松花粉硫酸酯化多糖对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用

作     者：邢丽 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：耿越

授予年度：2015年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：松花粉 多糖 酯化多糖 小鼠巨噬细胞 [Ca2+]i 细胞因子 

摘      要：本实验室先前采用马尾松花粉粗多糖硫酸酯化多糖（SPPM60）作用与小鼠脾脏混悬细胞，结果发现SPPM60能显著促进脾脏混悬细胞内自由钙离子浓度的升高。由于脾脏淋巴细胞中富含T、B淋巴细胞，为了进一步探究松花粉多糖及其酯化多糖对于脾脏淋巴细胞具体作用机制，本实验室分别从脾脏中分离出了T、B淋巴细胞研究了松花粉多糖及其酯化多糖对其免疫调节作用，实验证实了马尾松花粉酯化多糖对于T、B淋巴细胞都具有显著的激活作用，均促进了T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖以及T淋巴细胞B淋巴细胞胞内钙离子浓度的升高。同时还通过实验验证了其中一条SPPM60作用于淋巴细胞引起胞内钙离子浓度升高的可能的胞内钙离子信号通路：SPPM60→Receptor→PI3K→PLC→IP3→IP3R→CRAC，其中Toll样受体4是硫酸酯化多糖作用于B淋巴细胞的主要多糖受体。 一、采用热水浸提提取松花粉粗多糖，进一步用三氯乙酸法除去其中的蛋白质成分以后再分别用20%、40%、60%、80%的乙醇对粗多糖组分进行依次沉淀。选取60%乙醇沉淀的多糖组分经过聚丙烯酰胺凝胶柱层析对其进行分离纯化，直至最终得到一种较均一的组分，将其命名为PPM60-D。称取14.87mg PPM60-D，采用氯磺酸-吡啶法对其进行硫酸酯化，最终得到硫酸酯化多糖SPPM60-D18.57mg，氯化钡-明胶比浊法测定硫酸酯化多糖的取代度为1.87。红外光谱分析硫酸酯化多糖中有S=O和C-O-S的特征吸收峰，表明PPM60-D硫酸酯化成功。 二、采用腹腔灌洗法提取小鼠腹腔巨噬细胞，用MTT法检测PPM60-D和SPPM60-D在不同作用浓度下对小鼠腹腔巨噬细胞相对活性的影响。结果发现800μg/mL的SPPM60-D能明显增强小鼠腹腔巨噬细胞的相对活性，而PPM60-D对小鼠腹腔巨噬细胞的作用相对较弱。用MTT法检测PPM60-D和SPPM60-D在不同浓度下对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响。结果发现800μg/mL的SPPM60-D能显著增强小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖能力，而PPM60-D对小鼠巨噬细胞RAW264.7的促增殖作用效果相对较弱。 三、用双波长荧光分光光度计检测800μg/mL SPPM60-D处理的巨噬细胞RAW264.7后[Ca2+]i的变化情况。800μg/mL SPPM60-D显著的提高了巨噬细胞RAW264.7胞内自由钙离子浓度。采用抑制剂处理钙离子通路中的几个关键蛋白后发现2-APB、U73122和TAK-242较大程度地抑制SPPM60-D引起的巨噬细胞RAW264.7胞内自由钙离子浓度的升高，LY294002和Verapamil能部分抑制SPPM60-D引起的巨噬细胞RAW264.7胞内自由钙离子浓度的升高，低分子肝素钠可以完全抑制SPPM60-D所引起的巨噬细胞RAW264.7胞内自由钙离子浓度的升高，并且会使其低于空白对照组胞内自由钙离子浓度。 四、通过检测小鼠巨噬细胞粘附迁移能力、吞噬能力、分泌的主要的细胞因子（TNF α、IL-1、IL-6）及重要炎症介质（NO、NO合酶）的情况来探究PPM60-D及SPPM60-D对巨噬细胞的免疫调节能力。同时结合小鼠巨噬细胞表面的主要多糖受体TLR4的抑制剂（TAK-242），探究Toll样受体4（TLR4）在多糖作用于巨噬细胞中的作用。实验结果表明，SPPM60-D能显著的促进小鼠巨噬细胞分泌重要的炎症介质和主要细胞因子，而且作用效果比阳性对照（LPS）要强。PPM60-D也有一定程度的促进作用但是作用效果不是很明显。用TLR4的抑制剂TAK242作用后，发现明显抑制了SPPM60-D的作用效果，抑制效果达到了50%左右，说明硫酸酯化多糖主要是通过TLR4作用于巨噬细胞的。 五、检测PPM60-D及SPPM60-D对免疫抑制型巨噬细胞RAW264.7的免疫活性的影响，实验结果表明SPPM60-D有效的恢复了免疫抑制型的巨噬细胞的免疫活性：细胞的吞噬能力增强，分泌细胞因子(IL-1、IL-6、TNF α)的水平上升、NO合成增多，而PPM60-D的作用效果甚微。