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作者：王淑林福建医科大学

学位级别：硕士

目的：1、大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的分离及培养，并鉴定其相关生物学特性;2、建立阿霉素肾病大鼠模型;3、检测生化指标，电镜观察，应用普通PCR和Western blot技术观察骨髓间充质干细胞对... 详细信息

目的：1、大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的分离及培养，并鉴定其相关生物学特性;2、建立阿霉素肾病大鼠模型;3、检测生化指标，电镜观察，应用普通PCR和Western blot技术观察骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠的干预作用及mTOR的表达。方法：1、提取、培养与鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞---通过大鼠淋巴细胞分离液得到单个核细胞层，再通过密度梯度离心法和贴壁筛选法，不断传代、扩增，并通过流式细胞仪鉴定表面标志物质、同时运用成骨及成脂诱导方法鉴定骨髓间充质干细胞生物学特性;2、大鼠阿霉素肾病模型建立---非麻醉状态下尾静脉一次性按7.5mg/Kg体重注射盐酸阿霉素，14天后，综合各项结果：一般表现，24h尿蛋白定量、肌酐等各项生化指标，结合肾脏组织HE染色及电镜观察大鼠阿霉素肾病模型;3、骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠的干预作用及mTOR的表达---实验分组：模型组;MSC组;正常对照组;应用普通PCR和western blot技术动态观察足细胞裂孔膜蛋白nephrin及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR不同时间点mRNA水平和蛋白水平的表达情况。结果：1、大鼠BMSCs细胞易于分离、培养，而且具有间质细胞的表面抗原特征，纯度高，活性高及多向分化潜能;2、注射盐酸阿霉素14天后，综合各项结果判定本方法建立大鼠阿霉素肾病模型成功，可以实验;3、干预后各时间点，PCR检测模型组nephrinmRNA表达量均下降，随时间推移下降越明显，干细胞干预后nephrinmRNA表达量出现上升（较模型组），但相对于正常组仍然下降，Western blot检测nephrin同上。干预后1周及3周，Western blot表明模型组mTOR条带稍微增粗，p-mTOR条带模型组也增粗，且经干细胞干预后条带变窄，但相对正常组仍然变宽。灰度值出现相应变化，干预后2w，Western blot表明模型组mTOR条带稍微增粗，p-mTOR条带模型组增粗较明显，且经干细胞干预后条带变窄窄，但相对正常组仍然变宽。灰度值出现相应变化. 结论：1、可以通过密度梯度离心法结合贴壁筛选法，成功地从大鼠骨髓中分离出高纯度、高活性和具有多向分化潜能的大鼠骨髓间充质干细胞;2、可以经尾静脉一次性按7.5mg/Kg体重注射盐酸阿霉素，建立大鼠阿霉素肾病模型，时间为14天;3、MSC保护阿霉素肾病大鼠的可能机制是：MSC的输注抑制了肾组织mTOR信号通路的激活，通过维持足细胞裂孔膜蛋白nephrin的稳定进而维持足细胞裂孔膜结构的完整，改善了蛋白尿，保护了因阿霉素导致的肾小球足细胞的损害，达到了延缓疾病进展的目的。

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骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠p38和pp38的作用

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作者：吴志伟福建医科大学

学位级别：硕士

目的:分离并培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并对其生物学特性进行鉴定。通过肾组织病理观察、生化指标检测、Western blot技术观察骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠的治疗效果,并探讨BMSC对p38... 详细信息

