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作者：邢荣荣山西医科大学

学位级别：硕士

目的:微萃取技术是近年迅速发展起来的一种新的样品前处理技术,主要包括液相微萃取(liquid phase microextraction,LPME)和固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)。该技术操作简单,成本低廉,富集倍数(enrichment factor,EF)高,... 详细信息

目的:微萃取技术是近年迅速发展起来的一种新的样品前处理技术,主要包括液相微萃取(liquid phase microextraction,LPME)和固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)。该技术操作简单,成本低廉,富集倍数(enrichment factor,EF)高,无需特殊仪器设备,有机溶剂用量少,甚至无需有机溶剂。在课题组多年对复杂样品的提取、分离与富集研究的基础上,本论文提出和建立了微孔膜/溶剂微萃取(microporous membrane/solvent microextraction,MPMSME)、微孔膜/石墨烯/溶剂协同微萃取(microporous membrane/graphene/solvent synergistic microextraction,MPMGSSME)和中空纤维/石墨烯棒便携式取样器(hollow fiber/graphene bar portable sampler,HF/GBPS)3种新型微萃取技术,并且成功应用于复杂样品中微量目标化合物的分离、浓缩和富集。方法:论文第一部分中,将附着有萃取溶剂或石墨烯/萃取溶剂分散液的微孔滤膜作为萃取平台,咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸作为模型化合物,我们提出和建立了MPMSME和MPMGSSME样品前处理技术。通过条件优化和方法学的研究,MPMSME和MPMGSSME结合高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对中药白附子中目标分析物咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸进行分离、浓缩和测定,同时对目标分析物的EF进行了定义和推导,并对MPMSME和MPMGSSME的萃取机理进行了分析和讨论。论文第二部分中,将固定有中空纤维/石墨烯棒(hollow fiber/graphene bar,HF/GB)的手持电动打蛋器制备成便携式现场取样器HF/GBPS,能够直接插入环境水样中进行现场取样和样品制备。我们在实验室对石墨烯的种类和含量、萃取时间和解吸时间等影响因素进行了考察和优化。同时对HF/GB的超微结构进行了表征,并对HF/GBPS的萃取机理进行了分析和讨论。利用HF/GBPS结合HPLC进行现场取样、浓缩和分析测定环境水样中4种微量硝基苯类化合物(硝基苯,邻硝基苯酚,间硝基苯酚,对硝基苯酚)。结果:实验结果表明:(1)MPMSME和MPMGSSME技术具有材料易得,价格便宜,操作简单,萃取表面大,有机溶剂用量少等优点;(2)微孔膜不仅作为萃取溶剂或石墨烯/萃取溶剂分散液的载体,还具有SPME作用,对目标分析物进行萃取和浓缩;(3)在MPMGSSME中,石墨烯具有巨大的比表面积和很强的吸附能力,因此,比MPMSME对目标分析物的EF更高;(4)与其他现场技术相比,HF/GBPS具有制备简单、携带方便,取样时间短等优点,可以实现随时随地进行取样和样品制备。结论:总之,MPMSME、MPMGSSME和HF/GBPS具有操作简单、成本低廉,环境友好,EF高等优点,而且他们已经成功应用于复杂样品中微量目标化合物的萃取、浓缩和测定。MPMSME,MPMGSSME和HF/GBPS的建立和应用无疑是对现代样品前处理技术的丰富和发展。

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HPLC法测定人血样中三种药物的浓度及其人体药代动力学和生物等效性的研究

HPLC法测定人血样中三种药物的浓度及其人体药代动力学和生物等效...

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作者：彭芳辰山西医科大学

学位级别：硕士

目的：建立以高效液相色谱法测定人血清中氢溴酸右美沙芬浓度的方法。研究氢溴酸右美沙芬在人体内的药代动力学,用泰诺酚麻美敏口服液对酚麻美敏滴剂进行生物等效性评价。方法：色谱柱为HiQsil C18（4.6mmm×150mmm,5μm）,流动相... 详细信息

