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作者：吕庆燕吉林大学

学位级别：硕士

肌肉生长抑制素基因(Myostatin,MSTN),是TGF-β超家族成员之一,其主要功能是负向调控骨骼肌生长发育。研究报道,MSTN自然突变的牛、羊具有肌肉增加、饲料转化率高、瘦肉率高等特点,被称为“双肌牛、双肌羊”。其为进一步研究双肌性状的... 详细信息

肌肉生长抑制素基因(Myostatin,MSTN),是TGF-β超家族成员之一,其主要功能是负向调控骨骼肌生长发育。研究报道,MSTN自然突变的牛、羊具有肌肉增加、饲料转化率高、瘦肉率高等特点,被称为“双肌牛、双肌羊”。其为进一步研究双肌性状的组织形态学及遗传学机制提供理想的动物模型。迄今,虽然已成功构建了MSTN基因敲除小鼠、羊、猪及狗,且均表现出理想的双肌表型,但还没有关于MSTN基因敲除兔的相关报道。兔子是生物医学研究中一种理想的基因打靶动物模型。与小鼠相比,兔子和人类在生理学和解剖学上有更多的相似之处。而与猪、猴相比,兔子发情期和妊娠期短,产仔数多,饲养消费低。因此,本实验利用CRISPR/Cas9技术制备MSTN基因敲除兔,其不仅可为研究MSTN对肌肉的调控作用提供合适的动物模型,还可用以提高兔肉质,满足日益增长的肉类消费需求。首先,本实验在兔MSTN基因的第一外显子上设计了两个g RNA,并构建有效的MSTN基因打靶载体。通过显微注射和胚胎移植法,成功构建了MSTN基因敲除兔。结果表明,MSTN基因敲除兔具有典型的双肌表型,且均无脱靶发生。此外,子代MSTN基因敲除兔中也出现了同样的双肌表型。体重统计分析表明,六周后的MSTN基因敲除兔显著高于同窝野生型对照兔。HE染色分析证实,肌纤维的增生和肥大可能是导致MSTN敲除兔肌肉的增加的主要原因。总之,本研究利用CRISPR/Cas9技术及显微注射法,成功获得了具有双肌表型的MSTN基因敲除兔,为进一步研究MSTN对肌肉的调控作用,肌肉萎缩等相关疾病,以及为提高肉产量及改善肉质提供了一种新的动物模型。

关键词： CRISPR/Cas9 兔子 MSTN 双肌表型肌纤维增生肌纤维肥大

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家兔与猪iPS细胞诱导初步探索

家兔与猪iPS细胞诱导初步探索

作者：全龙泉吉林大学

学位级别：硕士

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)和诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)具有体外自我更新、保持分化潜能以及能够分化成三个胚层等优点,因此ESC和iPSC在再生医学与临床治疗研究中有着巨大的应用潜能... 详细信息

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)和诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)具有体外自我更新、保持分化潜能以及能够分化成三个胚层等优点,因此ESC和iPSC在再生医学与临床治疗研究中有着巨大的应用潜能和无可比拟的优势。但是,由于伦理与道德的限制,人ESC和iPSC的研究只能到囊胚阶段,无法评估其发育潜能和安全性,这在很大程度上限制了人ESC和iPSC的研究。因此,需要更好的动物模型来替代人ESC和iPSC技术的研究。小鼠ESC和iPSC研究成熟,但是小鼠在亲缘关系、体型、生理解剖特征与人类存在巨大的差异,小鼠ESC和iPSC的形态和功能与人ESC和iPSC完全不同;灵长类与人类亲缘关系最近却存在着研究成本极高等问题。猪和家兔在生理和体型上较啮齿类与人类更加相近,繁殖周期比灵长类短,研究成本更低,越来越受到科研工作者的重视,作为模型动物研究胚胎发育和和疾病发生机制等领域中发挥了重要的作用,也是替代研究人ESC和iPSC的极佳模型动物。iPSC可以克服异体移植存在的免疫排斥问题,来源更丰富,所以在器官或细胞移植治疗研究中比ESC更有优势。目前,猪和兔的iPSC的诱导虽然有一些成功的报道,但是由于没有合适的多能性报告系统和培养体系的不完善,导致猪和兔iPSC的研究进展缓慢。因此,本研究希望在现有的研究基础上,建立更加完善和高效的猪和家兔iPSC诱导体系。小鼠Zscan4基因能够维持小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)端粒延长和染色体稳定,在小鼠iPSC诱导中,添加Zscan4基因能够缩短iPS诱导的时间和显著提高形成的iPSC克隆的质量。在猪iPSC的诱导中,本研究尝试在四个多能因子的基础上加入小鼠zscan4因子来提高猪的iPSC的诱导效率和质量。结果发现小鼠zscan4c或者zscan4f与人OSKM (oct4、sox2、c-myc和klf4)四个因子可成功诱导出猪iPSC细胞系,但是诱导过程中克隆产生速度较对照组并没有明显的加快且产生的iPSC克隆形态和质量并没有明显提高。在家兔iPSC的研究中,本研究首先构建了家兔Oct4-EGFP (OG2)转基因报告系统来示踪ESC和IPSC,从而尝试家兔NAIVE IPSC的诱导和培养。本研究发现转基因兔囊胚内细胞团和生殖脊都有特异性绿色荧光表达;同时获得了两只转基因胚胎,并成功分离兔胎儿成纤维细胞(rabbit fetal fibroblasts, RFFs)和神经干细胞(rabbit neural stem cells, RNSCs)。在此基础上,本研究通过在此转基因的RNSC中表达人Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子,同时尝试不同的诱导培养体系,成功诱导出了兔iPSCs。最后本研究对诱导出的兔iPSCs进行RT-PCR、免疫荧光和体外分化等鉴定。综上所述,一方面,将Zscan4与四个转录因子一起诱导获得猪iPSCs,证实Zscan4在大动物中不能明显提高iPSCs的质量,为进一步获得NAIVE状态的猪iPSCs提供重要的参考价值;另一方面,本研究获得了一个有效的家兔多能性细胞的报告系统,并利用这一系统成功将RNSC诱导为多能性细胞,为家兔iPSC的研究提供了一个新的报告系统和诱导方案。