目的:分离并培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并对其生物学特性进行鉴定。通过肾组织病理观察、生化指标检测、Western blot技术观察骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠的治疗效果,并探讨BMSC对p38和pp38的影响。方法:SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定:颈椎脱臼处死大鼠,无菌条件下剪取双侧股骨和胫骨,采集骨髓,通过密度梯度离心法和贴壁培养法,分离并培养BMSCs。体外纯化、传代、扩增。取P3-5代细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。流式细胞仪检测细胞表面标志物,并进行成软骨、成脂分化诱导,鉴定其生物学特性。将大鼠分为四组,即空白对照组、阿霉素组、干细胞组、强的松组,空白组不予任何处理,阿霉素组在注射ADR后予生理盐水静脉注射,干细胞组予BMSCs以2x106/只静脉输注,强的松组给予强的松5mg/d连续灌胃。于不同时间点采取大鼠静脉血,测定血肌酐、尿素、白蛋白、总胆固醇、甘油三脂;收集大鼠尿液,进行24h尿蛋白定量;切取大鼠肾脏,经染色后置于光镜及电镜下观察肾脏病理变化;western-blot检测各组大鼠肾脏在不同时间点蛋白p38和pp38表达差异。结果:1、获取的BMSCs为均一的长梭形,呈集落样生长,纯度高、活性强。流式鉴定结果提示其高表达CD29、CD44、CD90,低表达CD11、CD34、CD45、CD106。经诱导后能成功向成软骨细胞、成脂肪细胞分化。2、各项生化指标显示:干细胞组、强的松组24h尿蛋白定量较阿霉素组有所下降,而肌酐、尿素等水平则未见明显下降。3、肾组织病理观察:阿霉素组肾小球系膜细胞轻度增生,肾小管内有蛋白管型,电镜下可见足突融合及微绒毛变性。而干细胞组和强的松组肾脏只见足细胞轻度水肿。4、Western blot提示:各干预组pp38的表达较空白组均有所上调,但干细胞组、强的松组pp38的表达量较阿霉素组少。结论:利用密度梯度离心法结合贴壁培养法能成功有效地获取大鼠骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞保护阿霉素肾病大鼠的可能机制:BMSCs能抑制p38和pp38的表达,并保护足细胞,从而达到减轻蛋白尿的目的。骨髓间充质干细胞在短期内(1周)对改善肾功能无明显作用。

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肾移植术后肾病复发或新发患者的临床病理特点及中医证型分析

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作者：王科福建中医学院

学位级别：硕士

目的:1.探讨肾移植术后肾病复发或新发患者的临床、病理特点及预后。2.探讨移植肾病复发或新发患者的中医证型特点,为临床治疗提供辨证依据。资料与方法:1.选取2004年1月至2009年2月在南京军区福州总医院泌尿外科行移植肾穿刺的患者。... 详细信息

目的:1.探讨肾移植术后肾病复发或新发患者的临床、病理特点及预后。2.探讨移植肾病复发或新发患者的中医证型特点,为临床治疗提供辨证依据。资料与方法:1.选取2004年1月至2009年2月在南京军区福州总医院泌尿外科行移植肾穿刺的患者。共收集诊断为肾病复发或新发的病例34例(A组),非肾病复发或新发组(B组)40例,同时搜集与A组患者同一供肾患者共25例(C组)。2.观察所有患者术前一般状况、穿刺前1周的临床资料及各组患者术后移植肾1年、3年、5年存活情况;3.在穿刺前一周对A组患者进行中医辨证分型,分析A组患者的中医证型特点。结果:1.三组患者术前年龄、性别、再次移植、免疫药物应用、PRA水平均无明显差异(P＞0.05);2.穿刺前1周SCr、BUN及蛋白尿水平,A组明显大于C组(P＜0.05);B组肌酐和尿素氮水平明显大于A组和C组(P＜0.05),但蛋白尿程度和A组、C组相比差异不明显;3.A组移植肾5年存活率明显低于C组(P＜0.05),余各组比较差异不显著(P＞0.05);三组移植肾1年存活率依次为97%、100%、100%,3年存活率依次为85.3%、97.5%、96%,三组短期存活率相比均无明显差异;4.本组研究中,肾病复发或新发组中肾病的主要类型有:IgAN 10例(29.41%),FSGS 7例(20.59%),MPGN 6例(17.65%),MsPGN 6例(17.65%)、MN 5例(14.71%),SLE-LN 1例(2.94%)6种;5.A组患者中医证型分布以肝肾阴虚证12例(35.3%)、脾肾气虚证8例(23.53%)和血瘀证8例(23.53%)最为常见,而气阴两虚证3例(8.82%)、阴虚内热证1例(2.94%)较少见。结论:1.肾病复发或新发患者在肾功能出现异常时,移植肾功能及蛋白尿均较同一供肾组严重,但没有非复发组重;2.复发或新发肾病对移植肾长期存活有影响,但对短期存活无明显影响;3.复发或新发肾病较常见的类型有FSGS,IgAN,MN,MPGN,LN,MSPGN六种;4.肾病复发或新发患者中以肝肾阴虚证、脾肾气虚证及血瘀证最为常见,而气阴两虚证、阴虚内热证相对较少。

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苦杏仁甙免疫活性和抗肾脏纤维化作用的实验研究

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作者：盛明雄福建医科大学

学位级别：硕士

目的:1、探讨苦杏仁甙对体外人淋巴细胞增殖的影响。2、研究苦杏仁甙对体外人淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、γ-IFN和TGF-β1的影响。方法:1、用MTT比色法检测不同浓度苦杏仁甙对PHA诱导的体外人淋巴细胞增殖的影响。2、ELISA法检测淋巴细... 详细信息