目的：建立以高效液相色谱法测定人血清中氢溴酸右美沙芬浓度的方法。研究氢溴酸右美沙芬在人体内的药代动力学,用泰诺酚麻美敏口服液对酚麻美敏滴剂进行生物等效性评价。方法：色谱柱为HiQsil C18（4.6mmm×150mmm,5μm）,流动相为乙腈-水-乙酸（35：63：2,V/V/V）,荧光检测激发波长和发射波长分别为280、320nm,内标为卡维地洛。结果：氢溴酸右美沙芬检测浓度的线性范围为0.27-21.90ng/ml,回归方程为Y=Y=0.1334X-0.0329（r=0.9995,n=7）;血清中回收率较高。20名健康受试者随机交叉口服受试制剂17m1和参比制剂20m1（均含氢溴酸右美沙芬20mg）后,用HPLC法测定人血清中氢溴酸右美沙芬浓度,并用后者进行生物等效性评价。受试制剂的消除半衰期t1/2为：（20.61±13.44）h,峰时间和峰浓度分别为（1.75±0.47）h和（7.59±7.27）ng/ml;参比制剂的消除半衰期t1/2为：（19.26±9.69）h,峰时间和峰浓度分别为（1.7±0.57）h和（7.06±5.75）ng/ml。结论：本方法准确、快速、简便,可用于人血清中氢溴酸右美沙芬浓度的测定;以氢溴酸右美沙芬估算受试制剂的相对生物利用度为100.11±29.49%,经方差分析及双单侧t检验表明两制剂生物等效。目的：建立人血浆中麦考酚酸酯活性代谢物麦考酚酸的HPLC测定法。方法：色谱柱为HYPERSILC18（150 mm×5.0mm,5μm）,预柱为岛津ODS（5.0mm×3.9 mm,10μmm）。流动相为甲醇-磷酸二氢钠缓冲液（pH=3.25）-乙腈（40：40：20,V/V/V）,流速0.8 mL/min,检测波长254nm,柱温25℃。结果：麦考酚酸的血浆样品为0.12-46.13mg/L时线性良好（r=0.9997）。方法回收率96%-106%,日内RSD＜6%,日间RSD＜7%。结论：本方法简单、灵敏、重现性好,可用于临床血药浓度监测,以及人体药代动力学的研究。目的：建立HPLC法测定人血清中万古霉素的浓度。方法：色谱柱为HYPERSIL C18-ODS柱,流动相为甲醇-磷酸二氢钾缓冲液（pH3.2）=15：85,流速1.0mL/min,紫外检测波长236 nm;去甲万古霉素为内标。结果：血清万古霉素在1.25-100 mg/L内线性良好,回归方程Y=0.0277X-0.0596,（n=8,r=0.9993）,日内和日间精密度RSD＜10%。结论：该测定方法可靠,可用于临床血清万古霉素的浓度监测。

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产质粒介导AmpCβ-内酰胺酶阴沟肠杆菌基因型及耐药性研究

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作者：张瑞琴山西医科大学

学位级别：硕士

目的:了解医院感染的阴沟肠杆菌产AmpC酶的发生情况、质粒介导AmpC酶基因型的分布、分析阴沟肠杆菌产酶与不产酶的耐药情况,进行本课题的研究。给临床防控感染、合理用抗生素提供科学依据。方法:选取161株阴沟肠杆菌采用K-B法以头孢西... 详细信息

