了解其增殖抑制作用。结合ALL预后分层指标对ALL患者的化疗疗效和预后进行分析预测。2选取急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM/C1细胞(托泊替康耐药)为研究对象,应用不同浓度硼替佐米对CEM/C1细胞进行增殖抑制检测,并分别选取①0.36ug/ml的硼替佐米②0.49ug/ml的柔红霉素③0.36ug/ml的硼替佐米联合0.49ug/ml的柔红霉素对CEM/C1细胞进行增殖抑制检测。3选取急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM/C1细胞(托泊替康耐药)为研究对象,应用①0.36ug/ml的硼替佐米②158.5ug/ml的氟达拉滨③19.5ug/ml的阿糖胞苷④158.5ug/ml的氟达拉滨、19.5ug/ml的阿糖胞苷两药联合⑤0.36ug/ml的硼替佐米、158.5ug/ml的氟达拉滨、19.5ug/ml的阿糖胞苷三药联合对CEM/C1细胞进行增殖抑制检测。4选取难治性ALL患者的原代新鲜细胞,应用不同浓度硼替佐米、硼替佐米单药、氟达拉滨单药、阿糖胞苷单药、柔红霉素单药及氟达拉滨联合阿糖胞苷、硼替佐米+氟达拉滨+阿糖胞苷三药联合、硼替佐米+柔红霉素两药联合对其进行增殖抑制检测,并对其相互间疗效及与传统化疗方案疗效进行对比。5用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,所有数据用三次独立实验的平均值表示,实验结果用均数±标准差(X±S)表示;两组均数比较采用t检验,方差分析方法进行分析处理,多组均数比较用单因素方差分析,组间多重比较用SNK法。P<0.05有统计学意义。单因素分析、两个或多个率的比较采用卡方检验。多因素分析采用Logistic回归分析。以P<0.05作为具有统计学意义的标准。结果:1联合药物在初治ALL原代细胞中抑制作用及临床疗效相关性。1.1用苔盼蓝拒染试验方法测定ALL原代新鲜细胞活细胞率为95%-99%之间,平均活细胞率为(97.16±1.31)%,而冻存复苏后细胞活细胞率为67%-89.99%之间,平均活细胞率为(82.85±5.62)%,表明细胞冻存复苏后细胞活性下降,具有统计学意义(P<0.05)。1.2体外联合药敏与体内敏感性关系,体外敏感者31例,体外耐药者5例,体内敏感者31例,体内耐药者5例。体外药敏结果与体内疗效比较,S/S 30例,S/R 1例,R/S 1例,R/R 4例,总符合率为94.44%,阳性符合率为96.77%,阴性符合率为80%。ALL原代新鲜细胞单药及联合用药抑制率与冻存复苏后活细胞抑制率相比具有统计学差异(P<0.05)。1.3体外各联合化疗方案敏感组与耐药组细胞抑制率比较,VCTD方案敏感组平均抑制率为(61.32±7.88)%,耐药组平均抑制率为(28.65±1.81)%,VCID方案敏感组平均抑制率为(62.34±7.97)%,耐药组平均抑制率为(27.24±2.24)%,VCILD方案敏感组平均抑制率为(63.07±7.39)%,耐药组平均抑制率为(28.69±0.99)%,具有统计学差异。1.4

关键词：急性淋巴细胞白血病 MTT法细胞增殖抑制 CEM/C1细胞株硼替佐米氟达拉滨阿糖胞苷柔红霉素

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作者：苏晰河北医科大学

学位级别：硕士

目的:通过检测SphK-S1P-S1PR信号通路中SphK1、SphK2、S1PR1、S1PR2四种蛋白在成人弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large Bcell Lymphomas,DLBCL）组织中的表达水平,进一步分析其表达情况与DLBCL患者各个临床特征之间的关系,以及其各自表... 详细信息