目的:1、探讨苦杏仁甙对体外人淋巴细胞增殖的影响。2、研究苦杏仁甙对体外人淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、γ-IFN和TGF-β1的影响。方法:1、用MTT比色法检测不同浓度苦杏仁甙对PHA诱导的体外人淋巴细胞增殖的影响。2、ELISA法检测淋巴细胞培养上清中的细胞因子IL-2、γ-IFN和TGF-β1浓度。结果:1、苦杏仁甙在25～800μg·mL-1范围内显著促进PHA诱导的人外周血T淋巴细胞增殖,浓度为200μg·mL-1时促进增殖作用最强,SI值高达1.67。2、苦杏仁甙可促进PHA刺激的外周血淋巴细胞分泌IL-2和γ-IFN,而抑制其分泌TGF-β1,并呈剂量依赖性。结论:苦杏仁甙能显著促进PHA诱导的人外周血T淋巴细胞增殖;并可促进经PHA刺激的外周血淋巴细胞分泌IL-2和γ-IFN,而抑制其分泌TGF-β1,从而发挥免疫增强作用。第二部分:苦杏仁甙抑制肾脏间质纤维化的实验研究实验一:苦杏仁甙抑制成人肾脏纤维细胞增殖的实验研究目的:探讨苦杏仁甙对成人肾脏纤维细胞增殖实验的影响。方法:用消化法原代培养人肾成纤维细胞并用免疫细胞化学方法鉴定,继而采用MTT比色法检测苦杏仁甙对人肾成纤维细胞增殖的影响。结果:培养24h时,对照组与不同浓度苦杏仁甙组的成纤维细胞增殖无统计学差异。培养48h或72h时,不同浓度苦杏仁甙对成纤维细胞的增殖活性均有抑制作用,且呈一定剂量依赖性,在苦杏仁甙浓度100μg·mL-1时抑制作用最强,抑制率分别达31.53%和17.41%。结论:苦杏仁甙能明显抑制人肾成纤维细胞增殖并呈剂量依赖性。实验二:苦杏仁甙抑制大鼠肾间质纤维化的实验研究目的:观察苦杏仁甙治疗单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化作用并探讨其机理。方法:用单侧输尿管梗阻的方法建立大鼠肾脏间质纤维化模型。60只Wistar大鼠随机分为假手术组、单侧输尿管梗阻组、苦杏仁甙3mg腹腔注射组和苦杏仁甙5mg腹腔注射组,分别于术后7d、14d、21d处死动物,观察各组大鼠肾脏病理损害程度。结果:除假手术组外其余各组随着时间的延长,肾间质纤维化的程度越来越严重。苦杏仁甙治疗组在7天和14天时与单侧输尿管梗阻组差别无统计意义,在21天时大鼠肾脏纤维化程度明显低于单侧输尿管梗阻组。结论:苦杏仁甙具有明显抑制大鼠肾间质纤维化作用。

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骨髓间充质干细胞对大鼠足细胞损伤的保护作用的研究

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作者：胡鹤一福建医科大学

学位级别：硕士

目的：探讨大鼠BMSCs对大鼠肾脏足细胞损伤的保护作用研究。方法：1.从SD大鼠骨髓中提取MSCs，经体外扩增、纯化并进行鉴定。2.从SD大鼠肾脏中提取足细胞，经体外培养、并进行鉴定。3.体外实验，分组：正常组：足细胞;阿霉素组：足... 详细信息

