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松花粉硫酸酯化多糖对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用

松花粉硫酸酯化多糖对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用

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作者：邢丽山东师范大学

学位级别：硕士

本实验室先前采用马尾松花粉粗多糖硫酸酯化多糖（SPPM60）作用与小鼠脾脏混悬细胞，结果发现SPPM60能显著促进脾脏混悬细胞内自由钙离子浓度的升高。由于脾脏淋巴细胞中富含T、B淋巴细胞，为了进一步探究松花粉多糖及其酯化多糖对于脾... 详细信息

本实验室先前采用马尾松花粉粗多糖硫酸酯化多糖（SPPM60）作用与小鼠脾脏混悬细胞，结果发现SPPM60能显著促进脾脏混悬细胞内自由钙离子浓度的升高。由于脾脏淋巴细胞中富含T、B淋巴细胞，为了进一步探究松花粉多糖及其酯化多糖对于脾脏淋巴细胞具体作用机制，本实验室分别从脾脏中分离出了T、B淋巴细胞研究了松花粉多糖及其酯化多糖对其免疫调节作用，实验证实了马尾松花粉酯化多糖对于T、B淋巴细胞都具有显著的激活作用，均促进了T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖以及T淋巴细胞B淋巴细胞胞内钙离子浓度的升高。同时还通过实验验证了其中一条SPPM60作用于淋巴细胞引起胞内钙离子浓度升高的可能的胞内钙离子信号通路：SPPM60→Receptor→PI3K→PLC→IP3→IP3R→CRAC，其中Toll样受体4是硫酸酯化多糖作用于B淋巴细胞的主要多糖受体。一、采用热水浸提提取松花粉粗多糖，进一步用三氯乙酸法除去其中的蛋白质成分以后再分别用20%、40%、60%、80%的乙醇对粗多糖组分进行依次沉淀。选取60%乙醇沉淀的多糖组分经过聚丙烯酰胺凝胶柱层析对其进行分离纯化，直至最终得到一种较均一的组分，将其命名为PPM60-D。称取14.87mg PPM60-D，采用氯磺酸-吡啶法对其进行硫酸酯化，最终得到硫酸酯化多糖SPPM60-D18.57mg，氯化钡-明胶比浊法测定硫酸酯化多糖的取代度为1.87。红外光谱分析硫酸酯化多糖中有S=O和C-O-S的特征吸收峰，表明PPM60-D硫酸酯化成功。二、采用腹腔灌洗法提取小鼠腹腔巨噬细胞，用MTT法检测PPM60-D和SPPM60-D在不同作用浓度下对小鼠腹腔巨噬细胞相对活性的影响。结果发现800μg/mL的SPPM60-D能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞的相对活性，而PPM60-D对小鼠腹腔巨噬细胞的作用相对较弱。用MTT法检测PPM60-D和SPPM60-D在不同浓度下对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响。结果发现800μg/mL的SPPM60-D能显著增强小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖能力，而PPM60-D对小鼠巨噬细胞RAW264.7的促增殖作用效果相对较弱。三、用双波长荧光分光光度计检测800μg/mL SPPM60-D处理的巨噬细胞RAW264.7后[Ca2+]i的变化情况。800μg/mL SPPM60-D显著的提高了巨噬细胞RAW264.7胞内自由钙离子浓度。采用抑制剂处理钙离子通路中的几个关键蛋白后发现2-APB、U73122和TAK-242较大程度地抑制SPPM60-D引起的巨噬细胞RAW264.7胞内自由钙离子浓度的升高，LY294002和Verapamil能部分抑制SPPM60-D引起的巨噬细胞RAW264.7胞内自由钙离子浓度的升高，低分子肝素钠可以完全抑制SPPM60-D所引起的巨噬细胞RAW264.7胞内自由钙离子浓度的升高，并且会使其低于空白对照组胞内自由钙离子浓度。四、通过检测小鼠巨噬细胞粘附迁移能力、吞噬能力、分泌的主要的细胞因子（TNF α、IL-1、IL-6）及重要炎症介质（NO、NO合酶）的情况来探究PPM60-D及SPPM60-D对巨噬细胞的免疫调节能力。同时结合小鼠巨噬细胞表面的主要多糖受体TLR4的抑制剂（TAK-242），探究Toll样受体4（TLR4）在多糖作用于巨噬细胞中的作用。实验结果表明，SPPM60-D能显著的促进小鼠巨噬细胞分泌重要的炎症介质和主要细胞因子，而且作用效果比阳性对照（LPS）要强。PPM60-D也有一定程度的促进作用但是作用效果不是很明显。用TLR4的抑制剂TAK242作用后，发现明显抑制了SPPM60-D的作用效果，抑制效果达到了50%左右，说明硫酸酯化多糖主要是通过TLR4作用于巨噬细胞的。五、检测PPM60-D及SPPM60-D对免疫抑制型巨噬细胞RAW264.7的免疫活性的影响，实验结果表明SPPM60-D有效的恢复了免疫抑制型的巨噬细胞的免疫活性：细胞的吞噬能力增强，分泌细胞因子(IL-1、IL-6、TNF α)的水平上升、NO合成增多，而PPM60-D的作用效果甚微。

关键词：松花粉多糖酯化多糖小鼠巨噬细胞 [Ca2+]i 细胞因子

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阿维菌素（abamectin）在甘蓝和土壤中的残留检测技术及降解规律研究

阿维菌素（abamectin）在甘蓝和土壤中的残留检测技术及降解规律...