目的:通过检测SphK-S1P-S1PR信号通路中SphK1、SphK2、S1PR1、S1PR2四种蛋白在成人弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large Bcell Lymphomas,DLBCL）组织中的表达水平,进一步分析其表达情况与DLBCL患者各个临床特征之间的关系,以及其各自表达间是否有关联及是否与疗效评估有相关性,探索上述四种蛋白与DLBCL发病的关系,为疾病的诊断、预后判断及筛选新的治疗靶点提供实验依据,以期为提高DLBCL患者的治疗效果提供帮助。方法:采用免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）检测28例DLBCL患者淋巴组织石蜡标本及10例非恶性淋巴结增殖性疾病患者淋巴组织石蜡标本中SphK1、SphK2、S1PR1、S1PR2四种蛋白的表达情况。结果:1、免疫组化结果显示SphK1、SphK2、S1PR1、S1PR2四种蛋白组在DLBCL组与对照组的表达水平不同,差异均有统计学意义（P＜0.05）。2、在各临床特征指标中,SphK1的表达在IPI积分组;S1PR1的表达在年龄、IPI积分、Bcl-2表达组;S1PR2的表达在性别、ANN ARBOR分期、IPI积分、LDH不同水平组中差异均有统计学意义（P＜0.05）,而SphK2表达水平在上述不同临床特征指标中的表达则无显著差异（P＞0.05）。3、SphK1蛋白与S1PR1蛋白间表达、SphK1蛋白与S1PR2蛋白间表达有关系（P＜0.05）,即SphK1蛋白表达增多的同时,可有S1PR1蛋白表达增多（呈正相关）,而S1PR2蛋白表达的减低（呈负相关）。4.短期疗效中患者的缓解率比较:SphK1、SphK2、S1PR1三种蛋白均为表达组的缓解率低于不表达组,而S1PR2蛋白表达组的缓解率则高于不表达组,虽有差异,但由于样本量少,上述缓解率间差异无统计学意义,今后应扩大样本量进一步验证。结论:SphK1、SphK2、S1PR1蛋白的高表达及S1PR2蛋白的表达缺失与DLBCL的发病关系密切,且SphK1和S1PR1表达阳性率增高、S1PR2表达阳性率的减低可作为提示DLBCL患者预后不良的因素,检测SphK-S1P-S1PR信号通路中相关蛋白的表达情况可能有助于DLBCL患者的精确诊断及预后判断,进一步针对SphK-S1P-S1PR信号通路的研究有望筛选出治疗DLBCL的新靶点。

关键词：弥漫大B细胞淋巴瘤鞘氨醇激酶 1-磷酸鞘氨醇受体免疫组化学法靶向治疗

地西他滨联合硼替佐米对套细胞淋巴瘤细胞增殖抑制及其相关机制的研究

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地西他滨联合硼替佐米对套细胞淋巴瘤细胞增殖抑制及其相关机制的...

作者：陈丹河北医科大学

学位级别：硕士

目的:套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)是一种难治的B细胞非霍奇金淋巴瘤,大多数患者临床侵袭性强,预后差,当前尚缺乏有效的治疗方案。地西他滨(Decitabine,DAC)是临床上最常用的一种去甲基化药物,具有明确的抗肿瘤活性,目前地... 详细信息