目的：探讨大鼠BMSCs对大鼠肾脏足细胞损伤的保护作用研究。方法：1.从SD大鼠骨髓中提取MSCs，经体外扩增、纯化并进行鉴定。2.从SD大鼠肾脏中提取足细胞，经体外培养、并进行鉴定。3.体外实验，分组：正常组：足细胞;阿霉素组：足细胞+阿霉素（2ug/ml）;干细胞组：足细胞+BMSCs（共培养24h）+阿霉素（2ug/ml）。各实验组干预24h、48h、72h后通过流式细胞术检测各组足细胞的凋亡率。12h、24h、48h后通过RT-PCR和Real time PCR测nephrin、synaptopodin mRNA的表达。Western bolt技术检测各组24h、48h、72h足细胞骨架相关蛋白nephrin、synaptopodin的表达。结果：1.流式细胞仪结果示：24h正常组凋亡率为19.1%，24h阿霉素组凋亡率为45.4%，24h干细胞组凋亡率为22.7%，24h干细胞组与阿霉素组相比足细胞的凋亡显著减少，减少有统计学意义（P＜0.01）。48h正常组凋亡率为22.4%，48h阿霉素组凋亡率为32.5%，48h干细胞组凋亡率为26.2%，48h干细胞组与阿霉素组相比足细胞的凋亡减少，减少无统计学意义（P＞0.05）.72h正常组凋亡率为17.7%，72h阿霉素组凋亡率为29.6%，72h干细胞组凋亡率为28.7%，72h干细胞组与阿霉素组相比足细胞的凋亡减少，减少无统计学意义（P＞0.05）。 2.RT-PCR电泳示：12h、24h、48h各时间点正常组、阿霉素组和干细胞组nephrinmRNA的表达无明显差异。24h和48h阿霉素组和干细胞组synaptopodin mRNA的表达比正常组减少，24h和48h干细胞组synaptopodin mRNA的表达比阿霉素组明显增加。 3. Real time PCR结果示：12h、24h、48h各时间点正常组、阿霉素组和干细胞组nephrin mRNA的表达无明显差异。48h阿霉素组和干细胞组synaptopodin mRNA的表达比正常组减少，48h干细胞组synaptopodin mRNA的表达比阿霉素组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。 4. Western bolt结果示：24h、48h、72h正常组、阿霉素组和干细胞组nephrin蛋白的表达无明显差异。48h干细胞组与阿霉素组相比synaptopodin蛋白表达明显增高，24h、72h正常组、阿霉素组和干细胞组synaptopodin的表达无明显差异。结论：1.大鼠BMSCs在体外可以保护阿霉素诱导的足细胞的凋亡。 2.大鼠BMSCs能够增加阿霉素诱导损伤的足细胞synaptopodin mRNA的表达。 3.大鼠BMSCs能够增加阿霉素诱导损伤的足细胞synaptopodin蛋白的表达。

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骨髓间充质干细胞对阿霉素大鼠足细胞骨架F-actin的影响及机制探讨研究

骨髓间充质干细胞对阿霉素大鼠足细胞骨架F-actin的影响及机制探...

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作者：罗流涛福建医科大学

学位级别：硕士

第一部分大鼠BMSCs的提取、培养及鉴定目的：通过密度梯度离心法分离和提取大鼠骨髓间充质干细胞获得适合实验的骨髓间充质干细胞方法：1.无菌条件下分离SD大鼠股、胫骨,采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化BMSCs,通过传代培养... 详细信息