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作者：邓立刚山东师范大学

学位级别：硕士

阿维菌素属大环内酯类抗生素,是从土壤放线菌的发酵产物中分离出来的,B1a是其主要的生物活性组分,其含量不低于80%,B1b不高于20%,以B1a来标定其含量。阿维菌素具有高效的杀虫、杀螨和抗寄生虫活性,被广泛用于农作物害虫、害螨和家畜抗... 详细信息

阿维菌素属大环内酯类抗生素,是从土壤放线菌的发酵产物中分离出来的,B1a是其主要的生物活性组分,其含量不低于80%,B1b不高于20%,以B1a来标定其含量。阿维菌素具有高效的杀虫、杀螨和抗寄生虫活性,被广泛用于农作物害虫、害螨和家畜抗寄生虫的防治。由于阿维菌素的用药量少,残留低,液相色谱-紫外检测技术根本达不到检测的要求,而液相色谱-荧光检测技术由于受到衍生条件的限制,重现性和再现性较差。本文建立了超高效液相色谱-串联质谱对阿维菌素在甘蓝和土壤中的残留分析方法并对其在环境中的残留动态进行研究,为掌握阿维菌素在甘蓝上使用后的残留情况,及评价阿维菌素对环境的安全性和制定其在甘蓝中的安全、合理使用准则提供科学依据。建立了阿维菌素在甘蓝和土壤中的超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS-MS)残留检测方法。样品经乙腈提取后,浓缩,经NH2固相萃取柱净化,超高效液相色谱梯度分离,质谱采用电喷雾离子源,以正离子检测方式进行质谱分析。实验结果表明,在1～200μg?L-1的质量浓度范围内,阿维菌素农药的工作曲线呈线性,其相关系数r=0.9998,甘蓝添加回收率为75.4%～90.0%,相对标准偏差为3.8%～5.2%,土壤添加回收率为77.4%～109.7%,相对标准偏差为4.3%～5.7%。定量限可达到1μg?kg-1,该方法灵敏、准确,选择性好,抗干扰能力强,可作为蔬菜中阿维菌素残留检测的确证方法。研究阿维菌素在甘蓝和土壤中的残留及降解动力学规律。用已建立的UPLC-MS-MS方法对田间试验采集的甘蓝和土壤样品进行测定。消解动态试验结果显示,阿维菌素的消解规律符合一级动力学方程模型,阿维菌素在甘蓝中的半衰期为1.52～1.89天,在土壤中的半衰期为2.01～2.23天,在甘蓝中的消解速率快于在土壤中消解速率,说明阿维菌素属于易降解农药。最终残留试验结果表明,在施药量分别为10.8g·hm-2(推荐剂量,有效成分)和16.2 g·hm-2(有效成分)两个剂量,施药分别1～2次,采样距最后一次施药7、14、21天的条件下,间隔7天后甘蓝中阿维菌素的残留量在<1.00～2.25μg?kg-1,14、21天均未检出,间隔7天后土壤中的阿维菌素的残留量在1.72～5.94μg?kg-1,14、21天均未检出。根据两地的农药残留试验结果以及现行的国内制定MRL值,同时参照国际上其他地区或组织制定的MRL值,建议按照推荐剂量10.8g·hm-2(有效成分),施药1次,安全间隔期为7天以上,食用甘蓝是安全的。

关键词：阿维菌素甘蓝土壤残留液相串联质谱

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中压分离松花粉多糖及高低分子量酯化多糖对巨噬细胞影响的研究

中压分离松花粉多糖及高低分子量酯化多糖对巨噬细胞影响的研究

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作者：杨金鑫山东师范大学

学位级别：硕士

从马尾松花粉中提取的多糖组分具有多种生物活性,如对Hep G2的抑制作用、对脾脏中T、B淋巴细胞免疫方面的调控作用以及对平滑肌细胞Ca2+水平的调节等。本论文基于实验室之前的工作,采用新的中压制备色谱技术分离纯化出单一的多糖组分并... 详细信息

从马尾松花粉中提取的多糖组分具有多种生物活性,如对Hep G2的抑制作用、对脾脏中T、B淋巴细胞免疫方面的调控作用以及对平滑肌细胞Ca2+水平的调节等。本论文基于实验室之前的工作,采用新的中压制备色谱技术分离纯化出单一的多糖组分并对其进行化学修饰与分子打断,探究多糖结构对巨噬细胞免疫调节能力的影响,并分析对应的构效关系。一、对200 g破壁的马尾松花粉多糖进行热水浸提,三氯乙酸法将干扰多糖功能研究的蛋白质杂质去除,用20%、40%、60%、80%不同浓度梯度的乙醇进行分级沉淀,得到0.98 g PPM20、0.54 g PPM40、2.98 g PPM60和2.74 g PPM80四种粗多糖组分,并把PPM60和PPM80作为分离单一组分的材料。二、选用中压制备色谱技术将得到的松花粉粗多糖进行分离与纯化。先对四种分子量确定的糖标准品混合液进行分离,探索合适的中压色谱层析条件,最终确定为三蒸水洗脱流速为2.5 ml/min、上样量为1ml且浓度为80 mg/ml、柱压控制在2-4 bar、延迟6分钟收集,隔40s收集一管。根据实验需求中压分离制备粗多糖SPPM80并收集第二个峰,纯化出单一组分命名为PPM80-B,测得分子量为317.76K。用盐酸降解成小分子多糖,命名为DPPM80-B,测得分子量为3.13K。氯磺酸-吡啶法将两种多糖进行硫酸酯化,命名为SPPM80-B和SDPPM80-B,测得取代度为1.08和1.34。三、MTT法检测四种多糖组分在不同浓度下对小鼠巨噬细胞RAW264.7相对活性的影响。结果表明,松花粉多糖对细胞的作用呈现低浓度促进、高浓度抑制的现象,浓度为400?g/ml时促增殖效果最为显著。化学基团的修饰对多糖活性的影响表现在硫酸酯化后的多糖显著增强了RAW264.7细胞的增殖能力,比未酯化多糖提高了46.2%。分子量方面,未降解的多糖对巨噬细胞的促增殖能力比降解后高24.3%。四、用四种多糖组分刺激小鼠巨噬细胞,通过对细胞黏附、迁移、吞噬及细胞因子和炎性介质的分泌合成情况等指标的检测来研究多糖在免疫调节方面的作用。同时加入多糖受体TLR4的抑制剂组,观察其在多糖影响细胞功能发挥过程中起到的作用,初步探索细胞表面受体识别多糖组分并引发信号通路的分子机制。结果显示,酯化多糖显著增强巨噬细胞的黏附、迁移与吞噬能力,诱导细胞因子IL-1、IL-6、TNF-?的分泌和炎性物质NO、NO合酶的生成,效果略差于阳性对照LPS组,未酯化的作用效果一般。分子量在黏附与吞噬方面作用差别不大,而在迁移和细胞因子的分泌上,未降解的小分子多糖生物活性优于降解后的。TAK-242处理组有效抑制了酯化多糖增强巨噬细胞免疫调节能力的作用,且抑制率在45%左右,验证了多糖组分激活巨噬细胞的过程当中有一部分是通过表面受体TLR4的识别来发挥作用的。