目的:了解医院感染的阴沟肠杆菌产AmpC酶的发生情况、质粒介导AmpC酶基因型的分布、分析阴沟肠杆菌产酶与不产酶的耐药情况,进行本课题的研究。给临床防控感染、合理用抗生素提供科学依据。方法:选取161株阴沟肠杆菌采用K-B法以头孢西丁纸片初筛疑产AmpC酶菌株;对疑产株通过AmpC酶提取物做头孢西丁三维试验检测AmpC酶;对产AmpC酶菌株的酶提取物进行头孢曲松三维试验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）。使用B型质粒小样快速提取试剂盒进行质粒的提取;采用提取出的质粒作为PCR的模板进行扩增;采用琼脂糖凝胶,电压80V电泳30min后凝胶成像仪下分析基因型。采用纸片扩散（K-B）法,按美国临床实验室标准化委员会（NCCLs）2005制定的标准,进行药敏纸片的选择和药敏试验结果判读;所有原始数据用WHO细菌耐药性监测网提供WHONET5.4软件进行统计分析;计数资料分析采用SPSS统计软件进行分析。结果:在所检测的161株阴沟肠杆菌中,产AmpC酶的阴沟肠杆菌共46株,总检出率为28.6%,其中单产AmpC酶菌株38株,检出率为23.6%,同时产AmpC酶和ESBLs菌株8株,检出率为4.9%。对46株三维试验阳性的阴沟肠杆菌进行质粒提取试验和5组质粒介导AmpC酶的PCR检测,共有15株为质粒介导的AmpC酶,基因型为单产ACT-1型、单产DHA-1型和同时产ACI-1和DHA-1型;经质粒接合传递实验有12株传递成功。本研究发现检测到的15株质粒介导产AmpC酶阴沟肠杆菌,表现了对头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦和亚胺培南较敏感,对所监测的其它抗生素耐药率较高;同产AmpC酶+ESBLs的阴沟肠杆菌只对头孢哌酮/舒巴坦和亚胺培南较敏感;x检验显示不产AmpC酶的菌株和产AmpC酶的菌株对所监测大多数抗生素耐药率的差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:三维试验可作为实验室用来鉴别常见临床分离革兰阴性杆菌耐药株是否产AmpC酶、ESBLs的的筛选方法。感染产AmpC酶阴沟肠杆菌中以染色体介导为主,多数为单产AmpC酶细菌,分离到质粒介导的AmpC酶为单产ACT-1型、单产DHA-1和同产ACT-1和DHA-1型基因型。对产AmpC酶细菌感染,碳青霉烯类药物和头孢哌酮/舒巴坦可作为经验用药,而第四代头孢菌素（如:头孢吡肟）,对同产ESBLs的菌株耐药性较高,经验用药时应根据药敏结果选择性应用,亦可根据药敏结果选用氟喹诺酮类或氨基糖苷类抗生素。

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基于中空纤维液相微萃取的莨菪碱含量测定、构象确定及与蛋白作用研究

基于中空纤维液相微萃取的莨菪碱含量测定、构象确定及与蛋白作用...

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作者：席国臣山西医科大学

学位级别：硕士

第一部分基于中空纤维液相微萃取的4种莨菪碱活性成分含量测定及优势构象确定目的：以氢溴酸山莨菪碱、硫酸阿托品、氢溴酸东莨菪碱、丁溴酸东莨菪碱为模型化合物优化液相微萃取前处理条件,建立莨菪碱的液相微萃取一高效液相色谱含量测... 详细信息

