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Th1/Th2型细胞因子对人乳腺癌细胞系MCF-7的生物学行为及ER表达的影响

Th1/Th2型细胞因子对人乳腺癌细胞系MCF-7的生物学行为及ER表达的...

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作者：段红洁天津医科大学

学位级别：硕士

目的:以人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,探讨Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4对MCF-7的生物学行为的影响及机制以及其对雌激素受体(estrogen receptor,ER)亚型表达的影响。方法:*** IFN-γ和rh IL-4对MCF-7细胞生长特性的影响。... 详细信息

目的:以人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,探讨Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4对MCF-7的生物学行为的影响及机制以及其对雌激素受体(estrogen receptor,ER)亚型表达的影响。方法:*** IFN-γ和rh IL-4对MCF-7细胞生长特性的影响。MCF-7细胞进行常规体外培养,以不同浓度rh IFN-γ(0.1、1、10、50、100、250ng/m L)或rh IL-4(0.1、1、5、10、25ng/m L)分别处理细胞24、48、72、96h,MTT法检测细胞的增殖状况以确定最佳的工作浓度和工作时间。以此为基础,细胞分组如下:空白对照(无rh IFN-γ或rh IL-4处理)、M/IFN-γ(100ng/m L rh IFN-γ处理细胞96h)及M/IL-4(10ng/m L rh IL-4处理细胞96h)三组。采用流式细胞术分析各组的细胞周期分布情况;RT-PCR检测各组的凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xl和XIAP的m RNA表达情况。*** IFN-γ和rh IL-4对MCF-7细胞成瘤、侵袭和转移能力的影响。采用双层软琼脂集落形成实验检测各组细胞的体外成瘤能力;细胞黏附实验检测各组细胞的黏附能力;采用RT-PCR和Western blot检测各组促血管生成因子VEGF及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达情况;再利用Western blot检测各组的PI3K/Akt、Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中Akt和Erk的磷酸化水平。*** IFN-γ和rh IL-4对MCF-7细胞ER表达水平的影响。采用Western blot检测各组ERα和ERβ的蛋白表达水平;采用ELISA检测MCF-7细胞分泌的IFN-γ和IL-4的水平;以相当于自分泌水平的rh IFN-γ或rh IL-4处理MCF-7细胞96h后,RT-PCR和Western blot检测细胞ERα和ERβ的表达水平。结果:***结果表明,与空白对照组相比,以100ng/m L rh IFN-γ处理MCF-7细胞96h后,可明显抑制细胞的增殖(1.07±0.05 vs 0.87±0.05,P<0.01);M/IFN-γ组G01期细胞比例增多[(55.42±2.28)%vs(66.98±0.88)%,P<0.01],S期比例明显减少[(27.61±3.11)%vs(15.36±0.94)%,P<0.01],G2期所占比例无显著变化;M/IFN-γ组各凋亡抑制基因的表达水平无显著差异。与空白对照组相比,以10ng/m L rh IL-4处理MCF-7细胞96h后,可明显促进细胞的增殖(1.07±0.05 vs 1.38±0.06,P<0.01);M/IL-4组G01期细胞比例减少[(55.42±2.28)%vs(37.77±5.93)%,P<0.01],S期比例明显增多[(27.61±3.11)%vs(45.45±4.15)%,P<0.01],G2期所占比例无显著变化;M/IL-4组凋亡抑制基因Bcl-2(1.35±0.02 vs 2.25±0.03,P<0.01)、Bcl-xl(1.33±0.01 vs 2.27±0.02,P<0.01)及XIAP(0.35±0.01 vs 0.60±0.03,P<0.01)的表达水平均升高。2.与空白对照组相比,M/IFN-γ组的集落形成数目减少(112.00±3.95 vs74.12±1.11,P<0.01);M/IFN-γ细胞黏附能力无显著差异;M/IFN-γ组的VEGF的m RNA(0.71±0.03 vs 0.45±0.02,P<0.01)和蛋白(1.12±0.08 vs 0.78±0.03,P<0.01)表达水平均明显下降;MMP-9的m RNA(0.29±0.03 vs 0.09±0.00,P<0.01)和蛋白(1.00±0.10 vs 0.81±0.03,P<0.01)表达水平显著下降,而MMP-2的表达水平无明显变化;M/IFN-γ组的Akt的磷酸化水平无显著变化,但Erk的磷酸化水平明显下降(1.33±0.01 vs 0.88±0.02,P<0.01)。与空白对照组相比,M/IL-4组的集落形成数目显著增多(112.00±3.95 vs144.23±4.89,P<0.05);M/IL-4细胞黏附Matrigel的能力显著增强[100.00%vs(128.57±5.97)%,P<0.05];M/IL-4组的VEGF的m RNA(0.71±0.03 vs1.11±0.07,P<0.01)和蛋白(1.12±0.08 vs 1.36±0.11,P<0.01)表达水平显著升高;MMP-2的m RNA(0.11±0.00 vs 0.52±0.12,P<0