关键词：松花粉多糖中压制备色谱小鼠巨噬细胞免疫调节构效关系

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马尾松花粉提取物作用于BPH、NAFLD小鼠的代谢组学研究

马尾松花粉提取物作用于BPH、NAFLD小鼠的代谢组学研究

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作者：孙丰霞山东师范大学

学位级别：硕士

随着社会的发展非酒精性脂肪肝(NAFLD)和良性前列腺肥大(BPH)发病比例逐年升高,寻求能够根治且高效的天然植物制剂是现在的热点,而马尾松花粉内含丰富的营养物质,具有多种生物活性,产量大,是理想的潜在开发原料。本项研究采用液质联用... 详细信息

随着社会的发展非酒精性脂肪肝(NAFLD)和良性前列腺肥大(BPH)发病比例逐年升高,寻求能够根治且高效的天然植物制剂是现在的热点,而马尾松花粉内含丰富的营养物质,具有多种生物活性,产量大,是理想的潜在开发原料。本项研究采用液质联用技术检测经马尾松花粉提取物(MPPE)干预的BPH和NAFLD小鼠血清、尿液中代谢物的变化,结合多元数据分析对各组小鼠进行分类,评估MPPE对BPH、NAFLD/、鼠的预防及治疗作用,并寻找潜在生物标记物。这项研究对疾病的早期诊断、MPPE疗效评估、可能作用机制等几个方面都有重要的作用。本实验分为五部分,分别为MPPE预防BPH、治疗BPH、预防NAFL D、治疗NAFLD的代谢组学研究以及MPPE成分的初步分析。前四部分每部分实验中小鼠分为空白组、模型组、药物组和低、中、高三个剂量的MPPE干预组。实验结束后每只小鼠的血清与尿液采用超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)分离采集图谱,采用Markerlynx进行峰检测和峰匹配,再采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对样品进行模式识别分组,寻找血清中潜在生物标志物。对标志物进行二级质谱分析,结合HMDB、METLIN、NIST等数据库进行检索,对生物标志物定性分析。第五部分实验中用UPLC-Q-TOF-MS对 MPPE中相对含量较高的成分结合二级质谱进行定性分析。实验结果显示,在MPPE预防BPH实验中,高剂量的花粉相对效果更好,作用效果最接近药物,但是花粉组与药物组小鼠均未完全恢复到正常小鼠的代谢水平。该实验中检测到相对于空白组,模型组小鼠血清中显著变化的标志物为1-十六酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-O-十六烷基-2-O-乙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱和芥酸酰胺。药物和MPPE对这三种标志物均起到了一定的调节作用。在MPPE治疗BPH的实验中,得分图中各组小鼠也均获得了良好的分离,三种剂量的花粉效果均较好,以高剂量花粉的效果最好。从得分图中,第一主成分上,药物组与高剂量花粉组的小鼠血清代谢物基本恢复到了空白组小鼠的水平。相对于模型组小鼠,经过高剂量的马尾松花粉提取物干预后,小鼠血清中变化最显著的标志物分别为1-十六酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1-十八酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。在MPPE预防NAFLD实验中,低剂量MPPE作用效果较差,中剂量略好,高剂量最好,也比较接近药物组效果,但是并未完全恢复到正常水平。相对于模型组,经过MPPE干预后,小鼠血清中十一烷酸、十四烷二酸、棕榈酸乙酯等共9物质的水平变化较明显。在MPPE治疗NAFLD实验中,低、中、高剂量的花粉效果都良好,以高剂量花粉效果最好,在得分图中,高剂量的花粉组与药物组非常接近空白组,从第一主成分水平上基本恢复到了空白组的水平。相对于模型组,经过MPPE干预后,小鼠血清中硬脂酰胺、棕榈酸甲酯、1-O-十六烷基-2-0-(8Z,11Z,14Z-二十碳三烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酰胆碱等共7种物质变化较明显。在第五部分实验中,对MPPE初步分析后,发现其中含有较高的L-精氨酸(2.32%±0.32)和两种胆碱类物质(1.05%±0.08,0.80%±0.1)。结合各实验结果,MPPE发挥抗疾病活性可能主要有以下两个方面。第一MPPE对疾病模型小鼠磷脂代谢紊乱有调节作用,主要包括对溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)和血小板活化因子(PAF)及其类似物的调节。第二,MPPE对中、长链饱和及不饱和脂肪酸或脂肪酸酰胺具有调节作用。

关键词：马尾松花粉提取物前列腺肥大非酒精性脂肪肝代谢组学

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松花粉硫酸酯化多糖对3T3-F442A前脂肪细胞脂质分化的影响