关键词：胚胎干细胞诱导多能干细胞 OG2 Zscan4

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兔MODY-2模型的构建及药物筛选

兔MODY-2模型的构建及药物筛选

作者：王勇吉林大学

学位级别：硕士

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种代谢性疾病,由遗传因素与环境因素共同作用引起,特点是高血糖,胰岛素抵抗和体内胰岛素不足。糖尿病的危险因素包括基因突变、家族遗传史、体型肥胖、饮食应激等。糖尿病主要分为以下四大类:⑴:1型糖... 详细信息

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种代谢性疾病,由遗传因素与环境因素共同作用引起,特点是高血糖,胰岛素抵抗和体内胰岛素不足。糖尿病的危险因素包括基因突变、家族遗传史、体型肥胖、饮食应激等。糖尿病主要分为以下四大类:⑴:1型糖尿病,胰岛素依赖型糖尿病,由体内胰岛素绝对缺乏引起;⑵:2型糖尿病,成人起病型糖尿病,患者体内产生胰岛素的能力并没有完全丧失,有的甚至产生过多,但是胰岛素的作用效果较差;⑶:特殊型糖尿病,由环境因素和遗传因素引起的,病因相对明确;⑷:妊娠糖尿病,妊娠期间才被诊断出的糖尿病。成人起病的青少年糖尿病(MODY)在上世纪60年代由Fajns发现,现己明确,MODY具有家族遗传史,青少年开始发病,非肥胖等特征。在欧洲国家,MODY的发病率约占总糖尿病人1%-2%。然而由于MODY患者的独有特征,会出现与1型和2型重叠的现象,所以会发生误诊现象,导致实际患病率被低估。资料统计显示,在英国就有80%以上的MODY患者被误诊,然而MODY的最终确诊需要13年。我国对于MODY的研究起步相对较晚,研究结果表明,MODY占中国人早发或多发糖尿病人家系的2%-10%。虽然我国存在MODY患者诊断困难,而且发病率低的现象。但是研究该病意义重大。第一:正确诊断MODY患者,对病人的治疗有指导意义,研究表明,GCK突变发生的MODY2是最常见的MODY亚型;第二,正确的诊断有助于后期的治疗,因为MODY患者通过饮食和运动即可控制血糖水平,无疑会使病人的心理负担极大地减轻。第三,作为一类显性遗传疾病,在分子层面的正确诊断,能为人们提供遗传类疾病的参考;最后,MODY模型的建立,可以作为疾病研究的模型,有助于疾病发病机理的研究和临床药物的筛选。现已明确GCK是MODY2疾病的致病基因,GCK主要在肝细胞和胰岛β细胞中表达。GCK基因位于染色体7p1513,全长约27kb,共有12个外显子。GCK由448个氨基酸残基构成,折叠成大小不等的2个结构域。随着人类对疾病认识逐渐深入,研究发现绝大多数疾病的发生都和基因有关。因此,是否能更有针对性的建立与人类疾病有关的动物模型,选择出针对不同疾病的靶向药物是最具有前沿性的课题。本实验通过CRISPR/Cas9基因敲除技术对GCK基因进行修饰,成功构建GCK基因打靶载体,利用Cas9/sg RNA m RNA注射法获得GCK基因敲除兔。研究结果表明,与正常兔相比,GCK基因敲除兔具有血糖长期升高,糖耐量受损,胰岛素分泌减少等典型的MODY2临床症状。而且,我们对多种临床药物进行了筛选,选取格列美脲,瑞格列奈,西格列汀,二甲双胍和胰岛素这五种临床常用药物进行治疗。针对药物的不同疗效,我们选择格列美脲进行长期给药,通过血清学和病理组织学分析,结果显示MODY2疾病症状发生了明显改善。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技术,成功构建了GCK基因敲除兔,其可为MODY2临床预防治疗提供可靠的模型,并且筛选出针对MODY2有效药物。