第一部分大鼠BMSCs的提取、培养及鉴定目的：通过密度梯度离心法分离和提取大鼠骨髓间充质干细胞获得适合实验的骨髓间充质干细胞方法：1.无菌条件下分离SD大鼠股、胫骨,采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化BMSCs,通过传代培养,扩增和提纯BMSCs。倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长特征。 2.成骨诱导试剂和成脂诱导试剂诱导BMSCs向成骨和成脂分化，用VonKossa染色法染色成骨细胞，用油红O染色成脂细胞。 3.用流式细胞测定骨髓间充质干细胞表面标志物CD29、CD34、CD45、CD90。结果:镜下BMSCs呈梭形、多角形成纤维细胞样形态,大小均一,漩涡状生长。BMSCs在分别加入成骨和成脂诱导剂后能分别诱导出成骨和成脂细胞。BMSCs表面标志显示第3代BMSCs纯度可达95%以上,其细胞表型CD29和CD90呈阳性表达, CD34和CD45呈阴性表达。结论：用密度梯度离心法分离出来较纯的骨髓间充质干细胞，并且纯度能达到实验要求第二部分大鼠足细胞原代的提取、培养及鉴定目的：通过过筛法分离肾小球，并进行足细胞原代培养，获得符合实验要求的足细胞。方法：1.用80目，150目，200目网筛分离肾小球，并在倒置显微镜下观察肾小球形态。 2.用Ⅳ型胶原酶消化肾小球，种植在用Ⅰ型胶原包被的培养瓶中培养，5d后在倒置显微镜下观察肾小球和培养出的细胞形态。 3.用免疫荧光方法检测细胞上neprin和WT-1表位。结果：用网筛法分离出较纯肾小球，并用Ⅳ型胶原酶消化后种植在培养瓶中3天左右从肾小球中爬出成鹅卵石样细胞，经nephrin和WT-1鉴定nephrin能在培养的细胞质和包膜上显色，WT-1在培养的细胞核周围显色。结论：用Ⅳ型胶原酶消化法能培养出细胞，且培养出的细胞为足细胞，符合实验要求。第三部分大鼠BMSCs对阿霉素大鼠足细胞骨架F-actin的影响及机制探讨研究目的：研究骨髓间充质干细胞对阿霉素引起的足细胞骨架F-actin的重排的保护作用及机制方法：1.BMSCs对阿霉素引起的足细胞骨架F-actin重排分组：正常组：足细胞，阿霉素组：足细胞+阿霉素干细胞预治疗组：MSC+足细胞（共培养24h）+阿霉素干细胞治疗组：MSC+足细胞+阿霉素地塞米松预治疗组：DEX+足细胞（共培养24h）+阿霉素地塞米松治疗组：DEX+足细胞+阿霉素各实验组干预12h，24h，48h，72h，5d后用Texas Red–X phalloidin细胞荧光染各细胞骨架F-actin。 2.BMSCs对阿霉素引起的足细胞骨架F-actin重排机制探讨分组：正常组：足细胞阿霉素组：足细胞+阿霉素干细胞对照组：MSC+足细胞（共培养24h）干细胞治疗组：MSC+足细胞（共培养24h）+阿霉素地塞米松对照组：DEX+足细胞（共培养24h）地塞米松治疗组：DEX+足细胞（共培养24h）+阿霉素各个实验组用western blotting方法测量足细胞加入阿霉素后各个时间点（0min，1min，3min，7min，15min，30min，1h，3h，6h，12h，24h）p-p38变化，然后用western blotting方法测量各个实验组干预7min时p-p38。结果：1.用Texas Red–X phalloidin细胞荧光染色各实验组细胞骨架F-actin结果：（1）阿霉素组24h时开始诱导足细胞细胞凋亡，但是足细胞骨架无明显变化，阿霉素组在48h时诱导足细胞骨架F-actin解聚和紊乱，在72h细胞接近凋亡，细胞内几乎无F-actin，而5d细胞凋亡。（2）干细胞预治疗组和干细胞治疗组、地塞米松预治疗组和地塞米松治疗组能够在48h、72h、5d相比模型组能够阻止足细胞骨架F-actin重组。（3）干细胞预治疗组和干细胞治疗组，地塞米松组和地塞米松治疗组在阻止足细胞骨架F-actin重组方面类似。 2. Western bolt结果示：（1）在足细胞加入阿霉素后1min，3min，7min，15min，30min的p-p38变化7min时表达最多，而在1h，3h，6h，12h，24h时pp38逐渐减弱。（2）在7min时干细胞组和地塞米松组pp38相对阿霉素组表达减少，而地塞米松组相对干细胞组pp38表达减少。结论：1.干细胞能保护阿霉素足细胞骨架F-actin损害，且预治疗组和治疗组效果相似。 2.干细胞和地塞米松可能是通过p38途径保护阿霉素足细胞骨架F-actin损害。第四部分大鼠BMSCs在阿霉素肾病大鼠体内示踪目的：通过小动物活体成像仪结合病理切片示踪干细胞在阿霉素肾病大鼠。方法：1.BMSCs在阿霉素肾病大鼠体内示踪分组：空白对照组：注射生理盐水阴性对照组：注射未染色干细胞干细胞对照组：染色后的干细胞注射到正常大鼠体内干细胞组：染色后的干细胞注射到阿霉素肾病大鼠体内 2.干细胞组注射盐酸阿

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移植肾CD20阳性淋巴细胞浸润的临床意义及受者中医分型特点

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作者：吴晨光福建中医学院

学位级别：硕士

【目的】(1)探讨CD20阳性细胞在移植肾排斥反应中浸润程度与移植肾预后的关系;(2)探讨CD20阳性细胞浸润患者的中医证型分布特点。【方法】选取2003年2月至2008年12月共129例在南京军区福州总医院泌尿外科行移植肾穿刺的患者。其中有93... 详细信息