关键词：乳腺癌 MCF-7 Th1/Th2平衡 IFN-γ IL-4 ERα ERβ

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EZH2通过抑制p21的表观遗传表达增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性

EZH2通过抑制p21的表观遗传表达增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性

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作者：张萃萃天津医科大学

学位级别：硕士

目的:乳腺癌是当今世界范围内女性死亡的一个重要原因。尽管有许多临床治疗方案被用来治疗乳腺癌,且已经取得了一定的疗效,但是整体治疗效果尚无法令人满意,耐药问题一直是乳腺癌药物使用的主要障碍。因此,乳腺癌治疗的关键是要破译耐... 详细信息

目的:乳腺癌是当今世界范围内女性死亡的一个重要原因。尽管有许多临床治疗方案被用来治疗乳腺癌,且已经取得了一定的疗效,但是整体治疗效果尚无法令人满意,耐药问题一直是乳腺癌药物使用的主要障碍。因此,乳腺癌治疗的关键是要破译耐药性的核心分子机制,以获得长期持久的药物效果。本研究旨在通过人乳腺癌细胞系体外实验系统地探讨EZH2参与乳腺癌对紫杉醇的耐药过程及其涉及的核心机制,为改善乳腺癌患者的化疗耐药及临床治疗提供重要的实验依据。方法:选取两种人乳腺癌细胞系(MCF-7和ZR-75-30),并建立紫杉醇耐药乳腺癌细胞系MCF-7R和ZR-75-30R;1.应用MTS技术检测紫杉醇在不同剂量、不同作用时间对乳腺癌细胞增殖水平的影响;2.应用q-PCR技术检测MCF-7和ZR-75-30及其耐药系MCF-7R和ZR-75-30R细胞中EZH2和p21的mRNA水平;3.应用Western Blotting技术检测MCF-7和ZR-75-30及其耐药系MCF-7R和ZR-75-30R细胞中EZH2和p21的蛋白表达水平;4.应用台盼蓝染色和流式细胞术检测EZH2 siRNA(siEZH2)干扰的MCF-7和EZH2过表达(EZH2OE)的MCF-7R细胞经紫杉醇诱导后的细胞凋亡的变化;5.应用台盼蓝染色和流式细胞术检测p21 siRNA(sip21)干扰的MCF-7R和p21过表达(p21OE)的MCF-7细胞经紫杉醇诱导后的细胞凋亡的变化;6.应用ChIP-qPCR技术检测p21分子中H3K27me3的富集情况;7.应用台盼蓝染色和流式细胞术检测siEZH2干扰的MCF-7细胞被sip21干扰和EZH2过表达(EZH2OE)的MCF-7R细胞p21过表达(p21OE)处理后,经紫杉醇诱导后细胞凋亡的变化。结果:1.在紫杉醇耐药乳腺癌细胞中,EZH2的mRNA水平和蛋白表达水平明显降低;***2的表达水平与乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性呈正相关;3.在紫杉醇耐药乳腺癌细胞中,p21的mRNA水平和蛋白表达水平显著升高;4.p21的表达水平与乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药呈正相关;5.紫杉醇耐药的乳腺癌细胞在p21启动子内H3K27 me3富集较低;6.p21可以弥补EZH2对于紫杉醇耐药性的衰减作用。结论:在本研究中,我们发现EZH2与乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性密切相关。干扰EZH2可以有效减少紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡。同时,使用细胞周期抑制剂p21可以降低紫杉醇诱导的细胞凋亡,相反的,干扰p21可以促进紫杉醇诱导的细胞凋亡。经研究表明,EZH2被招募到p21的启动子上,并伴随着H3K27me3的富集和p21的转录沉默。因此,我们认为EZH2通过抑制p21的表观遗传这种核心方式降低乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性。

关键词：乳腺癌紫杉醇耐药 EZH2 p21

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hTERT基因修饰雪旺细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤区神经修复相关蛋白表达的影响

hTERT基因修饰雪旺细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤区神经修复相关蛋...

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作者：刘琳琳天津医科大学

学位级别：硕士

目的:以逆转录病毒PLXSN为载体,将h TERT基因转染入体外培养的大鼠雪旺细胞,检测雪旺细胞端粒酶活性及细胞生物学特性的影响。进一步探讨h TERT基因修饰雪旺细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤区神经修复相关相关白表达的检测及对神经功能恢复... 详细信息