关键词： MODY2 CRISPR/Cas9 兔,GCK 药物筛选

基于脱氨酶的新型RNA m5C检测系统的开发

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基于脱氨酶的新型RNA m5C检测系统的开发

作者：周佳乐吉林大学

学位级别：硕士

5-甲基胞嘧啶（m5C）甲基化修饰是重要的转录后修饰,它已被验证在RNA中广泛存在,是近年来表观遗传学领域的研究热点之一。m5C修饰主要由甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白动态调控,几乎参与了RNA代谢的所有重要阶段,并且m5C的动态变化... 详细信息

5-甲基胞嘧啶（m5C）甲基化修饰是重要的转录后修饰,它已被验证在RNA中广泛存在,是近年来表观遗传学领域的研究热点之一。m5C修饰主要由甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白动态调控,几乎参与了RNA代谢的所有重要阶段,并且m5C的动态变化在许多生理和病理过程中都具有重要影响,与多种疾病的发病机制密切相关。因此,对RNA m5C甲基化水平的检测具有重要意义。但是,现有的RNA m5C修饰的检测方法仍存在诸多问题,如样本需求量大、化学处理对机体或者RNA有损害、抗体依赖性强,准确度和敏感性较差等,这些问题极大地限制了RNA m5C甲基化修饰相关的研究进展。因此,亟待开发新的检测系统以更为准确、高效、便捷地检测m5C修饰水平变化。本研究基于脱氨酶开发了一种新型m5C检测方式——DRAM（deaminase and m5C reader-assisted RNA methylation sequencing approach）。通过将脱氨酶（APOBEC1和Tad A-8e）与m5C结合蛋白（ALYREF和YBX1）融合,特异性地识别m5C位点并介导位点附近产生点突变,来实现位点特异性的m5C检测。为了排除m5C结合蛋白非m5C特异性结合导致的假阳性结果的产生,我们将m5C结合蛋白中负责识别并结合m5C修饰的关键氨基酸进行突变,构建出DRAMmut系统。只有在DRAM的诱导下产生的脱氨变化与在DRAMmut或Deaminase诱导下产生的脱氨变化存在差异时,我们才认为附近存在m5C修饰。主要研究内容和结果如下:首先,本研究成功构建了DRAM m5C检测系统载体,并在转染后对m5C位点进行检测。结果显示,在DRAM系统的诱导下,m5C位点附近会产生明显的C-to-U或A-to-G的转换,相比于DRAMmut和Deaminase诱导产生的突变存在显著差异,即DRAM系统能够有效识别m5C区域。接下来为了验证DRAM系统特异性地对m5C位点附近的胞嘧啶/腺嘌呤进行脱氨,我们利用CRISPR-Cas9基因敲除技术获得了NSUN2和NSUN6缺失的HEK293T细胞系,与野生型细胞相比,甲基转移酶缺失后m5C位点附近的脱氨效率显著降低,几乎不存在有效突变,这些发现表明DRAM检测系统以m5C依赖的形式进行m5C检测。随后,结合高通量测序分析（DRAM-seq）,我们探究了DRAM能否在全转录组范围内进行m5C检测。结果显示,在多个高置信度m5C位点附近都存在DRAM-seq编辑事件,而在甲基转移酶缺失的细胞中,DRAM-seq的总体编辑事件极少。这些结果进一步证实了DRAM系统可以m5C依赖的方式进行全转录组范围内的m5C检测。进一步分析DRAM-seq结果的数据特征发现越靠近m5C位点的碱基被编辑的可能性越大,DRAM-seq的编辑窗口约为40 nt。DRAM-seq检测结果表明,m5C甲基化修饰主要集中在CDS区,带有m5C修饰的基因参与了翻译、m RNA剪接、细胞周期调控和DNA损伤修复等多种关键的生物过程,具有重要的生物学功能。最后,本研究对DRAM检测系统进行了综合评价。通过将DRAM-seq结果和已报道的两项m5C亚硫酸氢盐测序（BS-seq）数据结果进行对比后发现,DRAM-seq和BS-seq的检测数据高度重叠,并且一些关键调控因子如ATG16L1、ARHGEF25、FANCD2和RPL15无法同时被两项m5C公开数据所覆盖,但却能够被DRAM-seq稳定地检测到,这说明DRAM系统能够准确检测m5C修饰。此外,用亚砷酸钠处理表达DRAM的细胞发现,m5C水平降低后DRAM系统的编辑效率也显著降低,由此证明DRAM能够监测细胞RNA中m5C的动态变化。其次,我们还发现,250 ng、50 ng和10 ng的不同总RNA模板量观测到的DRAM编辑效率不存在显著差异,即DRAM支持微量样本的m5C检测。另外,CCK8检测发现,DRAM不会影响细胞的相对增殖能力。综上所述,我们成功开发了一种基于脱氨酶的新型RNA m5C检测方法,该方法无需化学处理,不依赖抗体,可以实现全转录组范围内的m5C检测。此外,DRAM系统支持微量样本（10 ng总RNA）的m5C分析,并能监测m5C的动态变化,为揭示更多m5C修饰的生物学功能和开发相关疾病的药物奠定了基础。