松花粉硫酸酯化多糖对3T3-F442A前脂肪细胞脂质分化的影响

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作者：栾冬瑞山东师范大学

学位级别：硕士

本实验室前期研究表明，经60%乙醇沉淀的硫酸酯化后的松花粉多糖(SPPM60)可以作用于小鼠脾脏混悬淋巴细胞，并且可以升高脾淋巴细胞[Ca2+]i;对小鼠淋巴细胞进行分离后，发现添加SPPM60同样可以作用于T、B淋巴细胞。马尾松花多糖水提物... 详细信息

本实验室前期研究表明，经60%乙醇沉淀的硫酸酯化后的松花粉多糖(SPPM60)可以作用于小鼠脾脏混悬淋巴细胞，并且可以升高脾淋巴细胞[Ca2+]i;对小鼠淋巴细胞进行分离后，发现添加SPPM60同样可以作用于T、B淋巴细胞。马尾松花多糖水提物、醇提物以及甾醇均可作用于3T3-F442A前脂肪细胞，对脂肪细胞分化和脂质积累产生促进效应，并且马尾松花粉甾醇对脂肪细胞葡萄糖代谢以及AMPK和GLUT4的表达均产生抑制效应。目前，鲜有基于马尾松花粉多糖(PPM60)及酯化物(SPPM60)对3T3-F442A前脂肪细胞脂质分化以及胞内钙离子浓度作用的研究。因此，该研究将重点探究本实验纯化的松花粉多糖(PPM60-B)及其酯化物(SPPM60-B)对3T3-F442A前脂肪细胞增殖、脂质积累和[Ca2+]i等的影响;以及酯化多糖调控脂肪细胞内钙离子浓度，从而引起脂肪细胞内脂质积累改变的机制。实验主要分为以下几部分内容：一、实验采用水煮醇沉法提取工艺提取马尾松花粉多糖，经三氯乙酸法除杂蛋白后，得到经多级醇沉和聚丙烯酰胺凝胶Sehpacryl S-400R纯化后的60%多糖组分，并命名为PPM60-B,经氯磺酸-吡啶法得到酯化多糖SPPM60-B。氯化钡-明胶比浊法计算多糖取代度并进行红外光谱表征后，验证多糖酯化成功。两种多糖可用于进行后续实验。二、MTT法分别研究上述两种多糖在不同浓度和时间下对3T3-F442A前脂肪细胞增殖的影响。实验表明，作用前脂肪细胞24-72h后，浓度为10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL的SPPM60-B对前脂肪细胞增殖具有较为显著的抑制作用。当作用时间为48h，浓度为10μg/mL的SPPM60-B对前脂肪细胞的抑制作用最强，抑制率可达到24.92%。而PPM60-B和其他浓度的SPPM60-B在不同作用时间段内，均表现出不同程度的促进前脂肪细胞增殖的效果。三、将上述两种多糖在不同浓度下作用于3T3-F442A前脂肪细胞，通过油红O染色，镜下形态学观察前脂肪细胞分化情况，异丙醇半定量法和甘油三酯试剂盒检测前脂肪细胞分化水平。实验表明，PPM60-B对前脂肪细胞分化无显著性影响。而SPPM60-B则出现低浓度抑制分化，高浓度促进分化的效果。在浓度为10μg/mL时，SPPM60-B对前脂肪细胞分化有较为明显的抑制作用。四、选取处于分化早期的3T3-F442A前脂肪细胞，双波长荧光法测定上述两种多糖引起的分化阶段脂肪细胞[Ca2+]i的变化。实验证实，PPM60-B对前脂肪细胞[Ca2+]i变化无显著性影响。SPPM60-B对前脂肪细胞[Ca2+]i增加有剂量依赖效果，表现为酯化多糖浓度越高，胞内[Ca2+]i越高。200μg/mL SPPM60-B作用效果最强，且作用效果最佳。选取200μg/mL SPPM60-B孵育细胞，并检测发现，各胞内钙离子通道抑制剂(LY294002、U73122、LMWH、2-APB和Verapamil)均能一定程度上抑制由SPPM60-B引起的3T3-F442A前脂肪细胞内[Ca2+]i升高。而低分子肝素(LMWH)和2-APB能完全抑制SPPM60-B所引起的3T3-F442A前脂肪细胞[Ca2+]i的升高，且抑制后[Ca2+]i低于空白对照组。综上所述，本实验结果表明：松花粉硫酸酯化多糖可以通过调节胞内钙离子浓度从而对3T3-F442A前脂肪细胞增殖活性和脂质分化和积累产生影响。并且推测，其潜在的分子机制是通过receptor-PI3K-PLC-IP3R-Ca2+信号通路活化胞内内质网钙库IP3R通道，从而引起Ca2+的释放，而后激活膜表面CRAC通路，引起胞外钙离子内流，引起胞内钙离子浓度进一步升高。本实验对研究多糖调控前脂肪细胞脂质生成的机制有重要的意义。

关键词：马尾松花粉多糖酯化多糖 3T3-F442A 前脂肪细胞分化 [Ca2+]i

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甘油二酯对肥胖母鼠及其雄性子代肥胖的影响

甘油二酯对肥胖母鼠及其雄性子代肥胖的影响

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作者：李春山东师范大学

学位级别：硕士

围产期作为子代早期发育的关键窗口,母体的饮食状况和复杂多变的宫内环境给子代的健康维持带来了巨大的挑战。之前的研究表明,一定量的1,3-甘油二酯(DAG)可以减轻内脏脂肪重量,有利于脂肪酸氧化的顺利进行,同时一定程度上改善葡萄糖代... 详细信息