目的:以逆转录病毒PLXSN为载体,将h TERT基因转染入体外培养的大鼠雪旺细胞,检测雪旺细胞端粒酶活性及细胞生物学特性的影响。进一步探讨h TERT基因修饰雪旺细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤区神经修复相关相关白表达的检测及对神经功能恢复的影响。方法:体外培养大鼠雪旺细胞,经逆转录病毒PLXSN为载体介导端粒酶反转录酶（h TERT）基因转染雪旺细胞,体外培养Wistar大鼠雪旺细胞,经逆转录病毒PLXSN为载体介导端粒酶反转录酶（h TERT）基因转染,分为3组:对照组、阴性转染组、h TERT转染组。用RT-PCR,Western blot检测雪旺细胞在转染前后h TERT基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、MTT比色法观察细胞生长的优化作用;采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。成年雌性Wistar大鼠71只,造模成功66只,随机分为对照组,SCs组,h TERT-SCs组,22只/组,按照改良的Allen打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型。分别于造模前、造模后1天、3天、1周、2周、3周、4周通过BBB评分、斜板试验、改良的Tarlov评分进行运动功能评定。造模后72 h通过RT—PCR、Western blot检测脊髓损伤区周围AQP4/9、MMP9/2基因转录和蛋白的表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。造模后4周,HE染色及荧光显微镜观测PKH-26标记的SCs存活及分布情况,通过免疫组化法检测GFAP、Nogo及NF200的表达量,行HRP示踪观察神经纤维再生情况,通过SEP和MEP观察大鼠神经电生理恢复情况。结果:通过逆转录病毒PLXSN介导的h TERT基因转染大鼠雪旺细胞后,转染h TERT后,h TERT转染组与对照组、阴性转染组相比h TERT基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多。各组间有统计学差异（p＜0.05）。RT-PCR,Western blot检测显示转染h TERT基因的大鼠雪旺细胞体外能表达h TERT;大鼠下肢运动功能评价h TERT-SCs组优于SCs组,SCs组优于对照组。造模后72小时h TERT-SCs组细胞凋亡指数均明显低于对照组（p＜0.05）.造模后72小时,与对照组相比h TERT-SCs组AQP4/9基因和蛋白表达均较显著降低（p＜0.05）。造模后4周,HE染色对照组可见脊髓组织缺失及脊髓空洞形成,无神经轴索通过。SCs组损伤区可见少量神经轴索样结构,脊髓空洞较小,h TERT-SCs组可见较多神经轴索样结构,未见脊髓空洞。PKH-26标记的阳性细胞数:h TERT-SCs组最多,SCs组次之,对照组最少,且各组之间差异有统计学意义（p＜0.05）。造模后4周,h TERT-SCs组胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、神经丝蛋白（NF-200）的表达较对照组明显升高,差异有显著性意义（p＜0.05）,h TERT-SCs组Nogo蛋白的表达较对照组明显降低,差异有显著性意义（p＜0.05）,HRP阳性神经纤维数:h TERT-SCs组最多,SCs组次之,对照组最少,各组之间差异有统计学意义（p＜0.05）。SEP和MEP的潜伏期:h TERT-SCs组＜SCs组＜对照组,且各组之间差异有显著性意义（p＜0.05）;波幅:h TERT-SCs组＞SCs组＞对照组,且各组之间差异有显著性意义（p＜0.05）。结论:通过转录病毒PLXSN为载体介导端粒酶反转录酶（h TERT）基因转染使雪旺细胞端粒酶活性明显升高,能够促进体外培养的大鼠雪旺细胞增殖。h TERT基因修饰雪旺细胞移植可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,降低脊髓损伤区周围AQP/9、MMP9/2基因转录和蛋白的表达和神经细胞凋亡,促进胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、神经丝蛋白（NF-200）的表达的升高,降低Nogo蛋白的表达,改善大鼠的肢体运动功能和电生理功能。

关键词：端粒酶反转录酶基因转染大鼠雪旺细胞脊髓损伤 AQP4/9 MMP2/9 胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) 神经丝蛋白(NF-200,Nogo蛋白)

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面向大中型企业的协同系统的设计与实现

面向大中型企业的协同系统的设计与实现

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作者：方劼电子科技大学

学位级别：硕士

目前,不管是国外还是国内,其中大多数行业都是运用计算机进行操作办公。伴随着互联网的出现及快速的发展,现在各行各业都走进了信息化时代。在大型企业中办公自动化系统应用越来越广泛,但是传统的以工作流为核心的办公自动化系统早已跟... 详细信息

