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脂肪酸水合酶的筛选和应用

脂肪酸水合酶的筛选和应用

作者：芦东北京化工大学

学位级别：硕士

脂肪酸作为自然界主要的可再生资源之一,其具有来源广泛,基数庞大的特点,因而具有巨大的工业应用潜力。目前,脂肪酸的应用大多是基于其羧基端酯化性能应用的开发,而对于其烷烃链的活化与应用研究相对较少。针对于不饱和脂肪酸烷基链中的... 详细信息

脂肪酸作为自然界主要的可再生资源之一,其具有来源广泛,基数庞大的特点,因而具有巨大的工业应用潜力。目前,脂肪酸的应用大多是基于其羧基端酯化性能应用的开发,而对于其烷烃链的活化与应用研究相对较少。针对于不饱和脂肪酸烷基链中的C=C键,主要应用多集中于氧化断裂及环氧化反应,当前的工业应用中仍存在诸多弊端,应用效果也受限于纯度、效率、定位性等因素,导致产品的市场价值较低,甚至部分过程停步于实验室阶段而难以放大。因而,定向高效的衍生C=C键,赋予脂肪酸烷基链新的理化性能,并基于此制备一系列高附加值的产品是目前油脂化工领域研究的重点与难点。基于以上问题,本论文由浅及深的开辟了三条以脂肪酸水合酶为基础的不饱和脂肪酸应用工艺。第一部分工作围绕利用水合酶FA-HY2(from Lactobacillus acidophilus NTV001)可催化亚油酸产生特定β-羟基烯烃结构的性质,结合β-羟基烯烃结构定向热裂解反应,设计了一条生物—化学级联催化亚油酸制备生物材料及生物燃油原料的新工艺途径。该部分工作中,首先优化确定了 FA-HY2重组蛋白在大肠杆菌中的表达条件和水合反应条件,在最佳水合条件下,10-羟基-12-十八碳烯酸(HOD)的产率达到了 85%。随后,对10-HOD的定向热裂解反应进行了研究,α-辛烯和10-氧代癸酸的收率分别达到35%和39%。该部分工作提出了一种脂肪酸分子中碳原子的高效利用途径,为脂肪酸的加工与应用提供了新的选择与参考。第二部分工作中,利用水合酶BbMCRA2(from Bifidobacterium breve NCIMB 702258)对不同不饱和脂肪酸的催化特异性,设计了水合酶动力学拆分制备高纯度亚麻酸的工艺;通过对温度、酶添加量、pH和缓冲液添加量在内的催化条件的优化,实现了水合酶对油酸、亚油酸和亚麻酸的动力学拆分,单次反应可将混合脂肪酸中的亚麻酸含量从55%提高至68%,经过三次反应拆分,最终可将亚麻酸含量提升至75%。有效的提高了天然油脂中亚麻酸的含量,为亚麻酸的提纯问题提供了全新的解决方案。第三部分工作基于水合酶Em-OAH对于油酸的高效催化反应过程,探索了以油酸为原料生产癸二酸的多酶级联催化反应途径。实验结果表明该途径经水合酶、醇脱氢酶、BVMO单加氧酶和脂肪酶联用,可有效的转化油酸生产癸二酸;而该过程中的限制步骤在于BVMO单加氧酶的加氧效率。该研究为上述绿色高效的多酶生物催化体系的实现提出了基础的参考。

关键词：绿色生物催化油脂化学脂肪酸水合酶水和反应羟基脂肪酸

基于酶分子半理性设计的多酶催化合成二元羧酸体系的构建

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基于酶分子半理性设计的多酶催化合成二元羧酸体系的构建

作者：陆洁北京化工大学

学位级别：硕士

以癸二酸为代表的α,ω-二元羧酸(α,ω-DCAs)是重要的化学工业中间体,在食品医药、农业生产,尤其是高分子材料生产领域具有广泛的应用。传统的以化学氧化裂解/热解为基础的癸二酸生产工艺涉及强酸强碱、有毒有害溶剂,存在能耗高、污染... 详细信息