关键词： m5C甲基化修饰 m5C结合蛋白脱氨酶

利用CRISPR/Cas9技术构建MPL综合征模型兔

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利用CRISPR/Cas9技术构建MPL综合征模型兔

作者：陈茂吉林大学

学位级别：硕士

MPL综合征（Marfanoid-progeroid-lipodystrophy syndrome,MPL）是一种新发现的原纤维疾病,主要由于FBN1基因倒数第二个外显子发生移码突变所导致。FBN1基因位于15号染色体上,包含66个外显子,7种蛋白结构域,编码2871个氨基酸的原纤维蛋... 详细信息

MPL综合征（Marfanoid-progeroid-lipodystrophy syndrome,MPL）是一种新发现的原纤维疾病,主要由于FBN1基因倒数第二个外显子发生移码突变所导致。FBN1基因位于15号染色体上,包含66个外显子,7种蛋白结构域,编码2871个氨基酸的原纤维蛋白。原纤维蛋白广泛存在于全身结缔组织,是直径10-12nm的微纤维的主要组分。而在脊椎动物中,微纤维广泛存在于弹性纤维的边缘,在弹性纤维的生成过程中为弹性蛋白的沉积起到重要的支架作用。另一方面,微纤维也单独成束状存在于无弹性蛋白的组织中,如悬韧带,肌腱、角膜等。FBN1基因的突变可以造成多种疾病,例如马凡氏综合征,硬化性皮肤综合征,MASS综合征,以及MPL综合征等。其临床表现为不完全的马凡氏综合征症状,包括外观衰老以及脂肪代谢障碍等。而目前建立的FBN1基因突变数据库(（http://***/FBN1/）已经报道了1847种不同的突变。因此多种FBN1敲除小鼠模型应运而生,例如mg N,mg R,mgΔ,WMΔ,H1Δ等大片段敲除小鼠模型,以及C1039G,W1572C,D1545E等错义突变小鼠模型,但这些小鼠模型并未完全概括MPL综合征的表型和基因型的关联。因此合适的FBN1基因修饰的动物模型对于研究MPL综合征的致病机制和后续药物筛选有重要作用。本次试验中,我们采用CRISPR/Cas9技术移码突变FBN1基因的倒数第二个外显子,建立了MPL综合征兔模型,并对该模型兔进行了表型分析。本课题主要分为以下两部分:第一部分为利用CRISPR/Cas9技术敲除兔的FBN1基因的第65外显子,造成C末端的截短,获得F0代FBN1基因敲除兔。经过交配获得了F1代稳定遗传表型的FBN1杂合敲除兔。第二部分从眼、主动脉、骨骼、肌肉、脂肪、糖代谢等方面对获得的F1代FBN1杂合敲除兔的表型进行分析。试验结果表明FBN1杂合敲除兔表现出了部分马凡氏综合征的表型,包括主动脉扩张,结缔组织受损,身材瘦小,脂肪代谢障碍,血糖代谢障碍等症状。同时,我们对FBN1的致病机制进行分析,证明了FBN1的C末端的截短导致表达量下降并且原纤维蛋白分泌受阻,从而导致多种马凡氏综合征的表型。该模型兔成功的模拟了MPL综合征的组织学特征和FBN1基因的功能缺损,对于我们研究MPL综合征的致病原因及人类临床药物筛选有重要意义。

关键词：原纤维蛋白 CRISPR/Cas9 MPL综合征兔

Cpf1碱基编辑器的优化及其在基因编辑家兔中的应用

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Cpf1碱基编辑器的优化及其在基因编辑家兔中的应用

作者：贾英琪吉林大学

学位级别：硕士

碱基编辑器(Base editor,BE)是具有突破性的基因编辑技术,它广泛应用于单基因疾病模型的构建以及纠正致病性位点突变。Cpf1蛋白可以识别富含T的原间隔序列邻近基序(Protospacer adjacent motif,PAM),而Cas9识别富含G的PAM,Cpf1拓宽了靶... 详细信息