目前,不管是国外还是国内,其中大多数行业都是运用计算机进行操作办公。伴随着互联网的出现及快速的发展,现在各行各业都走进了信息化时代。在大型企业中办公自动化系统应用越来越广泛,但是传统的以工作流为核心的办公自动化系统早已跟不上现在信息时代的发展需求了。现今,科学家们重要的任务就是要设计一套以知识管理为核心的协同办公系统,以便更好地运用到各个大中型企业中,实现真正的办公自动化。本篇文章意在对企业办公系统展开深入的分析,从企业员工之间的交流、企业不同部门之间的信息沟通、以及企业之间的信息交流等各方面对企业的实际运行和管理,及其与企业经营的效益展开分析,并提出了一整套的办公协同办公系统。企业的办公协同办公系统是基于工作流基础之上的,以现代信息化管理为依据的新型的企业管理模式。本系统的设计平台是将现代信息技术融入于平台的应用当中,并针对公文流转和相关流程对其进行相应的分析。本篇文章针对这公文流转和表单定制使用了时序图和状态图等研究手段,并制定了相应的模块,这种系统主要是以工作流为核心,能够使企业实现协同办公,满足现代信息化管理的要求。因此,在进行研究过程中,我们对这种应用平台进行了其功能上的扩展与优化。另外,从平台设计方面的软件工程上主要针对公文流转的相关业务,对此系统进行了相对应的分析。这篇文章运用了时序图和状态图等一系列方法对主要业务流程进行了阐述,并设计出一套实现公文流转中表单定制和流程定制的功能模块,对表单定制结果运用图形化方法等提出了一些意见,以使此系统能够更好地满足人们的需要。

关键词： J2EE 协同办公工作流公文流转

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人卵巢癌细胞系SK-OV-3中肿瘤干/祖样细胞的研究

人卵巢癌细胞系SK-OV-3中肿瘤干/祖样细胞的研究

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作者：赵惠丰天津医科大学

学位级别：硕士

目的：肿瘤干／祖样细胞的分离及鉴定是肿瘤干／祖细胞研究领域中的关键性问题之一。本课题通过球形体形成法对人卵巢癌细胞系SK-OV-3中肿瘤干／祖样细胞进行分离、培养扩增,并对其干／祖样细胞的特性进行鉴定,为研究卵巢癌发病机理及... 详细信息

目的：肿瘤干／祖样细胞的分离及鉴定是肿瘤干／祖细胞研究领域中的关键性问题之一。本课题通过球形体形成法对人卵巢癌细胞系SK-OV-3中肿瘤干／祖样细胞进行分离、培养扩增,并对其干／祖样细胞的特性进行鉴定,为研究卵巢癌发病机理及治疗奠定基础。方法：1.球形体形成法分离人卵巢癌细胞系SK-OV-3中肿瘤干／祖样细胞。2.将以球形体形成法筛选出的球形体形成细胞于CM与SGM交替更换培养基观察其多向分化和自我更新的潜能。3.双层软琼脂集落形成实验软琼脂培养检测球形体形成细胞的非依赖性锚定生长能力。4.通过PI染色利用FCM观察球形体形成细胞的细胞周期分布特点。5.检测球形体形成细胞在10μg/ml DDP作用下的凋亡率,分析其对DDP的抵抗作用。6.流式细胞仪检测球形体形成细胞中SP细胞及ALDH+细胞的比例。7.实时荧光定量PCR检测球形体形成细胞中干／祖细胞基因Oct4、Nanog的表达情况。8.球形体形成细胞裸鼠体内致瘤性的检测。结果：1.人卵巢癌细胞系SK-OV-3细胞中的极少部分肿瘤干／祖样细胞可在无血清特殊生长培养基中以球形体样悬浮长并长期培养、扩增并可连续传代50代以上。2.球形体形成细胞可在CM中贴壁生长,再更换为SGM后,有极少部分细胞以球形体样悬浮。3.球形体形成细胞具有强锚定非依赖性生长能力,在双层软琼脂培养基中可呈克隆样生长,克隆形成率为6.83%,显著高于SK-OV-3细胞的克隆形成率0.41%。4.细胞周期结果表明：球形体形成细胞中处于G0／G1期的细胞高于SK-OV-3细胞。5.球形体形成细胞在10μg／ml DDP作用后的0、12、24、36小时的凋亡率依次为0.30%%、2.64%、3.13%、11.05%,而SK-OV-3细胞在同浓度DDP作用后的0、12、24、36小时的凋亡率依次为4.95%、9.59%、29.77%、44.23%,球形体形成细胞的有较强的对于DDP的抵抗性。6.流式细胞仪检测结果证实：球形体形成细胞中SP细胞(8.7%)、ALDH+细胞(25.05%)均高于SK-OV-3中SP细胞(0.6%)、ALDH+细胞(8.00%)的比例。7.通过实时荧光定量检测表明：球形体形成细胞中干／祖细胞基因Oct4、Nanog的表达较SK-OV-3细胞分别上调8.8925倍、9.8783倍。8.裸鼠移植试验还证实了球形体形成细胞的致瘤性比SK-OV-3细胞强100倍。结论：利用球形体形成法从人卵巢癌细胞系SK-OV-3中分离纯化出的球形体形成细胞在体外具有干／祖细胞的自我更新、无限增殖、多向分化、对DDP的抵抗性的特点及SP细胞和ALDH+细胞比例较高、干／祖细胞基因Oct4、Nanog上调,在裸鼠体内证实具有高致瘤性,初步表明这些球形体形成细胞具有肿瘤干／祖细胞的特性。

关键词：卵巢癌细胞系SK-OV-3 球形体形成细胞肿瘤干/祖样细胞分离鉴定

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抗CD44抗体A3D8对卵巢癌干/祖细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