围产期作为子代早期发育的关键窗口,母体的饮食状况和复杂多变的宫内环境给子代的健康维持带来了巨大的挑战。之前的研究表明,一定量的1,3-甘油二酯(DAG)可以减轻内脏脂肪重量,有利于脂肪酸氧化的顺利进行,同时一定程度上改善葡萄糖代谢水平。然而关于对母体进行甘油二酯饮食干预能否改善母体代谢以及是否可以通过母体与子代的纽带改善母体高脂饮食给子代带来的肥胖与健康威胁还鲜有报道。本实验通过多种科学方法和技术手段针对甘油二酯对肥胖母鼠及其雄性子代肥胖的影响进行了分析,实验分为以下四个部分:一、甘油二酯改善了肥胖母鼠的脂质代谢,维持了健康良好的宫内环境。实验分为正常饮食组(m ND)、高脂饮食组(m HFD)、DAG饮食组(m DAG),三组母鼠自孕前四周开始饲喂相应饮食直至哺乳期结束。实验表明,同m HFD相比,m DAG可以显著降低母鼠的体重增量、体重增长率以及性腺周围白色脂肪组织重量及其占比。DAG饮食对小鼠血清中TAG、T-CHO的水平也有良好的改善效果,有利于小鼠血脂代谢的正常进行。DAG饮食减少了小鼠肝脏组织内的脂质沉积,同时保护了肝脏细胞内的线粒体免于结构破坏、形态紊乱的危险。DAG饮食上调了PPARα、CPT1A的表达,降低了ACSS2的表达水平。这表明甘油二酯可以促进脂肪酸氧化分解的进行,同时保护小鼠血管健康。与高脂饮食组不同,PKCβ和PKD1在DAG饮食组中并未异常升高,表明DAG饮食并未引起DAGPKC信号通路的异常激活,使小鼠远离炎症的同时保护小鼠的免疫系统功能正常。差异性甲基化基因的表达在m DAG中维持在正常水平,表明DAG饮食使母鼠宫内环境平稳健康,为子代的早期发育提供了良好的环境条件,同时给子代的长期健康提供了强力支撑。甘油二酯改善了高脂饮食导致的嘌呤代谢、嘧啶代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、β-丙氨酸的代谢、磷酸戊糖途径下降,有助于小鼠细胞生化反应的正常进行以及对身体能量的合理储存和供应。甘油二酯提高了粪便中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸的水平,降低了异丁酸、异戊酸的水平,同时改善了肠道菌群中厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroides相对丰度和它们的比例。肠道菌群多样性分析的结果显示,m ND母鼠肠道菌群的多样性维持在较高水平,而m HFD和m DAG母鼠肠道菌群中多样性降低,推测可能是高脂饮食和DAG饮食两种饲料中过高的油脂含量,导致了菌群中α多样性降低。DAG饮食维持了母鼠正常的体重和内脏脂肪含量,保护了血脂代谢正常,维持了线粒体形态正常,调节了肠道菌群,提升了粪便短链脂肪酸含量。关联分析的结果乙酸、丙酸、丁酸、己酸和PPARα、CPT1A以及差异甲基化基因Miz-1的变化显著正相关,与性腺周围白色脂肪组织占比和ACSS2、PKCβ、PKD1基因的表达情况显著负相关,表明小鼠的肝脏和脂肪组织中的细胞因子与其粪便中肠道菌群相互影响共同调节小鼠的脂质代谢,共同对母鼠的生理状态发挥作用。二、甘油二酯对肥胖母鼠的幼龄(3周龄)雄性子代表型参数以及肝脏和脂肪组织中的细胞因子有明显的调节作用。对来自三种饮食模式母鼠的幼龄雄性子代进行了实验。DAG饮食一定程度上缓解了高脂饮食带来的体重迅速增长,降低了幼龄子代小鼠血清中TAG、T-CHO、LDL-C的水平。说明尽管DAG饮食中油脂含量较高,但是不同的油脂类型给子代小鼠带来了不同的身体表型及血脂代谢水平,甘油二酯一定程度上改善了幼龄子代小鼠的身体表型,并且有益于幼龄子代保持良好的血脂水平。DAG饮食幼龄子代小鼠其HE染色结果显示肝脏内圆形脂质空泡减少;透射电子显微镜的结果显示,脂滴面积更小,数目更少,线粒体的形态和结构也更加清晰。这些结果表明DAG饮食对于幼龄子代小鼠肝脏内脂质的过度积累有抑制作用,同时保护了幼龄子代小鼠的线粒体,有利于能量代谢顺利进行。DAG饮食还通过上调肝脏和脂肪组织中PPARα、CPT1A的表达,下调ACSS2的表达促进脂肪酸氧化分解的顺利进行。DAG饮食的幼龄子代小鼠受到来自良好宫内环境的支持,其免疫系统发育良好,未引起DAG-PKC信号通路的异常激活,同时与母鼠差异性甲基化基因的表达情况类似,幼龄子代小鼠其差异甲基化基因的表达情况与正常组类似,关联分析的结果也侧面印证了这一点。围产期母鼠相对健康的饮食状态、良好的生理健康状态、平稳适中的血脂水平、积极稳健的能量代谢和脂质代谢、比例适中的肠道菌群组成保证了早期小鼠健康的发育空间,也使得幼龄子代小鼠血脂水平和细胞因子处在良好的水平,同时给幼龄子代小鼠的长期健康提供了良好前提。三、甘油二酯调节了肥胖母鼠的成年(12周龄)雄性子代的肠道菌群,改善了成年子代小鼠粪便中短链脂肪酸的含量。小鼠在3周龄时断奶,对来自三种饮食母鼠的其余雄性子代进行新的饮食分组,来自正常饮食母鼠的雄性子代分为正