碱基编辑器(Base editor,BE)是具有突破性的基因编辑技术,它广泛应用于单基因疾病模型的构建以及纠正致病性位点突变。Cpf1蛋白可以识别富含T的原间隔序列邻近基序(Protospacer adjacent motif,PAM),而Cas9识别富含G的PAM,Cpf1拓宽了靶向的基因组范围。鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症是一种X连锁疾病,其发病率占尿素循环相关的遗传性疾病的近一半。OTC是尿素循环途径中常见的酶之一,若该基因发生突变,氨会积聚在血液中,损害神经系统及肝脏。家兔中OTC基因发生突变后,血氨水平会升高,肝脏会呈现纤维化表型,可以模拟人类疾病症状。已有研究报道,dLb Cpf1-BEs在内源位点中平均编辑效率仅为22%,低于传统的n Cas9-BEs(BE4max的编辑效率在69-77%之间),严重阻碍了dLb Cpf1-BEs的广泛应用,因此通过两种优化方式提高dLb Cpf1-BEs的碱基编辑效率,之后选用效率最高的d Cpf1-e CDA1在家兔胚胎中进行验证并构建OTC基因编辑家兔。1)通过crRNA、cr-HDV和U-rich crRNA三种修饰方式进行优化,并且在六个不同位点上进行了效率验证。结果显示,U-rich crRNA在所有位点的编辑效率都有轻微提高(1.05倍到1.69倍);cr-HDV仅将FANCF位点的编辑效率提升了1.85倍,其它五个位点中有两个位点编辑效率反而下降;对于crRNA而言,六个位点中只有CDKN2A位点编辑效率轻微提升。以上结果揭示,针对crRNAs 3’端的优化不能显著提高d Cpf1-BE3的碱基编辑效率。2)我们进一步推测dLb Cpf1-BE3中使用的大鼠胞嘧啶脱氨酶(r A1)的活性低是影响编辑效率的主要原因,于是选择了三种具有更高活性的脱氨酶(evo APOBEC1、evo CDA1和A3A)分别替换dLb Cpf1-BE3中的r A1,构建了三个BEs系统:d Cpf1-e A1、d Cpf1-e CDA1和d Cpf1-A3A。在HEK293T细胞水平测试了d Cpf1-e A1、d Cpf1-e CDA1、d Cpf1-A3A及dLb Cpf1-BE3的碱基编辑效率,与dLb Cpf1-BE3相比,d Cpf1-e CDA1显著提升了66.7%的位点的碱基编辑效率。而d Cpf1-e A1和d Cpf1-A3A则显著提高了50%的位点的编辑效率。其中,在对富含GC的序列进行编辑时,d Cpf1-e CDA1可显著提高C-T的效率(3.17±0.80%VS 17.38±2.69%),d Cpf1-A3A虽有所提高但是不显著。总之,d Cpf1-e CDA1系统的编辑效率提高最显著。3)在家兔胚胎的六个位点上对dLbCpf1-eCDA1和dLb Cpf1-BE3系统进行比较,在TYR-1位点中,dLbCpf1-eCDA1的编辑效率为11.75%,dLb Cpf1-BE3的编辑效率为3.67%。除此位点外,dLbCpf1-eCDA1在其它的五个位点上碱基编辑效率均大于30%,最高可以达到77.67%。总之,dLbCpf1-eCDA1的编辑效率在11.75-77.67%之间,而dLb Cpf1-BE3的编辑效率在0-21.7%之间,揭示dLbCpf1-eCDA1可在胚胎水平显著提高碱基编辑效率。4)我们将dLbCpf1-eCDA1应用于对家兔的基因编辑,通过靶向OTC基因的第五外显子,引入提前终止密码子,其编辑效率在7.15%-65.4%之间。进一步通过RT-q PCR及western blotting证实基因编辑兔中OTC的表达量显著降低。综上所述,本研究通过优化替换脱氨酶,开发出编辑效率高的dLbCpf1-eCDA1系统,并应用这一系统构建了OTC基因突变家兔。

关键词： Cpf1 dLbCpf1-eCDA1 碱基编辑胞嘧啶脱氨酶 OTC基因编辑家兔

基因修饰人诱导多能干细胞定向分化为运动神经元的安全性研究

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基因修饰人诱导多能干细胞定向分化为运动神经元的安全性研究

作者：廖媛安徽大学

学位级别：硕士

人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)是通过转基因或小分子诱导获得的重编程干细胞,具有多向分化潜能,可产生人体各种细胞类型。hiPSCs作为重要的可再生干细胞资源,被广泛用于各类严重疾病的临床前和临床治... 详细信息