目的:套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)是一种难治的B细胞非霍奇金淋巴瘤,大多数患者临床侵袭性强,预后差,当前尚缺乏有效的治疗方案。地西他滨(Decitabine,DAC)是临床上最常用的一种去甲基化药物,具有明确的抗肿瘤活性,目前地西他滨对中、高危骨髓增生异常综合征(MDS)及难治性或复发性急性髓系白血病的治疗临床已达成共识,取得较好疗效,但其对MCL的治疗是否有效目前国内外鲜有报道。而硼替佐米(brotezomib,BTZ)是一种蛋白酶体抑制剂,其最主要用于多发性骨髓瘤的一线治疗,近年来研究报道,硼替佐米对复发或难治性MCL和弥漫大B细胞淋巴瘤患者亦发挥明确的抗肿瘤效应,已被NCCN推荐用于复发或难治性MCL和弥漫大B细胞淋巴瘤患者的治疗,但也仅仅用于二线治疗,仍有一部分患者对其单药治疗疗效不佳。因此,在世界范围内,寻找MCL有效的治疗方法和手段成为当前的研究热点。本研究拟采用体外细胞培养的方法,观察DAC、BTZ以及两种联合应用对人MCL细胞株增殖和凋亡的影响,并探讨其相关作用机制,为MCL患者特别是复发难治MCL患者的联合用药治疗提供实验依据。方法:1用不同浓度的DAC、BTZ在体外对人MCL细胞株Jeko-1、Grante519细胞进行处理,采用CCK8法检测不同处理因素对细胞的增殖抑制作用。2采用流式细胞术(Flow cyometry,FCM)检测上述药物处理后对各组细胞凋亡的影响。3采用RT-PCR法检测上述药物对MCL细胞凋亡和信号传导相关基因PCDH8、NF-Kb、Caspas3、Bcl-2、CCND1、Bax m RNA表达水平的影响。4采用Western Blot方法检测不同处理因素对MCL细胞中PCDH8、NF-Kb、Caspas3、Bcl-2、CCND1、Bax蛋白表达水平的影响。结果:1.低浓度的DAC(0.1、1、10μmol/L)能明显抑制Jeko-1、Grante519细胞增殖并诱导其凋亡,其抑制效应呈剂量依赖和时间依赖性;经单药DAC处理后,在Jeko-1、Grante519细胞中均可观察到Caspase3、Bax表达水平的升高,Bcl-2、CCND1表达水平的降低,但NF-KB(P65)表达水平在各组之间则无明显差异;因PCDH8启动子区域过甲基化导致其表达水平减低的Jeko-1细胞,经DAC处理后,Jeko-1细胞中PCDH8表达水平明显升高,证实去甲基化治疗有效;2.高浓度的BTZ(0.2、0.4μmol/L)能明显抑制Jeko-1、Grante519细胞增殖并诱导其凋亡,其抑制效应呈剂量依赖和时间依赖性;单药BTZ均能引起Jeko-1、Grante519细胞中Caspase3、Bax表达水平的升高,NF-KB(P65)、Bcl-2、CCDN1表达水平降低,但对PCDH8表达水平无明显影响;***联合BTZ使Jeko-1、Grante519细胞的抑制率、凋亡率明显增加;且DAC对Jeko-1、Grante519细胞的增殖抑制及促凋亡作用大于BTZ;与对照组及单药处理组相比,DAC联合BTZ作用后能显著提高Jeko-1、Grante519细胞PCDH8、Caspase3、Bax表达水平,相反显著降低NF-KB(P65)、Bcl-2、CCND1表达水平。结论:1 DAC在一定浓度范围内对Jeko-1、Grante519细胞具有增殖抑制及促凋亡作用,其作用呈时间和剂量依赖性;其作用机制可能与DAC的去甲基化作用和细胞毒作用有关;并且DAC能够通过上调Caspase3、Bax表达水平,以及降低Bcl-2、CCND1的表达水平,以进一步调控细胞增殖及凋亡过程,从而发挥明显的抗肿瘤活性。2在一定浓度范围内BTZ可以增强Jeko-1、Grante519细胞的增殖抑制作用及促凋亡作用;其作用机制可能与BTZ能够降低NF-KB信号通路活性,上调Caspase3、Bax表达水平,减低Bcl-2、CCND1表达水平,从而达到促进细胞凋亡,抑制细胞增殖的作用。3低浓度DAC具有去甲基化作用,高浓度DAC具有细胞毒性作用。4 DAC与BTZ具有正协同作用,其对MCL细胞的增殖抑制作用可能是两药联合后加强了对NF-KB信号通路的抑制作用,并且下调Bcl-2水平,上调Bax水平,从而引起下游的Caspase3蛋白表达水平进一步升高,以达到更高的抗肿瘤作用。这一实验结果可能为今后临床应用DAC联合BTZ治疗MCL提高新的理论依据。

关键词：套细胞淋巴瘤去甲基化地西他滨硼替佐米 Jeko-1细胞 Grante519细胞增殖凋亡

FIt3/FL在急性白血病中的表达及其临床意义

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FIt3/FL在急性白血病中的表达及其临床意义

作者：王静河北医科大学

学位级别：硕士

目的:Flt3(Fms-like tyrosine kinase-3),属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族成员,它可以使细胞外酪氨酸残基磷酸化,并通过各种细胞胞浆蛋白传导激活信号,提供增殖刺激,从而也能促进白血病恶性克隆的增殖和维持... 详细信息

目的:Flt3(Fms-like tyrosine kinase-3),属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)家族成员,它可以使细胞外酪氨酸残基磷酸化,并通过各种细胞胞浆蛋白传导激活信号,提供增殖刺激,从而也能促进白血病恶性克隆的增殖和维持。Flt3 配基(Flt3 ligand, FL),通过和Flt3结合在造血系统发挥多效性和潜在性的能力,一些急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)细胞共表达Flt3 和FL,可能提示二者有通过自分泌、旁分泌等形式活化的可能性。Flt3/FL 信号传导系统可能在人类白血病发病中发挥重要作用。另外,FL 作为新近发现的一种造血细胞生长因子,其主要生物学活性表现为调节早期造血干/祖细胞的增殖和分化,提高机体的造血机能。本实验旨在探讨Flt3/FL 的表达与白血病转归及二者共表达与白血病发病的关系。另外检测FL 浓度在急性白血病化疗前后的动态变化,为其作为一种新的造血生长因子应用于临床打下基础。方法:本研究分两部分。第一部分的研究对象包括106例急性白血病(acute leukemia, AL)患者,将其分为初治组(64 例)、复发组(12 例)、缓解组(30 例)。19 名健康人为正常对照和K562、KG-1α、HL60 细胞株为阳性和阴性对照。应用半定量逆转录-聚合酶链反应(simi-quantity reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测各组Flt3、FL 的mRNA 水平。

关键词：白血病 Flt3 FL 聚合酶链反应酶联免疫吸附技术