以癸二酸为代表的α,ω-二元羧酸(α,ω-DCAs)是重要的化学工业中间体,在食品医药、农业生产,尤其是高分子材料生产领域具有广泛的应用。传统的以化学氧化裂解/热解为基础的癸二酸生产工艺涉及强酸强碱、有毒有害溶剂,存在能耗高、污染严重,过程副产物不可控等缺陷。生物催化技术的发展为癸二酸的绿色可持续生产提供了新的机遇。然而癸二酸生产的多酶级联反应体系中存在许多限制性因素,包括(1)Baeyer-Villiger单加氧酶与仲醇脱氢酶的辅因子特异性不匹配,辅因子无法自循环再生;(2)天然的可用于癸二酸生物催化合成的Baeyer-Villiger单加氧酶来源稀少,常存在稳定性差、催化活性低等不足;(3)体系中各酶的最适反应条件不同,多酶体系的工艺参数亟待优化。本课题旨在解决上述限制性问题,开发并优化高效、专一、绿色的癸二酸多酶级联催化合成体系。首先,基于分子模拟技术,通过定向进化和半理性设计将来自Micrococcus luteus WIUJH20的仲醇脱氢酶(Ml ADH)的辅因子特异性从NAD改造为NADP,筛选得到的Ml ADH突变体(D37G-A38T-V39K)以NADP为辅因子进行催化时癸二酸产率提高了3.7倍。同时,在Ml ADH突变体(D37G-A38T-V39K)和来自Pseudomonas aeruginosa的Baeyer-Villiger单加氧酶(Pa BVMO)之间成功构建了NADP/NADPH原位再生自循环系统,使多酶催化体系的癸二酸最终产率提高至49.3%,简化了产物分离难度,降低了酶促转化过程的成本。其次,基于过氧化氢通道预测和定点突变提升Pa BVMO氧化稳定性,Pa BVMO单突变体(Y404L)的癸二酸催化转化率相比野生型提高了37%;基于B因子计算和定向饱和突变提升Pa BVMO热稳定性,Pa BVMO单突变体R354P和R354F的癸二酸催化转化率相比野生型分别提高了50%和41%;在此基础上通过迭代突变,Pa BVMO双突变体(R354P-Y404L)的癸二酸催化转化率相比提高了51%。最终,对多酶级联体系催化工艺参数进行优化。当Ml ADH突变体(D37G-A38T-V39K)和Pa BVMO突变体(R354P-Y404L)的最适耦合催化比例为1:6,此时癸二酸最终产率达到78.34%。结合单因素优化和响应面分析,最佳工艺参数条件为p H 8.8、反应温度26.5℃,Ml ADH突变体(D37G-A38T-V39K)及Pa BVMO突变体(R354P-Y404L)添加配比为1:6.5,此时癸二酸最终产率达到87.73%,与添加GDH和NOX辅助辅因子再生系统的多酶共催化体系相比提高了2.38倍。本课题基于酶分子的半理性设计,构建了癸二酸多酶催化合成体系内的辅因子再生自循环系统;进化提高了系统关键酶蛋白的催化稳定性;并完成了多酶偶联催化工艺参数的优化,有效提高了多酶催化体系的催化效率和癸二酸产率。该高效、绿色的癸二酸多酶催化合成体系,为天然脂肪酸生产癸二酸提供了新的途径,为油脂资源的生物炼制提供了新的技术支撑。

关键词：癸二酸仲醇脱氢酶 Baeyer-Villiger单加氧酶多酶级联反应半理性设计分子模拟

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5-羟甲基糠醛氧化酶的定向进化及应用开发

5-羟甲基糠醛氧化酶的定向进化及应用开发

作者：武秋阳北京化工大学

学位级别：硕士

为破解资源与环境问题造成的经济发展瓶颈,以生物基产品替代石油基产品已成为新的研究热点。在高分子产业中,随着欧盟最严“限塑令”的颁布,及我国“碳达峰、碳中和”目标的提出,以绿色生物制造为基础的生物基高分子材料绿色合成技术的... 详细信息

为破解资源与环境问题造成的经济发展瓶颈,以生物基产品替代石油基产品已成为新的研究热点。在高分子产业中,随着欧盟最严“限塑令”的颁布,及我国“碳达峰、碳中和”目标的提出,以绿色生物制造为基础的生物基高分子材料绿色合成技术的开发及应用,已成为产业发展的必然趋势。木质纤维素降解后得到的糖类化合物,经进一步转化可生产呋喃二甲酸、葡萄糖二酸等二元有机酸,可为生物基高分子的合成提供基础。糖类化合物及其衍生物的生物转化过程需要寻找相应酶分子完成反应。酶分子作为生物催化剂,其性能的优劣是生物基高分子材料合成及转化技术的关键。然而,天然来源的酶分子往往难于满足工业生产需求,必须在解决酶分子活性、稳定性问题的基础上,才可以进一步开发相应的绿色催化工艺,并将之应用于工业生产。本文基于上述问题进行了3部分的研究工作。1.高通量筛选技术的开发,是酶分子进化和改造得以实现的前提。本文针对于来源自Methylovorus *** MP688的5-羟甲基糠醛氧化酶(HMFO),催化过程产生HO的反应特性,通过比对不同的HO半定量表征方案,构建并优化了HMFO酶的高通量筛选方案,为后续HMFO酶定向进化工作的开展奠定了基础。2.针对于来源于Methylovorus *** MP688的HMFO酶热稳定性难于满足工业应用需求的问题,通过计算模拟分析造成HMFO酶热稳定性较差的酶分子缺陷结构,基于B-因子理论选择HMFO酶进化氨基酸残基,并进行半理性定向进化,以提高其热稳定性。利用定点饱和突变技术构建突变文库,经过筛选后获得的突变体(Q319K)的最适催化温度由25℃提升至35℃,催化速度提升25%,呋喃二甲酸(FDCA)产率提升了20%;同时,35℃下HMFO半衰期延长了80%。该部分工作为酶催化HMF转化生产FDCA工艺开发提供了技术基础。3.通过同源性分析和空间结构比对,发现Methylovorus *** MP688的HMFO酶和葡萄糖氧化酶具有一定的同源性;同时,实验证明部分HMFO酶突变体对该酶的非天然底物葡萄糖具有微弱催化活性;因此,可以利用分子对接技术结合结构可视化分析技术,分析对比HMFO酶和葡萄糖氧化酶的底物结合区的结构差异,选择突变位点并设计突变方案,构建突变文库对HMFO催化葡萄糖生产葡萄糖二酸的非天然活性进行定向进化。获得的突变体(N511H)对葡萄糖二酸的产率由3.9%提升至10.86%;该部分工作为酶促催化葡萄糖一步法转化生产葡萄糖二酸工艺的开发提供了新的思路。