人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)是通过转基因或小分子诱导获得的重编程干细胞,具有多向分化潜能,可产生人体各种细胞类型。hiPSCs作为重要的可再生干细胞资源,被广泛用于各类严重疾病的临床前和临床治疗研究。尽管hiPSCs的应用潜力巨大,其潜在安全风险却不可忽视。由于hiPSCs的分化受多种因素影响,难以精确掌控其定向分化,可能导致畸胎瘤的形成或非目标细胞的产生。其中,一个有效的解决方案是对hiPSCs进行基因修饰,通过调控表达决定细胞命运的转录因子,使hiPSCs高效定向分化为特定的细胞类型。随后,我们可以通过移植动物模型来评估基因修饰hiPSCs用于细胞治疗的安全性和有效性。本实验室已建立条件性基因修饰的hiPSCs细胞系NILB-hiPSCs,该细胞系可在强力霉素(Doxycycline,Dox)诱导下,表达运动神经元转录因子NGN2、ISL1、LHX3(NIL),同时稳定表达抗凋亡基因BCL-XL。本研究将NILB-hiPSCs移植到免疫缺陷小鼠皮下组织,考察移植细胞的存活、致瘤性及分化情况,探究条件性基因修饰hiPSCs用于细胞治疗的安全性与临床应用价值。首先,我们将NILB-hiPSCs移植到免疫缺陷小鼠皮下组织,对照组(未使用Dox)中NILB-hiPSCs在皮下组织迅猛增殖,体积不断变大,并在第4周形成畸胎瘤;而Dox诱导组中,NILB-hiPSCs不会继续增殖,体积不断缩小。这证明了体内诱导皮下移植的NILB-hiPSCs不会形成畸胎瘤,具有较高的安全性。其次,为了确定NILB-hiPSCs在皮下定向分化的情况,我们对Dox诱导组的皮下移植物进行分析,发现移植细胞大量表达运动神经元相关标志物β-tubulin、HB9、MAP2、以及Ch AT,说明Dox诱导后,NILB-hiPSCs定向分化为运动神经元。另外,我们意外发现诱导组的移植物中存在大量的神经管腔结构,并表达神经前体细胞(Neural precursor cells,NPCs)标志物SOX2和PAX6,提示NILB-hiPSCs部分分化为NPCs。而后,将这些移植物进行体外培养,这些原代NPCs能快速、高效分化为运动神经元。为了探究NILB-hiPSCs在体内产生NPCs的原因,我们分析了三个可能因素,包括Dox浓度、培养基种类及3D培养体系。结果发现,NILB-hiPSCs在不同条件的定向分化过程中,均不经过NPCs阶段,提示我们NILB-hiPSCs定向分化中产生的NPCs可能是由未知的体内独特微环境造成的。综上,我们发现Dox诱导皮下注射的NILB-hiPSCs能够快速、高效地定向分化为运动神经元,且不形成畸胎瘤,具有较高的安全性。另外,小部分NILB-hiPSCs分化为具有运动神经元分化潜能的NPCs,可以作为潜在的备用细胞,在神经损伤时启动分化程序产生运动神经元,有利于修复神经环路。总之,条件性基因修饰NILB-hiPSCs严格受药物调控,既能高效定向分化为运动神经元和NPCs,又没有致瘤风险,有望用于神经退行性疾病等的干细胞治疗。本研究可以为干细胞治疗临床研究提供安全性参考。

关键词：条件性基因修饰hiPSCs 定向分化安全性神经前体细胞畸胎瘤

基于CRISPR/Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器的优化

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基于CRISPR/Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器的优化

作者：连萌安徽大学

学位级别：硕士

近些年以CRISPR/Cas系统为基础发展起来的单碱基编辑器,因其不产生DNA双链断裂、无需外源供体模板、适用于不分裂细胞和编辑效率高等特点,已然成为基因编辑领域的新星,该工具已经被运用到点突变疾病动物模型构建、农作物性状改良、疾病... 详细信息