第一部分基于中空纤维液相微萃取的4种莨菪碱活性成分含量测定及优势构象确定目的：以氢溴酸山莨菪碱、硫酸阿托品、氢溴酸东莨菪碱、丁溴酸东莨菪碱为模型化合物优化液相微萃取前处理条件,建立莨菪碱的液相微萃取一高效液相色谱含量测定方法;为复杂样品的分离、纯化和浓缩提供一种有效、简便、环境友好的样品前处理方法,讨论模型化合物的萃取规律及萃取机理;利用协同液相微萃取方法初步探讨氢溴酸山莨菪碱、硫酸阿托品、氢溴酸东莨菪碱和丁溴酸东莨菪碱的优势构象;探讨中空纤维与莨菪碱形成电荷转移超分子对萃取效果的影响以及4种莨菪碱结构中N原子的亲电能力。方法：利用简易液相微萃取装置,优化被分析物的液相微萃取条件,包括溶剂载体中空纤维的种类、萃取溶剂、供相与接受相、搅拌速度和萃取时间。模型化合物在优化的液相微萃取条件下被萃取后,收集接受相进入高效液相色谱仪进行分析。模型化合物氢溴酸山莨菪碱、硫酸阿托品、氢溴酸东莨菪碱、丁溴酸东莨菪碱的优化液相微萃取条件：聚丙烯纤维作溶剂载体,二甲苯：正庚醇(7：3)混合溶剂作萃取溶剂,10-3 mol／L氨水样品溶液为供相,5×10-3 mol／L盐酸溶液为接受相,搅拌速度为1800r／min,萃取时间为100min;色谱条件为：C18柱,流动相为甲醇：水(含0.04mol／L醋酸钠,0.015%冰醋酸,0.02%三乙胺)为35：65,流速0.8 ml／min,柱温30℃,检测波长215nm。结果：氢溴酸山莨菪碱、硫酸阿托品、氢溴酸东莨菪碱、丁溴酸东莨菪碱分别在0.05μg／ml～5μg／ml,5ug/ml～25μg/ml范围内呈线性,相关系数大于0.99,精密度小于7%,消旋山莨菪片和颠茄片平均回收率分别为95%～119%和93%～95%,氢溴酸山莨菪碱和丁溴酸东莨菪碱检测限为0.03μg／ml,硫酸阿托品和氢溴酸东莨菪碱检测限为0.01μg／ml,消旋山莨菪片中山莨菪碱含量为4.9mg/片,颠茄片中山莨菪碱含量为20.3μg/片,阿托品含量为72.8μg/片,东莨菪碱含量为2.1μg/片。结论：该方法能有效去除制剂中杂质的干扰,提高了选择性,进而测定制剂中的化合物,纯化和浓缩效果好,有机溶剂消耗少,是一种快速、有效、环境友好的成分分析前处理方法。第二部分液相微萃取在硫酸阿托品和氢溴酸东茛菪碱蛋白结合参数测定中的应用目的：建立中空纤维液相微萃取(HF-LPME)-高效液相色谱法(HPLC)测定硫酸阿托品和氢溴酸东莨菪碱蛋白结合率及蛋白结合参数的方法。方法：以聚丙烯为中空纤维,正庚醇：二甲苯(30：70)混合溶剂为萃取溶剂,pH7.4的磷酸盐缓冲样品溶液为供相,5×10-2mol／L盐酸溶液为接受相,在数控保温箱37℃静置5个小时进行微萃取,然后通过HPLC测定药物与蛋白结合后游离的浓度,进而计算出药物蛋白结合率,并利用Klotz方程,得到药物与BSA的结合常数和结合位点数。结果：硫酸阿托品和氢溴酸东莨菪碱均在1～25μg／mL范围内线性关系良好,r>0.99。硫酸阿托品和氢溴酸东莨菪碱蛋白结合率范围分别为17%～30%,11%～34%,与BSA的结合常数分别为：2899.1、626.1,结合位点数分别为：0.3、0.6。结论：该方法简便易行,能够有效测定硫酸阿托品和氢溴酸东莨菪碱蛋白结合率及蛋白结合参数。

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中空纤维细胞捕获及盐包油中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法研究紫草承气汤中的主要抗癌活性成分

中空纤维细胞捕获及盐包油中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法研...

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作者：李苗苗山西医科大学

学位级别：硕士

目的:建立人肝癌HepG-2、肾癌ACHN和宫颈癌He La细胞的中空纤维细胞捕获-高效液相色谱法(Hollow fiber cell fishing-high performance liquid chromatography,HFCF-HPLC),并利用该法筛选和鉴定紫草承气汤在体内外的主要抗癌活性成分;... 详细信息