关键词： 5-羟甲基糠醛氧化酶酶分子定向进化 B-因子呋喃二甲酸葡萄糖二酸

基于聚合物纳米胶囊的蛋白药物口服递送体系的构建及其应用

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基于聚合物纳米胶囊的蛋白药物口服递送体系的构建及其应用

作者：安瑞鹏北京化工大学

学位级别：硕士

多肽及蛋白等生物大分子药物具有副作用小、靶标特异性强等独特优势,在糖尿病、肿瘤等重大疾病的治疗中发挥着巨大作用。由于大分子药物在胃肠道部位不易被吸收并常常会被蛋白酶水解,该类药物的给药途径多以注射为主才能达到所需的剂量... 详细信息

多肽及蛋白等生物大分子药物具有副作用小、靶标特异性强等独特优势,在糖尿病、肿瘤等重大疾病的治疗中发挥着巨大作用。由于大分子药物在胃肠道部位不易被吸收并常常会被蛋白酶水解,该类药物的给药途径多以注射为主才能达到所需的剂量和药代动力学。然而,注射给药存在便利程度差、患者依从性低等明显不足。开发生物大分子药物的口服递送系统,可极大地提高其给药的便利性和依从性,也是当前生物大分子药物研发领域的热点方向。生物大分子药物自口服至小肠吸收的过程存在的生理屏障主要包括由p H环境和多种蛋白酶所组成的生化屏障、覆盖于肠胃细胞上皮的黏液屏障、以及细胞所构成的肠上皮细胞屏障。如何突破上述一系列屏障的阻碍是该类药物口服递送体系研究的关键。本文通过水相原位自由基聚合的方法,将蛋白分子包裹在交联的聚合物壳层中,成功制备出了一种可用于口服递送多肽及蛋白药物的纳米胶囊。该交联聚合物胶囊结构主要由3-丙烯酰胺基苯硼酸(PBA)和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)组成。纳米胶囊的交联聚合物外壳可以保护蛋白分子免受生化屏障中p H环境和蛋白酶的影响;PBA单体可通过与黏液层中黏蛋白的相互作用提高纳米胶囊在肠道黏液层的滞留能力;MPC单体可以通过细胞膜上的胆碱转运体介导纳米胶囊的跨膜转运。主要研究结果如下:(1)论文首先以牛血清蛋白(BSA)为构建口服递送平台的模型蛋白,通过优化纳米胶囊的合成条件,确定了BSA与聚合单体的最优比例为1:7200;该条件下n(BSA)p MPC-PBA的包封率约为71%;所合成的纳米胶囊是一种粒径约为25nm的球形颗粒;Zeta电位的测定结果表明纳米胶囊壳层会遮掩模型蛋白本身的电负性,导致电位值的减小;该聚合过程条件温和,能够极大程度上避免对蛋白活性的影响。黏液附着能力的表征,证明了纳米胶囊中PBA的引入增加了载体的黏蛋白附着能力;Caco-2细胞组成的肠上皮细胞递送模型验证了新合成纳米胶囊的肠上皮细胞屏障穿透能力,与单纯BSA对照相比,纳米胶囊的透过率增加约20%;最后通过观察BSA在体内的分布证明该纳米胶囊能够加强口服途径蛋白类药物的递送效果,从而提升了药物进入血循环的过程。(2)在此基础上,选用胰岛素作为研究药物,探究了该纳米胶囊的口服递送效果。为改善纳米胶囊在体内的降解能力,实现蛋白药物的可控释放,改用PLA-PEG-PLA二甲基丙烯酸酯作为交联剂;体外表征实验证明纳米胶囊壳层的引入会赋予胰岛素抵抗水解酶降解的能力;动物实验结果表明,针对于血糖值大于16.7 mmol/L的Ⅰ型糖尿病大鼠,与口服游离胰岛素相比,纳米胶囊n(INS)p MPC-PBA能够降低糖尿病模型大鼠的血糖水平,证明纳米胶囊的引入可提高胰岛素的口服生物利用度;组织损伤性评价则证明了纳米胶囊不会对动物脏器组织产生损伤,该纳米胶囊的生物安全性良好。综上所述,依赖于PBA单体的黏蛋白附着能力以及MPC单体介导跨膜转运的功能特性,本课题所构建的基于聚合物纳米胶囊的口服递送体系,能够一定程度上提高胰岛素的口服生物利用度,为后续不同多肽及蛋白类药物的口服递送体系构建提供了新的思路。

关键词：纳米胶囊药物递送口服给药多肽及蛋白药物功能材料