近些年以CRISPR/Cas系统为基础发展起来的单碱基编辑器,因其不产生DNA双链断裂、无需外源供体模板、适用于不分裂细胞和编辑效率高等特点,已然成为基因编辑领域的新星,该工具已经被运用到点突变疾病动物模型构建、农作物性状改良、疾病基因治疗等方面。现阶段发展较为迅猛的单碱基编辑器是基于Sp Cas9发展而来的,其继承了Sp Cas9识别富含G/C PAM(NGG)的特点,这一定程度上限制了该工具的可靶向范围;另一个属于CRISPR第二类系统V型的Cpf1(也称为Cas12a)由于识别富含T/A PAM(TTTV)也被用来构建相关的碱基编辑系统。将r APOBEC与核酸酶失活的d Lb Cpf1进行融合而成的d Lb Cpf1-BE0拓宽了已有的碱基编辑工具箱,但也存在一些问题,比如很多位点编辑效率低下、对于GC基序中的C编辑无效等,这些问题阻碍着基于Cpf1碱基编辑工具的应用发展。本研究基于现有的以Cpf1为基础的碱基编辑工具效率低下的问题,通过不同策略进行优化以提高其编辑效率。首先,我们替换为胞嘧啶脱氨活性更高的h APOBEC3A构建而成的d Lb Cpf1-h A3A,编辑效率最高可达50%。对于一些d Lb Cpf1-BE0基本无效的位点,d Lb Cpf1-h A3A的编辑效率也可达20%。相较于d Lb Cpf1-BE0来讲,d Lb Cpf1-h A3A的平均编辑效率得到显著提高。由于使用脱氨活性更高的h APOBEC3A,d Lb Cpf1-h A3A的活性窗口也有所拓宽,为C6-C13,这也会导致旁观者效应的发生。我们采用h A3A-Y130F、h A3A-Y132D这两个变体来构建编辑器,其可以在保持编辑效率的同时缩窄活性窗口,为C6-C12。我们还利用另一变体h A3A-N57G构建特异性对TCR(R=A/G)基序中的C进行编辑的d Lb Cpf1-h A3A-N57G,这一编辑器可以大大减少旁观者效应,同时保持较高的精确性。除以上特点之外,无论是AC、CC、GC、TC中任一基序中的C,我们构建的d Lb Cpf1-h A3A系列碱基编辑器都可对其进行高效编辑,这与d Lb Cpf1-BE0对于GC基序中的C无效有很大差别。因此,我们成功构建高效的d Lb Cpf1-h A3A系列碱基编辑器。除替换脱氨酶进行编辑效率提升之外,我们还从染色质的开放程度入手,进一步来提高基于Cpf1碱基编辑器的效率。我们利用d Cas9/sg RNA结合在靶位点双侧可以局部打开染色质结构,进而增加靶向编辑效率。但是对于不同的位点,效率提高有所差异,最高可以提高一倍。我们还对sg RNA是否会造成d Cas9靶向位置造成脱靶进行分析,发现使用长度更短(14-15nt)的dead sg RNA比sg RNA脱靶现象要少很多,几乎检测不到。综上所述,我们对基于Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器进行优化,实现了高效的碱基编辑,实现了碱基编辑工具箱的扩充。在本研究中使用h APOBEC3A变体构建的系列碱基编辑器,具有不同的特性,为今后的应用提供更多的选择;通过d Cas9结合邻近位置的策略可以进一步提高编辑效率,为该工具的应用奠定基础。

关键词： CRISPR/Cpf1 hAPOBEC3A 胞嘧啶碱基编辑器 dCas9结合

单碱基突变工具（BE3）构建免疫缺陷兔模型的研究

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单碱基突变工具（BE3）构建免疫缺陷兔模型的研究

作者：蔡哲宇华南农业大学

学位级别：硕士

免疫缺陷小鼠模型已经广泛应用于肿瘤学、免疫学和干细胞治疗等相关研究,但由于小鼠的遗传背景及生理指标相对于人类差别较大,且体型较小、寿命较短,不适于开展中长周期试验。而大型动物如猪、猴等繁殖周期长、饲养成本高等缺陷也限制... 详细信息

免疫缺陷小鼠模型已经广泛应用于肿瘤学、免疫学和干细胞治疗等相关研究,但由于小鼠的遗传背景及生理指标相对于人类差别较大,且体型较小、寿命较短,不适于开展中长周期试验。而大型动物如猪、猴等繁殖周期长、饲养成本高等缺陷也限制了免疫缺陷疾病模型的开发及应用。家兔作为模式动物,既弥补了大、小鼠与人类亲缘关系远的不足,又缓解了大动物繁殖周期长、经济耗费高等压力,已在生物医学领域得到广泛应用。近年来,随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的快速发展,转基因动物已经逐渐“平民化”,尤其是基于该技术平台建立的胞嘧啶脱氨酶单碱基编辑系统（Base Editor系统）,不产生DNA双链损伤（DNA double strand break,DSB）,对基因组的损伤更小,更进一步提高了基因编辑技术的效率及精确性。RAG1及IL2RG基因的失活会导致B细胞、T细胞以及NK细胞成熟受阻,从而功能缺失,最终导致重度联合免疫缺陷。本研究采用第三代点突变基因编辑工具r APOBEC1-XTEN-n Cas9-UGI（BE3）,对新西兰兔的IL2RG和RAG1基因进行突变失活,探讨通过BE3构建免疫缺陷兔模型的可行性。研究结果如下:（1）通过sanger测序对显微注射获得的8枚囊胚的RAG1及IL2RG基因的靶向位点进行基因型分析,结果其中有6枚囊胚获得了编辑,效率为75%。该结果证实了本研究所用技术的高效性及可行性。（2）进一步显微注射获得的84枚受精卵分别移植到两只假孕母兔受体的输卵管中,其中一只受体怀孕,共生产4只仔兔。通过sanger测序对4只仔兔的RAG1及IL2RG基因的靶向位点进行基因型分析,结果显示4只仔兔在RAG1或IL2RG基因相应位点均成功进行了编辑,并且有2只仔兔为双基因编辑。通过二代测序对1只双基因编辑的仔兔的靶向位点进行深度分析,结果显示RAG1和IL2RG基因的编辑效率分别为25.6%和34.1%。此外,（3）针对上述两个目的基因,分别选取了通过网站预测的脱靶位点,通过一代测序分析其脱靶效应,结果显示BE3编辑系统未在这些位点中出现脱靶现象。该结果证实了BE3的精确性。综上所述,通过BE3编辑技术对兔RAG1/IL2RG基因成功实现双基因敲除,可通过此技术获得双基因突变缺失的重度免疫缺陷兔模型。该方法操作简便、成本低,并且具有较高的基因编辑效率及精准度。