目的:建立人肝癌HepG-2、肾癌ACHN和宫颈癌He La细胞的中空纤维细胞捕获-高效液相色谱法(Hollow fiber cell fishing-high performance liquid chromatography,HFCF-HPLC),并利用该法筛选和鉴定紫草承气汤在体内外的主要抗癌活性成分;提出一种新型的盐包油中空纤维液相微萃取方法(oil-in-salt hollow fiber liquid phase microextraction,oil-in-salt HF-LPME),并对该法的的机理进行分析讨论,利用该法对紫草承气汤在体内外筛选出的主要活性成分的含量以及总蛋白结合率进行测定。初步寻找紫草承气汤中真正抗癌的活性成分,验证中药多成分和多靶点的特点,为阐明中药紫草承气汤的抗肿瘤药效物质奠定基础。方法:(1)将接种人肝癌HepG-2细胞、肾癌ACHN细胞和人宫颈癌He La细胞中空纤维分别插入到紫草承气汤及其单药的提取液中,对其体外主要活性成分进行筛选,并利用HPLC进行鉴定,接着将紫草承气汤口服灌胃给大鼠,取大鼠的血浆及肝、肾组织,将接种癌细胞的中空纤维对其进行筛选,明确进入体内后的主要活性成分,初步比较和探讨活性成分与不同癌细胞的结合能力;(2)利用充满有机溶剂且覆盖盐膜的中空纤维作为萃取平台,在进行条件优化和方法学研究的基础上,提出并建立了oil-in-salt HF-LPME,利用该方法并结合HPLC对紫草承气汤在体内外的活性成分进行富集、浓缩以及含量和总蛋白结合率测定。同时,与传统HF-LPME方法进行对比研究,并在此基础上分析和阐述了oil-in-salt HF-LPME的萃取机理。通过对紫草承气汤在体内外主要活性成分的定性、定量研究,为阐明紫草承气汤中抗肿瘤药效物质研究奠定了基础。结果:本文通过HFCF和oil-in-salt HF-LPME结合HPLC对紫草承气汤中主要抗癌活性成分进行研究,可以得出:(1)体外主要筛选鉴定出橙皮苷(48.62μg/g),厚朴酚(3.09μg/g),和厚朴酚(6.87μg/g),紫草素(0.34μg/g),大黄素(1.28μg/g)和β,β’-二甲基丙烯酰紫草素(0.38μg/g)等主要活性成分,这些活性成分均可定量;(2)紫草承气汤口服灌胃给大鼠后,体外筛选出的6种活性成分均能吸收入血,测得血浆中橙皮苷,厚朴酚,和厚朴酚,紫草素,大黄素和β,β’-二甲基丙烯酰紫草素的浓度分别是0.45、0.40、0.74、0.48、0.11和1.11μg/m L,血浆中大黄素、橙皮苷和β,β’-二甲基丙烯酰紫草素对HepG-2、ACHN和He La细胞均有作用,紫草素对HepG-2和He La细胞有作用,而和厚朴酚仅作用于ACHN细胞;(3)橙皮苷和大黄素可到达肝脏组织,作用于HepG-2细胞;橙皮苷、紫草素和大黄素可到达肾脏,作用于ACHN细胞;(4)六种活性成分的总血浆蛋白结合率分别为:橙皮苷42.0%,厚朴酚71.8%,紫草素64.6%,厚朴酚77.7%,大黄素75.3%,β,β’-二甲基丙烯酰紫草素75.7%;(5)oil-in-salt HF-LPME,能显著提高目标分析物的EF。其机理可能是当盐覆盖在有机溶剂表面形成了盐包油膜,使萃取溶剂周围的盐浓度更高,盐与溶剂之间的距离更近和围绕目标分析物形成的水化膜程度更低,借此显著改善对目标分析物浓缩和富集的微环境。结论:HFCF和oil-in-salt HF-LPME偶合HPLC法成功应用于紫草承气汤中抗癌活性成分的筛选、定性和含量测定。研究得出紫草承气汤对HepG-2、ACHN和He La细胞均有抑制作用,作用能力与其在紫草承气汤中的含量和在血浆中浓度分布无关。Oil-in-salt HF-LPME与传统HF-LPME相比,oil-in-salt HF-LPME富集倍数高,萃取效果更佳。总之HFCF和oil-in-salt HF-LPME偶合HPLC法可用来研究中药中抗癌生物活性成分,并为研究中药抗癌活性的药效物质基础提供一个新思路和新方法。

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分散液相微萃取对复杂样品中蒽醌类化合物的浓缩、富集及色谱分析

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作者：田杰山西医科大学

学位级别：硕士

第一部分中药材组分有机溶剂和离子液体分散液相微萃取方法比较及机理探讨本文研究了离子液体分散液相微萃取（ionic liquid based dispersive liquid phase microextraction, ILDLPME）机理;比较了ILDLPME和有机溶剂分散液... 详细信息