关键词：甘油二酯肥胖母体子代肠道菌群

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松花粉多糖酯化前后对小鼠结肠炎的作用及肠道菌群的研究

松花粉多糖酯化前后对小鼠结肠炎的作用及肠道菌群的研究

引用

作者：王亚莉山东师范大学

学位级别：硕士

松花粉的多糖和硫酸酯化多糖具有调节免疫功能的作用,能够刺激脾脏淋巴细胞分泌抗炎因子,通过荧光多糖示踪实验表明,松花粉多糖可以通过细胞表面受体Toll样受体4(TLR4)进入大鼠小肠隐窝上皮细胞。因此我们推测,松花粉可能会影响肠道免疫... 详细信息

松花粉的多糖和硫酸酯化多糖具有调节免疫功能的作用,能够刺激脾脏淋巴细胞分泌抗炎因子,通过荧光多糖示踪实验表明,松花粉多糖可以通过细胞表面受体Toll样受体4(TLR4)进入大鼠小肠隐窝上皮细胞。因此我们推测,松花粉可能会影响肠道免疫,改善肠道方面相关疾病。本实验以DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎为模型,通过肠道免疫水平、血清代谢组学和粪便宏基因组学三个层面探究松花粉的多糖和硫酸酯化多糖对小鼠体内炎症的作用。本实验主要包括以下几个部分:一、对云南松花粉多糖进行单糖组成分析以及硫酸化修饰。采用水煮醇沉法提取松花粉多糖,将60%乙醇沉淀的粗多糖命名为PPM60,主要由半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、鼠李糖和一种未知单糖组成。采用氯磺酸-吡啶法酯化松花粉多糖,并用BaSO比浊法测得取代度为1.45,傅里叶红外光谱结果也说明多糖被成功酯化。二、以DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎为模型,研究松花粉的多糖和酯化多糖对结肠炎小鼠的作用。用C57BL/6小鼠饮用3%DSS水溶液5 d建立模型,实验分为四组:健康对照组(HC)、模型组(DSS)、多糖组(PM)和酯化多糖组(SPM)。结果发现,与HC组相比,DSS组小鼠体重减轻,DAI指数升高,结肠长度明显缩短,粘膜组织损伤严重,并且有大量的炎性细胞浸润,这说明小鼠结肠病变,造模成功。PM组和SPM组小鼠体重下降程度缓解,DAI评分低于DSS组,结肠长度缩短现象得到恢复,粘膜损伤程度轻于DSS组,说明PPM60和SPPM60对DSS诱导的结肠损伤有一定的修复作用,对结肠炎的发展和病变有改善作用。三、检测小鼠血清C反应蛋白(CRP)以及结肠组织中细胞因子的变化,研究多糖和酯化多糖对结肠炎小鼠肠道免疫的影响。结果发现,在DSS组中,血清CRP水平显著升高,抗炎细胞因子IL-2、IL-10和IL-13的水平降低,促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平升高。而在PM组和SPM组中这种现象得到改善,并且,PPM60在抑制促炎细胞因子水平上效果较好,SPPM60对抗炎细胞因子的作用效果更好。四、利用H-NMR技术分析小鼠血清代谢组的变化。多元统计分析结果显示,四组小鼠具有分离趋势,并且当小鼠两两分组比较时都能得到良好的区分。对VIP值≥2的化学位移进行代谢物的定性,HC组和DSS组定性出N-乙酰-L-丙氨酸,乙酸,L-岩藻糖,乳酸,牛磺酸,甜菜碱,乙酰胆碱和阿洛糖等8种可能的差异性代谢物,DSS组和PM组定性出N-乙酰-L-丙氨酸,乙酸,乳酸,果糖-6-磷酸,阿洛糖,D-木糖和L-左旋肉碱等7种可能的差异性代谢物,DSS组和SPM组也定性出甜菜碱,甘油磷酸,L-丝氨酸,D-木糖,乙酰胆碱,乳酸和阿洛糖等7种可能的差异性代谢物。五、利用16S rDNA扩增子测序技术分析小鼠粪便和肠道内容物菌群,研究其物种多样性的变化以及PPM60和SPPM60对肠道菌群变化的作用。结果发现在DSS组小鼠肠道菌群中,物种多样性降低,有害菌丰度增加,有益菌丰度降低,菌群失衡。PPM60和SPPM60可以恢复物种多样性,并且对气球菌属和阿克曼菌属有下调作用,对乳杆菌属和副萨特氏菌属等菌属都具有上调作用。本实验结果表明,多糖和酯化多糖对DSS诱导的溃疡性结肠炎有改善作用,具体表现在改善结肠缩短,修复肠道损伤,减轻肠道炎症,调节血清代谢组以及调节肠道菌群的平衡等方面都起到积极作用。

关键词：松花粉多糖溃疡性结肠炎肠道免疫血清代谢组肠道菌群

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基于代谢组学技术寻找蜂蜜标志性代谢物并探究其应用

基于代谢组学技术寻找蜂蜜标志性代谢物并探究其应用

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作者：江瑶山东师范大学

学位级别：硕士

蜂蜜作为一种营养价值丰富、广受人们欢迎的食品,由于生产周期长、产量低等原因常常供不应求,加之蜂蜜成分复杂,使它成为食品掺假的一个主要对象,不法分子常通过各种掺假手段来对蜂蜜进行造假,谋取利益。由于蜂蜜的主要成分为葡糖糖和果... 详细信息