抗CD44抗体A3D8对卵巢癌干/祖细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

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作者：王翠环天津医科大学

学位级别：硕士

目的：探讨抗CD44单克隆抗体A3D8对卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞增殖、凋亡和周期的影响,并探讨其诱导凋亡的可能作用机制,为治疗卵巢癌提供新的策略。方法：本实验用无血清特殊培法从卵巢癌患者腹水和实体瘤中筛... 详细信息

目的：探讨抗CD44单克隆抗体A3D8对卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞增殖、凋亡和周期的影响,并探讨其诱导凋亡的可能作用机制,为治疗卵巢癌提供新的策略。方法：本实验用无血清特殊培法从卵巢癌患者腹水和实体瘤中筛选卵巢癌干/祖细胞,以此种有耐药性的卵巢癌干/祖细胞作为模型。 1.用无血清特殊培养法筛选卵巢癌干/祖细胞。用抗CD44单克隆抗体A3D8分别为（0.2、2、6）μg/mL、2.5μg/mL顺铂及联合用药处理后,MTS法测定细胞生长增殖能力;***/EB双重染色法对卵巢癌细胞染色,荧光显微镜下观察不同剂量的A3D8及顺铂对细胞凋亡的影响;3.流式细胞术测定A3D8 2μg/mL作用24h、36h后,卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞周期分布;4.流式细胞术测定A3D8 2μg/mL对腹水球形体凋亡率的影响;5.用PCR半定量测定A3D8作用前后P21、P27、cyclinD1、cyclinA、CDK2、CDK4、Bcl-2基因表达差异;6. western blot检测A3D8作用前后对CDK2、cyclinA蛋白表达水平的影响。结果： 1.A3D8以时间和剂量依赖方式抑制卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞增殖。 2.不同剂量A3D8作用细胞后,AO/EB染色后,荧光显微镜下可看到活细胞核染色质被染成均匀的绿色,早期凋亡细胞被染成桔黄色,晚期凋亡细胞则被染成桔红色或红色,染色质聚集,核染色质呈固缩状或圆珠状,并可见凋亡小体的形成。凋亡率随A3D8剂量增加而增高;与顺铂联用,凋亡率大于单独用药组。 3.A3D8 2μg/ml使卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞周期阻滞在S期,即S期细胞比例增加,G0/G1期比例减少;4.A3D8可以诱导卵巢癌腹水源球形体形成细胞凋亡。与顺铂联用,凋亡率大于单独用顺铂或A3D8组。 5.A3D8作用前后,对P21、P27、Bcl-2、cyclinD1、cyclinA、CDK2、CDK4基因表达水平与对照组比较无明显差异;6.A3D8 2μg/ml可明显降低卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞cyclinA、CDK2蛋白表达水平。结论： A3D8可抑制卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞增殖,使细胞周期阻滞在S期,诱导细胞凋亡。其机制可能是A3D8使细胞受损伤,CDK/cyclin复合物首先感受到这一信号,使细胞周期阻滞,进而使受损细胞得到修复,如无法修复,细胞即启动凋亡程序,使细胞凋亡。

关键词：卵巢癌单克隆抗体癌干细胞 A3D8 靶向治疗

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MCP-1对VEGI表达的影响及VEGI对卵巢癌生长的影响

MCP-1对VEGI表达的影响及VEGI对卵巢癌生长的影响

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作者：许静静天津医科大学

学位级别：硕士

目的：探讨MCP-1对血管内皮生成抑制因子VEGI(又名TNFSF15,肿瘤坏死因子超家族-15)表达的影响,探讨在小鼠体内VEGI对卵巢癌生长的影响,拟为卵巢癌的临床治疗探索新的研究方向。方法：本实验以HUVEC细胞(Human Umbilical Vein Endothe... 详细信息