【目的】(1)探讨CD20阳性细胞在移植肾排斥反应中浸润程度与移植肾预后的关系;(2)探讨CD20阳性细胞浸润患者的中医证型分布特点。【方法】选取2003年2月至2008年12月共129例在南京军区福州总医院泌尿外科行移植肾穿刺的患者。其中有93例有完整随访资料,被列入研究对象。其中男性67例,女性26例。肾活检组织标本行CD20免疫组化染色。并对病理结果行半定量分析,根据CD20阳性细胞在肾组织内浸润程度,分为重度浸润组(H组,＞50%小管间质面积),中度浸润组(M组,10%～50%),阴性组(N组,＜10%)。分析CD20阳性细胞浸润的程度与移植肾预后的相关性。参照中医证候学诊断标准(中华中医学会第三次中医肾病会议通过,见附录),探讨CD20阳性细胞浸润患者的中医证型分布特点。所有行病例均随访至2008年12月31日,随访内容包括患者穿刺活检后的临床资料和治疗反应情况,随访内容包括患者的肌酐、蛋白尿变化及移植肾的生存状况等指标。【结果】在93例患者中H组(重度浸润组)有20例,M组(中度浸润组)25例,N组(阴性组)48例。(1)三组患者在年龄、性别、组织活检时间以及移植的次数均没有明显差异(P＞0.05)。(2)穿刺活检后12个月的肌酐N组(276.79±240.78μmol/L)低于M组(360.16±290.30μmol/L):M组低于H组(466.50±330.53μmol/L)P＜0.05。(3)CD20阳性浸润组的患者,4年生存率明显低于阴性组(P＜0.05)。(4)穿刺活检后12个月内,N组穿刺后出现蛋白尿的几率明显低于M组和H组(P＜0.05)。(5)CD20阳性细胞浸润的患者,证型分布特点是以肝肾阴虚型(33.33%)和血瘀型(26.67%)最为常见,其次为肝肾气虚型(17.78%)和气阴两虚型(13.33%),而脾肾阳虚型(6.67%)和阴阳两虚型(2.22%)相对较少。【结论】(1)CD20阳性细胞在肾移植内浸润的程度与移植肾预后有明显相关性;(2)CD20阳性细胞浸润的患者,证型分布特点是以肝肾阴虚型(33.33%)和血瘀型(26.67%)最为常见,其次为肝肾气虚型(17.78%)和气阴两虚型(13.33%),而脾肾阳虚型(6.67%)和阴阳两虚型(2.22%)相对较少。

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骨髓间充质干细胞经EGFR通路介导足细胞损伤修复的研究

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作者：林志杰福建医科大学

学位级别：硕士

研究目的:探究骨髓间充质干细胞调控足细胞骨架蛋白修复的信号通路。方法:1、利用全骨髓贴壁法从SD大鼠股骨中分离BMSCs并培养至P3代,运用体外成骨及成软骨诱导鉴定其功能。2、利用过筛法及IV型胶原酶消化法从SD大鼠肾脏中分离足细胞,... 详细信息

研究目的:探究骨髓间充质干细胞调控足细胞骨架蛋白修复的信号通路。方法:1、利用全骨髓贴壁法从SD大鼠股骨中分离BMSCs并培养至P3代,运用体外成骨及成软骨诱导鉴定其功能。2、利用过筛法及IV型胶原酶消化法从SD大鼠肾脏中分离足细胞,并利用免疫荧光检测其特异性蛋白Synaptopodin及Podocin。3、用ELISA法检测BMSCs上清液中EGF含量及其随时间的变化关系。4、设置0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml浓度梯度的盐酸阿霉素与足细胞培养作为对照组,另外设置同样阿霉素浓度+10ng/ml EGF的实验组,CCK-8法检测48h内不同时间点各组足细胞活力;5、将分化完全的足细胞分成4个分组:正常组:足细胞阿霉素组:足细胞+盐酸阿霉素(2μg/ml)干细胞组:足细胞+盐酸阿霉素(2μg/ml)+BMSCs(共培养24h)表皮生长因子(EGF)组:足细胞+盐酸阿霉素(2μg/ml)+EGF(10ng/ml),各实验组干预24h后收集足细胞,利用Western blot法检测各实验组间EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR及Synaptopodin等蛋白的表达情况。结果:1、大鼠BMSCs培养至P3代时镜下观表现为均一梭形结构,呈漩涡状生长,速度快,经成骨诱导及成软骨诱导鉴定后可呈现MSC特征样的显色反应。2、利用差异过筛法从肾脏组织中分离出肾小球足细胞,显微镜下见培养皿中细胞呈鹅卵石样排列,胞体大,表面见不规则足突样隆起。免疫荧光染色显示细胞在特定激发光下显示Synaptopodin和Podocin的荧光。3、BMSCs在体外培养时可向周围环境中释放EGF,后者浓度增长随时间呈先快后慢的趋势,在24-48h左右稳定于12000-13000pg/ml。4、2μg/ml阿霉素作用于足细胞24h时,阿霉素对足细胞的增殖能力抑制最明显,同时10ng/ml EGF刺激足细胞修复的效应也最显著。5、Western blot结果显示:干预24h后,相对于正常组,阿霉素组的p-EGFR、p-AKT、m TOR、p-m TOR及骨架蛋白Synaptopodin灰度值水平均显著下降。干细胞组的各个蛋白灰度值水平也出现不同程度下降,但与阿霉素组比较降低幅度小;EGF组较正常组也出现各蛋白灰度水平下降,变化程度与干细胞组相似。结论:1、全骨髓贴壁法可成功从大鼠股骨中分离并培养出BMSCs,且细胞生长速度快,并具备多向分化潜能,可用于进行体外科研研究。2、差异过筛法及IV型胶原酶消化法可从大鼠肾脏中提取足细胞,并能在体外表达特异性蛋白Synaptopodin及Podocin。3、体外条件下BMSCs与足细胞共培养可修复由阿霉素作用引起的足细胞骨架蛋白Synaptopodin破坏,BMSCs可上调足细胞膜表面EGFR的磷酸化水平,引起一系列下游的相关蛋白包括p-AKT、m TOR及p-m TOR也表现出相同程度的变化,促进细胞蛋白转录与骨架蛋白形成,其作用效果与单纯EGF刺激相似。这一现象揭示了BMSCs可通过分泌EGF激活足细胞EGFR通路促进蛋白转录翻译而发挥抗损伤的作用。