蜂蜜作为一种营养价值丰富、广受人们欢迎的食品,由于生产周期长、产量低等原因常常供不应求,加之蜂蜜成分复杂,使它成为食品掺假的一个主要对象,不法分子常通过各种掺假手段来对蜂蜜进行造假,谋取利益。由于蜂蜜的主要成分为葡糖糖和果糖,目前蜂蜜掺假的常用手段是通过掺入廉价糖浆的方式制造掺假蜂蜜,现有的对蜂蜜掺假进行鉴别的方法有:稳定碳同位素比值分析法(SCIRA)、薄层色谱法(TLC)、脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)、气相色谱质谱联用技术(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相同位素质谱仪联用技术(HPLC-IRMS)、核磁共振技术(NMR)以及近红外光谱技术(NIR)等,但是这些方法各有其缺陷,并且对于使用C3植物糖浆进行掺假的掺假蜂蜜的鉴别难题并未突破。本研究采用液质联用技术对真蜂蜜(荆条蜜、洋槐蜜、枣花蜜)与掺假蜂蜜的代谢物进行全面获取与分析,并结合多元统计分析软件对真蜂蜜与掺假蜂蜜进行区分,寻找真蜂蜜样品的标志性代谢物,实现对真假蜂蜜的鉴别。本研究在未来蜂蜜市场中对蜂蜜质量的控制具有重大意义。本实验分为四部分,第一部分为基于代谢组学技术寻找真正蜂蜜的标志性代谢物、第二部分为基于代谢组学技术对真蜂蜜与糖浆掺假蜂蜜进行区分、第三部分是基于代谢组学技术对成熟蜜与未成熟蜜进行区分、第四部分是基于代谢组学技术对真蜂蜜与已知劣质蜂蜜进行区分。四部分实验对样本原始数据的获取均采用超高液相色谱串联四级杆轨道离子阱高分辨质谱(UHPLC-Q Exactive Obitrap LC-MS),上机检测后的原始数据经过Compounds Discoverer软件对样品进行总离子流图色谱峰的提取、峰对齐、未知物的检测等差异性分析,通过多元统计分析实现对比较样品组的区分,找到的可能的标志性代谢物进行二级质谱分析寻找碎片离子,初步完成标志性代谢物的定性工作。第一部分结果显示:真正蜂蜜样本荆条蜜、洋槐蜜、枣花蜜三种蜂蜜均能实现与各种蜂蜜掺假糖浆的区分,并通过分析找到了三种蜂蜜的各自的可能的标志性代谢物并对其完成了初步定性。荆条蜜可能的标志性代谢物有:苯丙氨酸、亮氨酸、泛酸、对香豆酸、肉桂酸、白杨素、酪氨酸,其中苯丙氨酸和泛酸是荆条蜜可能的特有的标志物;洋槐蜜的可能的标志性代谢物有:色氨酸、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、视黄酸、对香豆酸、脱落酸、肉桂酸、白杨素,其中色氨酸、视黄酸和脱落酸是洋槐蜜可能特有的标志性代谢物;枣花蜜可能的标志性代谢物有:褪黑激素、N-乙酰羟色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、对香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白杨素。其中褪黑激素、N-乙酰羟色胺、4-甲氧基肉桂酸是枣花蜜可能特有的标志性代谢物。第二部分结果显示:三种蜂蜜与糖浆掺假蜂蜜的区分效果明显,在大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、蜂蜜专用糖浆掺入1%比例的水平上,就能与三种真蜂蜜实现区分,说明本研究的代谢组学方法对糖浆掺假蜂蜜的检测限能够达到1%,且随着掺入糖浆比例的增大,在PCA得分图上糖浆掺假蜂蜜样品组有距离真蜂蜜样品组越来越远的趋势。第三部分结果显示:荆条蜜、洋槐蜜、枣花蜜三个品种的成熟蜜与未成熟蜜在PCA得分图上在第一主成分上分离效果显著,在最后第四部分对真蜂蜜与已知劣质蜂蜜的鉴别试验中,本研究所用的代谢组学方法能够实现将真洋槐蜜与已知劣质洋槐蜜的区分、真枣花蜜与已知劣质枣花蜜的区分,并且将不同品种的已知劣质蜜在与真荆条蜜、真洋槐蜜、真枣花蜜进行统一比较时,发现不同品种的已知劣质蜜归为一组,均能够与三个品种的真蜂蜜实现分离。结合实验结果分析,本研究所用的代谢组学方法对蜂蜜掺假鉴别效果明显,优于现有的对蜂蜜掺假鉴别的其他检测方法,不需要对某一或某些靶向物质进行定性定量测定,是一种宏观非靶向的种类区分的方法。方便快捷,前处理方法比较简单易于操作,上机处理后数据经Compounds Discoverer软件进行多元统计分析建立PCA模型即可实现真蜂蜜与糖浆掺假蜂蜜的鉴别。

关键词：蜂蜜糖浆蜂蜜掺假代谢组学标志性代谢物

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马尾松花粉多糖的结构分析以及硫酸酯化多糖对肝癌细胞HepG2的影响

马尾松花粉多糖的结构分析以及硫酸酯化多糖对肝癌细胞HepG2的影响

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作者：高振山东师范大学

学位级别：硕士

许多研究表明,多糖作为一类重要的生物活性大分子,具有多种功能活性,例如抗氧化,抗肿瘤,降血糖以及提高机体免疫力等。对多糖进行特定的修饰,可以极大提高多糖的生物学活性。本实验室的前期工作已经证明,硫酸化马尾松花粉多糖SPPM60可... 详细信息