目的：探讨MCP-1对血管内皮生成抑制因子VEGI(又名TNFSF15,肿瘤坏死因子超家族-15)表达的影响,探讨在小鼠体内VEGI对卵巢癌生长的影响,拟为卵巢癌的临床治疗探索新的研究方向。方法：本实验以HUVEC细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,人脐静脉内皮细胞),OVCAR3癌细胞系,小鼠卵巢癌ID8细胞系,C57BL/6小鼠为研究对象。 1.采用免疫组织化学法检测正常卵巢和卵巢癌组织中CD4+T细胞浸润情况,免疫荧光法检测卵巢癌FIGO分期Ⅲ/Ⅳ期中CD4+CD25+FOXP3+调节性T(CD4+CD25+FOXP3+Treg)细胞的分布情况。 2.免疫磁珠分选法分选健康人外周血CD4+CD25+Treg细胞并用于以下相关实验。 3.应用ELISA法检测重组MCP-1(浓度分别为0,5,10,20,40ng/mL)及Treg细胞培养上清对HUVECs生成VEGI的影响。 4.采用细胞因子抗体芯片检测未经处理的Treg细胞和经OVCAR3条件培养基(conditioned medium, CM)处理的Treg细胞所分泌的细胞因子。 5. VEGI重组蛋白对小鼠卵巢癌生长的影响：以小鼠卵巢癌细胞ID8(1×107细胞/只)皮下接种雌性C57BL/6小鼠,6天后对荷瘤小鼠腹腔注射VEGI重组蛋白(125ug/0.5mLPBS/只)或相应缓冲液(0.5mL PBS/只),连续3天。此后每天观测肿瘤的生长。注射VEGI重组蛋白结束后第11天,处死小鼠,取其瘤组织进行固定、包埋、切片及相关免疫组化实验。 6. VEGI-shRNA对小鼠卵巢癌生长的影响：对雌性C57BL/6小鼠皮下注射VEGI-shRNA或control-shRNA (1.5x105IFU/100μL PBS/只),72h后在同部位接种ID8细胞(5x106细胞／只),荷瘤后第6天再次注射同前剂量VEGI-shRNA或control-shRNA。此后每天观测肿瘤的生长。再次注射VEGI-shRNA后第10天处死小鼠,取其瘤组织进行固定、包埋、切片及相关免疫组化实验。结果： 1.与正常卵巢组织相比,卵巢癌组织中CD4+T细胞浸润增多,且随着卵巢癌FIGO分期增加,CD4+T细胞浸润逐渐增多;卵巢癌FIGO分期Ⅲ/Ⅳ期中Treg+样本占80%,在Treg+样本中,CD4+CD25+FOXP3+T细胞/CD4+细胞的百分率为30%-60%(平均为45%),CD4+CD25+FOXP3+T细胞/CD4+CD25+细胞为95%。 ***-1能下调王IUVECs中VEGI的表达,其下调作用呈剂量依赖性;MCP-1mAb能阻抑MCP-1对HUVEC产生VEGI的下调作用;向HUVECs中加入经OVCAR3条件培养基(OVCAR3-CM)处理后的Treg细胞培养上清(OVCAR3-Treg-CM), HUVECs分泌VEGI显著减少。 3.未经处理的Treg细胞可分泌少量的MCP-1,经OVCAR3-CM刺激后,Treg细胞分泌MCP-1水平显著增加。 4. VEGI重组蛋白腹腔注射使小鼠卵巢癌微血管密度(microvessel density, MVD)减小,显著抑制小鼠卵巢癌生长。 5. VEGI-shRNA皮下局部注射使小鼠卵巢癌MVD增加,促进小鼠卵巢癌生长。结论： 1.卵巢癌组织中CD4+T细胞浸润增多,且随着卵巢癌FIGO分期增加,CD4+T细胞浸润增多;卵巢癌FIGO分期Ⅲ/Ⅳ期Treg+细胞浸润率增高。 ***-1可以剂量依赖方式降低HUVECs中VEGI的表达水平;MCP-1mAb能阻抑MCP-1对]HUVECs中VEGI的下调作用。 3.经OVCAR3-CM刺激的Treg细胞可分泌大量MCP-1;藉此下调HUVEC产生VEGI。 4.增加卵巢癌细胞微环境中VEGI水平可显著抑制小鼠卵巢癌血管生成和卵巢癌生长;以VEGI-shRNA干扰内源性VEGI的表达可显著促进卵巢癌血管生成和卵巢癌生长。