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骨髓间充质干细胞对卵巢颗粒细胞凋亡的作用研究

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作者：凌志杰福建医科大学

学位级别：硕士

目的：探讨大鼠BMSCs对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用。方法：1.从SD大鼠骨髓中提取MSCs,经体外扩增、纯化并进行鉴定。2.体外实验,采用3周龄左右的雌性SD大鼠,皮下注射60单位的孕马血清,48小时后无菌条件下取出双侧卵巢,用皮试针针头在... 详细信息

目的：探讨大鼠BMSCs对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用。方法：1.从SD大鼠骨髓中提取MSCs,经体外扩增、纯化并进行鉴定。2.体外实验,采用3周龄左右的雌性SD大鼠,皮下注射60单位的孕马血清,48小时后无菌条件下取出双侧卵巢,用皮试针针头在体视镜下刺破各卵泡,冲出颗粒细胞。颗粒细胞在体外扩增、纯化并进行鉴定。用MTT法得出顺铂对颗粒细胞的半抑制浓度及最佳干预时间。采用半抑制浓度的30%即5mg/L作为实验的干预浓度,干预时间为72h。体外实验分为：G0组颗粒细胞;G5组颗粒细胞+5mg/L顺铂;GM5组颗粒细胞+5mg/L顺铂+BMSCs。GM5组采用Millicell共培养小室把颗粒细胞和BMSCs分上下两层进行共培养,BMSCs分泌的细胞因子可以自由通过。实验各组干预72h后,通过流式细胞术检测各组颗粒细胞的凋亡率,RT-PCR技术检测各组颗粒细胞凋亡相关基因的表达情况。3.体内实验分为四组：空白对照组、MSCs组、雌激素组、青年组。前三组采用9-10月龄的SD雌性大鼠各15只,青年组采用15只3-4月龄的SD雌性大鼠。通过阴道脱落细胞监测前三组围绝经模型鼠进入围绝经后,空白组通过尾静脉输注2mL的生理盐水,一周后重复注射等量生理盐水;MSCs组经尾静脉输注2ml含1～2×106MSCs,一周后注射相同剂量MSCs细胞悬液;雌激素组灌用生理盐水溶解的尼尔雌醇,按0.158mg/(kg. d)灌胃给药,连续给药8w;青年组采用3月龄左右的SD大鼠经尾静脉注射2ml的生理盐水,一周后重复注射等量生理盐水。实验各组干预后第一、三个月,分别处死各组SD大鼠5只,取左侧卵巢经固定、切片做TUNEL凋亡检测,在显微镜下统计颗粒细胞的凋亡率。结果：体外实验结果显示：G0、G5、GM5各组凋亡率分别为0.59%、13.04%、4.84%。凋亡相关基因表达情况分别为：Survivn GO>GM5>G5;P21 G5>GO>GM5;Cmy-c GO>GM5>G5;Bax G5>GO>GM5;Bcl-2 GO>GM5>G5。(G5组与GM5组各基因的表达相对量进行比较,其中P21, Cmy-c, Bax统计值P＜0.05有统计学意义;而G5组与GM5组Bcl-2, Survivn统计值P＞0.05无统计学意义)。体内实验结果显示在干预一个月后实验各组卵巢颗粒细胞的凋亡率分别为：空白组9.90±3.23%、MSCs组6.10±2.63%(P=0.075)、雌激素组6.60±3.13%(P=0.139)、青年组1.53±1.44%(P=0.001);干预三个月后实验各组卵巢颗粒细胞的凋亡率分别为：空白组14.60±3.51%、MSC组8.29±3.35%(P=0.02)、雌激素组10.53±2.29%(P=0.062)、青年组3.56±1.44%(P＜0.01)(P为实验组与空白组卵巢颗粒细胞凋亡率统计值,P＜0.05差异有统计学意义)。结论：大鼠BMSCs在体内可以保护围绝经大鼠的卵巢颗粒细胞,减少其凋亡;在体外BMSCs可以保护顺铂诱导大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡。综合体内、外实验结果：大鼠BMSCs具有抑制大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用。