许多研究表明,多糖作为一类重要的生物活性大分子,具有多种功能活性,例如抗氧化,抗肿瘤,降血糖以及提高机体免疫力等。对多糖进行特定的修饰,可以极大提高多糖的生物学活性。本实验室的前期工作已经证明,硫酸化马尾松花粉多糖SPPM60可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖,而未硫酸化的多糖PPM60则对HepG2的增殖无显著性影响。此外,SPPM60可以显著降低HepG2胞内钙离子浓度,而PPM60则对[Ca]i无显著性影响。大量实验表明,用适当的方法对多糖进行降解,可以提高多糖的生物活性。目前,鲜有对马尾松花粉多糖的降解以及降解后多糖构效关系等方面的研究。因此本实验在结合实验室前期工作的基础上,对马尾松花粉多糖组分进行降解,并通过细胞学实验和NMR技术探究降解后多糖与未降解时相比构效关系的不同。实验主要分为以下几部分内容:一、采用水煮醇沉法从破壁马尾松花粉中提取多糖,并采用三氯乙酸法除去杂蛋白,用TOYOPEARL HW-65S中压凝胶柱层析对80%乙醇沉淀的多糖进行分离纯化,多次重复得到较为均一多糖组分,将其命名为PPM80-B。采用高效凝胶色谱法对多糖组分PPM80-B进行相对分子量的测定,结果测得PPM80-B的相对分子量为317.8K。二、采用酸解法对松花粉多糖PPM80-B进行降解,得到降解后的低分子量多糖组分,命名为DPPM80-B。在与实验一相同的色谱条件下对DPPM80-B进行相对分子量的测定,测得其分子量为3.131K,表明降解是成功的。采用氯磺酸-吡啶法分别对PPM80-B和DPPM80-B进行硫酸酯化修饰,得到酯化后多糖,并分别命名为SPPM80-B和DSPPM80-B。采用氯化钡-明胶比浊法分别对SPPM80-B和DSPPM80-B进行硫酸根取代度的测定,结果测得两者的取代度分别为1.08和1.26。三、MTT法分别探究四种多糖(PPM80、SPPM80、DPPM80和DSPPM80)对肝癌细胞HepG2增殖的影响。实验结果表明,SPPM80和DSPPM80对HepG2II的增殖具有抑制作用,且具有时间和剂量依赖性。SPPM80对HepG2增殖的抑制作用要强于DSPPM80。200μg/m L作用72h SPPM80对HepG2的抑制率达到31.47%,而相同条件下DSPPM80对HepG2的抑制率则为15.38%。PPM80和DPPM80对HepG2的增殖没有显著地影响。四、应用fura-2探针采用双波长荧光法测定四种多糖(PPM80、SPPM80、DPPM80和DSPPM80)对肝癌细胞HepG2胞内钙离子浓度的影响。实验结果表明,SPPM80和DSPPM80可以降低HepG2胞内钙离子浓度,且SPPM80的作用效果更加显著。PPM80和DPPM80对HepG2胞内钙离子浓度没有显著地影响。五、采用核磁共振波谱法对松花粉多糖的结构进行解析,主要从HNMR(氢谱)和CNMR(碳谱)两方面进行考察。结果显示,构成该多糖的单糖以吡喃环的形式存在,且该多糖是一种中性多糖,不含GalN残基,可能含有乙酰基中甲基氢或氨基糖中于N-乙酰氨基中的甲基氢,有C-6脱氧糖甲基的存在。综上所述,本实验结果表明马尾松花粉硫酸酯化多糖可以抑制肝癌细胞HepG2的增殖,且未降解的多糖组分对HepG2增殖的抑制作用要强于降解后的多糖组分。另外,松花粉硫酸酯化多糖可以显著降低HepG2胞内钙离子浓度,而这也可能是松花粉硫酸酯化多糖调节HepG2细胞活性的一种方式。

关键词：马尾松花粉硫酸酯化多糖降解 HepG2细胞胞内钙离子浓度 NMR

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玉米花粉多糖的提取纯化及生物活性的研究

玉米花粉多糖的提取纯化及生物活性的研究

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作者：王建波山东师范大学

学位级别：硕士

以玉米花粉(Maize Pollen)为原料,通过热水浸提、乙醇沉淀后,分别用Sevag 法、三氯乙酸(TCA)法两种方法去蛋白,得到多糖粗品。然后用不同浓度的乙醇分级沉淀,得到不同组分的玉米花粉多糖PMAS/PMAT,PMBS/PMBT,PMCS/PMCT,PMDS/PMDT。多糖... 详细信息

以玉米花粉(Maize Pollen)为原料,通过热水浸提、乙醇沉淀后,分别用Sevag 法、三氯乙酸(TCA)法两种方法去蛋白,得到多糖粗品。然后用不同浓度的乙醇分级沉淀,得到不同组分的玉米花粉多糖PMAS/PMAT,PMBS/PMBT,PMCS/PMCT,PMDS/PMDT。多糖总得率为3.34%。紫外光谱检测显示在260、280nm 处未见有核酸和蛋白特征吸收峰。其中PMCS 经红外光谱检测证实具有多糖类物质的特征吸收峰。玉米花粉多糖为白色粉末状,通过高效毛细管电泳测得玉米花粉多糖主要是由葡萄糖、阿拉伯糖及半乳糖组成的。玉米花粉多糖组分PMCT 经过Sepharose CL-6B 凝胶柱层析,硫酸苯酚法检测,得到了3 个峰组分,按出峰顺序分别命名为PMCT1、PMCT2、PMCT3。其中PMCT2 经Sephadex G-150 凝胶柱层析检测为单一对称峰,分子量为4.88×104 。利用氯磺酸-吡啶法对玉米花粉多糖组分PMCS 进行了硫酸酯化改性,得硫酸酯化多糖S-PMCS,硫酸基质量分数为12.8%,取代度为0.948。红外光谱显示在波数1262.50cm-1和822.78cm-1处出现硫酸酯键的特征吸收峰,表明玉米花粉多糖PMCS 已成功的被硫酸酯化。利用分光光度法测定不同级分玉米花粉多糖的羟基清除能力,结果显示各多糖均表现出一定的抗氧化能力,其中PMAS、PMBS的清除效果最佳。Sevag 法去蛋白的多糖的清除羟自由基效果大多比三氯醋酸法去蛋白的多糖清除效果要高。利用细胞培养技术研究多糖样品进行抗肿瘤活性。首先用多糖

关键词：多糖玉米花粉纯化多糖硫酸酯化抗肿瘤

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