关键词： MCP-1 VEGI 卵巢癌肿瘤新血管形成 ID8细胞系

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黄芩素抗Ⅰ型超敏反应分子机制实验研究

黄芩素抗Ⅰ型超敏反应分子机制实验研究

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作者：高恒宇天津中医药大学

学位级别：硕士

研究目的:通过IgE(Immunoglobulin E,免疫球蛋白E)和C48/80(Compound48/80,化合物48/80)两种方式诱导RBL-2H3(Rat basophilic leukemia cell line,大鼠嗜碱性细胞白血病细胞)活化脱颗粒,建立起体外细胞脱颗粒模型。研究中药单体BAI(Baicalein,黄芩素)在体外实验中对细胞脱颗粒模型的影响,并探讨其抑制Ⅰ型超敏反应的分子调节机制。研究方法:体外培养RBL-2H3细胞株,绘制细胞生长曲线,确定合适的培养条件。使用IgE和C48/80两种方式诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒,建立起体外细胞脱颗粒模型。采用CCK8(Cell Counting Kit-8)法和细胞凋亡检测实验(Annexin V/PI双染色法)检测BAI在3.125-100.000μM的浓度范围内对细胞增殖活性的影响,以及在50-200μM的浓度范围内对细胞诱导凋亡作用的影响。不同浓度BAI作用细胞后,按照造模条件激发细胞脱颗粒,光学显微镜下观察细胞形态;应用ELISA(enzyme-linked immuno sorbent assay,酶联免疫吸附剂测定)方法检测细胞上清液中β-HEX(β-hexosaminidase,β-氨基己糖苷酶)、HIS(Histamine,组胺)、IL-4(Interleukin-4,白介素-4)和TNF-α(Tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子-α)水平;应用q-PCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,实时荧光定量核酸扩增检测系统)检测细胞内IL-4和TNF-α两种因子m RNA(Messenger RNA,信使核糖核酸)相对表达水平;应用WB(Western Blot,蛋白质印迹法),检测IgE/FcεRⅠ介导的信号通路关键上下游蛋白p-Lyn/Lyn、p-Syk/Syk及MAPK家族p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-P38/P38蛋白表达。统计学方法,采用Graph Pad Prism5软件作图并分析数据,实验结果以均数±标准差(`x±s)表示。采用独立样本t检验(Independent Samples T test)进行两组间比较,采用单因素方差分析(One Way ANOVA)进行多组间比较,进一步采用SNK(Student-Newman-Keuls)法进行组间两两比较,P<0.05认为有统计学意义。形态学资料以图片表示并描述。研究结果:绘制出RBL-2H3细胞生长曲线,确定最佳接种密度为2×10/m L。RBL-2H3细胞脱颗粒模型建立条件为:125ng/m L DNP(2,4-dinitrophenylated)-IgE致敏细胞过夜,次日使用500ng/m L DNP-HSA(2,4-dinitrophenylated human serum albumin)进行激发,分别在DNP-HSA作用30分钟时检测细胞上清液中HIS水平,作用1小时检测β-HEX水平,作用4小时检测细胞炎性因子IL-4和TNF-α的释放水平。应用C48/80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒模型确定C48/80的工作液浓度为10μg/m L,刺激时间为20分钟,并在倒置显微镜下记录细胞活化后的形态学改变,工作液浓度过高,刺激时间过长均对细胞形态造成破坏,出现细胞皱缩、漂浮。当BAI浓度为3.125-50.000μM作用时间为24小时,发现BAI对RBL-2H3细胞增殖活性无明显变化(P﹥0.05),但是当浓度大于50.000μM时,发现BAI可以诱导RBL-2H3细胞凋亡,其中浓度为100.000μM时凋亡率为7.62%(与对照组相比P﹤0.01),浓度为200.000μM时凋亡率为10.86%(与对照组相比P﹤0.001),由此可见,促凋亡作用呈剂量依赖性(各组间相比P﹤0.05)。细胞脱颗粒模型稳定建立后(IgE/FcεRⅠ途径),通过细胞形态学观察发现BAI在3.125-50.000μM的浓度下对RBL-2H3细胞活化脱颗粒具有一定的抑制作用;ELISA检测结果显示,细胞上清液中β-HEX、HIS、IL-4和TNF-α释放量与对照组相比显著降低,表明BAI对RBL-2H3细胞脱颗粒反应具有抑制作用(P﹤0.05),尤其以25.000和50.000μM抑制作用明显(P﹤0.001);50.000μM的BAI作用RBL-2H3细胞后,发现细胞内IL-4和TNF-α的m RNA相对水平较低,表明BAI对细胞炎症因子的生成表现出良好的抑制作用(P﹤0.001)。同时发现,BAI在12.500-50.000μM浓度下对C48/80诱发的RBL-2H3细胞脱颗粒同样有明显抑制作用(P﹤0

关键词：黄芩素超敏反应,Ⅰ型 RBL-2H3细胞 IgE C48/80 细胞因子脱颗粒

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Treg/Th17细胞平衡失调与原发性食道癌临床分期的相关性研究

Treg/Th17细胞平衡失调与原发性食道癌临床分期的相关性研究

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作者：李德来天津医科大学

学位级别：硕士

目的：分析Thl7和Treg细胞在原发性食道癌(primary esophagus carcinoma, PEC)患者外周血中的比例,探讨Th17和Treg细胞与原发性食道癌临床分期的相关性,为食道癌的早期诊断及以此为靶点的免疫疗法的研究提供实验依据。万法：分别收集8... 详细信息