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骨髓间充质干细胞对阿霉素损伤足细胞mTOR的影响

引用

作者：付军明福建医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨大鼠BMSCs对阿霉素损伤足细胞m TOR的影响。方法:1、利用密度梯度离心法结合贴壁分离法从SD大鼠骨髓中提取BMSCs,经体外传代、扩增至P3,并利用流式细胞仪鉴定其表面标志物CD29、CD34、CD45、CD90,同时运用成软骨和成脂诱导方... 详细信息

目的:探讨大鼠BMSCs对阿霉素损伤足细胞m TOR的影响。方法:1、利用密度梯度离心法结合贴壁分离法从SD大鼠骨髓中提取BMSCs,经体外传代、扩增至P3,并利用流式细胞仪鉴定其表面标志物CD29、CD34、CD45、CD90,同时运用成软骨和成脂诱导方法鉴定其功能。2、利用过筛法和IV型胶原酶消化法从SD大鼠肾脏中提取足细胞,经体外培养,并通过免疫荧光法检测其表面特有的蛋白nephrin和podocin对其进行鉴定。3、体外实验,分为:正常组足细胞;阿霉素组足细胞+阿霉素(2ug/ml);干细胞组足细胞+BMSCs(共培养24h)+阿霉素(2ug/ml)。各实验组干预0h、3h、24h后利用Western bolt技术检测各组足细胞骨架相关蛋白nephrin及m TOR信号通路相关蛋白m TOR、p-m TOR、raptor、rictor的表达情况。结果:1、显微镜下观察BMSCs呈梭形、多角形成纤维细胞样形态,大小基本一致。BMSCs在分别加入成软骨和成脂诱导剂下成功诱导出成软骨细胞和脂肪细胞。利用流式细胞仪检测BMSCs表面的抗原标志物提示CD29、CD90呈强阳性,CD34和CD45呈阴性表达。细胞纯度可达98%以上。2、利用过筛法可以成功分离出肾小球,用IV型胶原酶消化后种植在培养瓶中能从肾小球中爬出成鹅卵石样细胞,利用免疫荧光法检测其表面可以表达出足细胞特有的蛋白nephrin和podocin。3、Western bolt结果显示:在0小时和3小时时,正常组、阿霉素组、干细胞组nephrin和rictor的表达无明显差异;在24小时时,干细胞组和阿霉素组的nephrin的表达均比正常组少,但干细胞组比阿霉素组的表达多,同时干细胞组和阿霉素组的rictor的表达均比正常组多,但干细胞组比阿霉素组的表达少。m TOR、p-m TOR、raptor蛋白在0小时时,正常组、阿霉素组、干细胞组的表达无明显差异,但是在3小时、24小时时,干细胞组和阿霉素组的表达均比正常组多,但干细胞组比阿霉素组的表达少,且24小时时的表达量均大于3小时时的表达量。结论:1、利用密度梯度离心法结合贴壁筛选法能成功提取、培养出BMSCs,并且其纯度高、活性高、增殖能力强及多向分化潜能,可用于实验研究。2、利用过筛法和IV型胶原酶消化法能成功提取、培养出符合实验要求的足细胞。3、AMD足细胞的损伤机制与足细胞m TOR过度激活有关,从而导致足细胞的功能紊乱。大鼠BMSCs可能通过抑制m TOR活性,保护阿霉素损伤足细胞,使nephrin蛋白的表达增加。

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