关键词：兔免疫缺陷 BE3 IL2RG RAG1

Wiskott-Aldrich综合征基因编辑家兔模型的构建及病理表型分析

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Wiskott-Aldrich综合征基因编辑家兔模型的构建及病理表型分析

作者：周娟娟中国科学技术大学

学位级别：硕士

Wiskott-Aldrich 综合征(Wiskott-Aldrich syndrome,WAS)是一种 X 连锁的隐性遗传的免疫紊乱综合征。WAS由特异表达于造血系统的WAS基因突变所致,其产物WAS蛋白(WASP)是一种肌动蛋白成核促进因子,WASP缺陷会导致造血细胞和免疫细胞异常... 详细信息

Wiskott-Aldrich 综合征(Wiskott-Aldrich syndrome,WAS)是一种 X 连锁的隐性遗传的免疫紊乱综合征。WAS由特异表达于造血系统的WAS基因突变所致,其产物WAS蛋白(WASP)是一种肌动蛋白成核促进因子,WASP缺陷会导致造血细胞和免疫细胞异常。目前,WAS的致病机理还不清楚,造血干细胞移植是治疗典型WAS唯一有效的手段,且受限于HLA配型,并易发生移植并发症。迄今为止,用于WAS疾病研究的哺乳动物只有小鼠。然而WASP缺陷小鼠没能完全模拟出WAS患者临床上的典型症状,如血小板减少程度较轻,没有出血迹象,也没有严重感染,而且这些WASP缺陷小鼠拥有正常的生长能力和生存能力。因而,培育一种更合适的WAS动物模型,将有利于更深入地研究WAS发病机理和开发WAS诊断方法与治疗方案,家兔是一种经典的实验动物。相比于小鼠,兔子的遗传背景和生理结构与人类更相似。因此,我们拟通过基因编辑方法建立一个WAS疾病兔模型,以更精确地模拟人类WAS疾病特征。在本研究中,我们设计了一对分别靶向兔WAS基因外显子2和7的sgRNAs,将这两条sgRNAs和Cas9 mRNA共注射到兔原核期受精卵胞质中,通过胚胎移植,获得10只仔兔,其中有9只为WAS基因编辑兔,效率高达90%。经过进一步交配繁殖获得了第一代仔兔和第二代仔兔共33只,其中包括插入缺失突变或大片段删除杂合子17只及纯合子8只。免疫印迹实验显示WAS敲除杂合子的WASP表达量减半,而纯合子(基因型为WAS/-或WAS-1,记为WASKO兔,)则没有检测到WASP。检测兔的血小板数量发现,与人类WAS患者相似,WASKO兔的血小板显著减少,部分兔的皮肤出现湿疹样出血性红斑。分析兔的淋巴细胞数量发现,WAS KO兔外周血和脾脏淋巴细胞显著减少;进一步分析显示外周血和脾脏T细胞减少,且外周血CD8+T细胞严重减少。这些免疫细胞的减少导致WASKO兔抵抗微生物病原体的能力下降,WAS KO兔在出生后10个月内相继因严重感染而死亡。通过对死亡兔的病理检测发现,WASKO兔的皮肤、肺、胃和肾中观察到了明显的充血或出血,以及炎症病灶,进一步说明WAS KO兔血小板减少和免疫系统的缺陷导致了其易于出血和易感染的病理特征。体重和生存期测试发现WASKO兔的生长发育在早期与正常兔差异不大,但1月龄后体重增速开始低于正常兔;其平均寿命为2个月,最长存活期为9个月。本研究利用CRISPR/Cas9成功建立了首个WAS疾病模型兔,精确地模拟了 WAS患者多种典型症状,包括血小板严重减少,出血倾向,淋巴细胞减少,严重的感染和降低的生存期。WAS疾病兔模型的成功建立将使兔替代小鼠,成为更优秀的WAS机理研究模型,为人类WAS疾病临床前研究提供一个重要研究工具。

关键词： Wiskott-Aldrich综合征家兔 CRISPR 血小板减少感染