目的：分析Thl7和Treg细胞在原发性食道癌(primary esophagus carcinoma, PEC)患者外周血中的比例,探讨Th17和Treg细胞与原发性食道癌临床分期的相关性,为食道癌的早期诊断及以此为靶点的免疫疗法的研究提供实验依据。万法：分别收集87例原发性食道癌患者和39例健康体检者的外周血标本,常规分离单个核细胞(PBMC),流式细胞术检测Th17和Treg细胞的比例;实时定量PCR (real-time PCR)法检测外周血中Th17和Treg细胞增殖分化相关因子,IL-1R、IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23、TGF-6、RORc、Foxp3的mRNA表达水平;应用SPSS16.0统计软件进行多元线性回归分析,探讨Thl7和Treg细胞比例与原发性食道癌临床分期及其他临床指标(年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、浸润深度、是否出现远处转移等)之间的相关性。结果： 1.流式细胞术分析结果表明,原发性食道癌患者外周血标本中Th17细胞数量显著高于正常对照组(4.598±0.776%vs3.017±0.613%,P0.05);Treg细胞数量也显著高于正常对照组(8.912±1.772%vs4.732±0.884%,P0.05);Treg/Th17比值明显高于正常对照组(1.885±0.417vs1.568±0.338,P0.05)。Th17与Treg细胞随TNM分期呈正向直线关系(r=0.5832,P<0.01)。结论： 1.原发性食道癌患者外周血中,Th17细胞、Treg细胞、Treg/Th17比值及增殖分化相关因子均较正常对照组显著增高。 ***17和Treg细胞比例及Treg/Th17比值与原发性食道癌TNM分期密切相关,二者随TNM分期呈显著正向相关。 ***17细胞和Treg细胞可促进原发性食道癌的发生发展,可作为食道癌的早期诊断及免疫抑制疗法研究的作用靶点。

关键词：原发性食道癌(primary esophagus carcinoma PEC) Th17细胞 Treg细胞白细胞介素17(IL-17) 转化生长因子(TGF-β) 叉头转录因子(Foxp3)

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人卵巢癌组织中VEGI的表达及相关机制的研究

人卵巢癌组织中VEGI的表达及相关机制的研究

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作者：张秋月天津医科大学

学位级别：硕士

目的：检测血管内皮生长抑制因子(VEGI)、血管内皮生长因子(VEGF)在人正常卵巢组织、卵巢癌组织标本中的表达,并初步探讨VEGF对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)产生VEGI的影响及相关作用机制,为更深层次的研究奠定基础。方法： 1.免疫组织化... 详细信息

目的：检测血管内皮生长抑制因子(VEGI)、血管内皮生长因子(VEGF)在人正常卵巢组织、卵巢癌组织标本中的表达,并初步探讨VEGF对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)产生VEGI的影响及相关作用机制,为更深层次的研究奠定基础。方法： 1.免疫组织化学法检测人正常卵巢组织、卵巢癌组织标本中VEGI、VEGF的表达及微血管密度(microvessel density, MVD)。 2.用含特殊生长因子的内皮细胞培养基(Endothelial cell growth medium-2,EGM-2)培养HUVEC,并用重组人VEGF(浓度分别为1、5、10ng/ml)处理HUVEC,24、48、72h后收集培养上清,ELISA测定其中VEGI的含量。 3.在21%O2,5%CO2(常氧)或1%02,94%N2,5%CO2(缺氧)培箱中培养人卵巢癌细胞系OVCAR3细胞,并于不同时间点收集条件培养基(conditioned media, CM), ELISA测定OVCAR3-CM中VEGF的含量;分别以OVCAR3-CM、 VEGFR1pAb+OVCAR3-CM、 VEGFR2mAb+OVCAR3-CM及VEGFmAb+OVCAR3-CM处理HUVEC,72h后收集培养上清,以ELISA方法检测其中的VEGI含量。 4. Western blot检测10ng/ml重组人VEGF作用于HUVEC72h后,对其核转录因子NF-kB蛋白表达水平的影响。结果： 1.卵巢癌组织标本中VEGI表达较正常卵巢组织显著降低,且Ⅲ/Ⅳ期VEGI表达水平较Ⅰ/Ⅱ期显著降低：与正常卵巢组织相比,卵巢癌Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期中MVD值呈升高趋势,且随着VEGI表达的降低,MVD值相应地升高。卵巢癌组织标本中VEGF表达显著升高,且随着VEGF表达升高VEGI表达显著降低。 2.重组人VEGF蛋白能够抑制HUVEC产生VEGI,且此抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性。 3.与常氧组相比,缺氧条件下OVCAR3细胞产生VEGF的量明显增加;与单纯HUVEC组相比,OVCAR3-CM组中VEGI含量显著降低：VEGFR1pAb+OVCAR3-CM. VEGFR2mAb+OVCAR3-CM及VEGFmAb+OVCAR3-CM组与OVCAR3-CM组相比其VEGI浓度明显增加。 4.重组人VEGF10ng/ml对NF-kB蛋白表达水平与对照组比较无明显差异。结论： 1.卵巢癌组织标本中VEGI表达较正常卵巢组织显著降低,而卵巢癌组织标本中VEGF表达显著升高,且随着VEGF表达升高VEGI表达显著降低。 2.重组人VEGF蛋白可抑制HUVEC产生VEGI。 3.缺氧可以使人卵巢癌细胞系OVCAR3细胞产生VEGF增加,且其分泌的VEGF可特异性抑制HUVEC产生VEGI。 4. VEGF下调HUVEC对VEGI的表达有可能通过NF-kB以外的信号传导通路。

关键词：卵巢癌 VEGI VEGF 人脐静脉内皮细胞 OVCAR3细胞

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