第一部分中药材组分有机溶剂和离子液体分散液相微萃取方法比较及机理探讨本文研究了离子液体分散液相微萃取（ionic liquid based dispersive liquid phase microextraction, ILDLPME）机理;比较了ILDLPME和有机溶剂分散液相微萃取（organic solvent based dispersive liquid phase microextraction,OSDLPME）在测定蒽醌类化合物应用中的异同;建立了分散液相微萃取-高效液相色谱法测定药材中6种游离蒽醌类化合物（芦荟大黄素、大黄酸、丹蒽醌、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）含量的方法。在优化的实验条件下,OSDLPME和ILDLPME对6种分析物的富集倍数分别在101～230倍和在76～181倍之间;结合HPLC测定6种分析物检测限分别在20～***-1和40～***-1之间;精密度（RSD）分别在3.1%～10.0%和1.3%～7.0%之间;4种中药材中分析物的回收率在81.7%～110.7%和81.9%～110.8%之间。离子液体在水中分散的同时进行有序排列,形成分子有序组合体,对分析物进行萃取。ILDLPME达平衡时间更快,精密度更高,方法更简便;OSDLPME浓缩倍数更高,检测限更低;两种方法对中药样品中游离蒽醌类化合物含量测定结果无显著性差异。第二部分有机溶剂与离子液体分散液相微萃取高效液相色谱法分析大黄素及其代谢物的方法比较本文对有机溶剂分散液相微萃取（OS-DLLME）和离子液体分散液相微萃取（IL-DLLME）高效液相色谱法用于大黄素及其代谢物（芦荟大黄素,蒽醌-2-羧酸,大黄酸,丹蒽醌,大黄酚和大黄素甲醚）的分析进行了深入的比较。对萃取剂种类,分散剂种类,萃取剂量,分散剂量,pH,离子强度,萃取时间,离心转速,离心时间等影响分散液相微萃取法回收率的因素进行了优化。在优化的实验条件下,OS-DLLME和IL-DLLME法对于大黄素及其代谢物的富集倍数分别为90-295和63-192;检测限分别为70～400 pg/ml和100～600pg/ml;OS-DLLME的日内和日间精密度的相对标准偏差低于7.2%和8.7%,IL-DLLME的日内和日间精密度的相对标准偏差低于5.7%和6.4%;OS-DLLME对大黄素及其代谢物的回收率为87.1%～108%,IL-DLLME对大黄素及其代谢物的回收率为87.5%～106%。相比较而言,IL-DLLME更加方便、低毒而且重现性好,但是OS-DLLME法富集倍数高,灵敏度好。进行统计学分析发现两种方法用于尿样中大黄素及其代谢物的分析没有差异。芦荟大黄素,大黄酸,大黄酚和大黄素甲醚作为大黄素的代谢物,通过与标准品的色谱保留时间对照进行了鉴别;通过HPLC/MS鉴别,发现了大黄素的新代谢物蒽醌-2-羧酸和丹蒽醌。

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中空纤维细胞捕获和液/固微萃取法及其对姜黄素类活性成分的研究

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作者：王彩云山西医科大学

学位级别：硕士

目的:建立中空纤维细胞捕获-高效液相色谱法(hollow fibre cell fishing with high performance liquid chromatography,HFCF-HPLC)、中空纤维液/固微萃取-高效液相色谱法(Hollow fibre liquid/solid phase microextraction with HPLC,H... 详细信息

目的:建立中空纤维细胞捕获-高效液相色谱法(hollow fibre cell fishing with high performance liquid chromatography,HFCF-HPLC)、中空纤维液/固微萃取-高效液相色谱法(Hollow fibre liquid/solid phase microextraction with HPLC,HFL/SME-HPLC)和磁力搅拌子液/固微萃取-高效液相色谱法(Stirrer-liquid/solid microextraction with HPLC,Stirrer-L/SME-HPLC),并利用这3种方法研究姜黄、郁金、莪术中姜黄素类活性成分,同时对HFL/SME和Stirrer-L/SME的萃取机理进行了分析和讨论。方法:对中空纤维内壁种植肝癌细胞HepG-2,卵巢癌细胞SKOV-3和肾癌细胞ACHN的生长状态、细胞种植时间、甲醇浓度对细胞存活率的影响、纤维活性中心或培养液对筛选结果的影响、阳性和阴性对照、筛选活性成分保留时间和相对峰面积的重现性等进行考察和优化。在最佳HFCF-HPLC条件下,将种植3种癌细胞、填充3种癌细胞的细胞膜、细胞器以及相关的磷脂酶C受体的中空纤维,结合HPLC,对姜黄、郁金、莪术提取液中的姜黄素类化合物进行筛选和鉴定,探讨姜黄素类活性成分在癌细胞上的结合部位以及其与作用靶点。对影响HFL/SME或Stirrer-L/SME偶合HPLC的萃取溶剂、样品相的pH、盐浓度、萃取时间、搅拌速度和样品相体积等因素进行条件优化,对两种方法的线性范围等进行方法学考察。在最佳的HFL/SME-HPLC或Stirrer-L/SME-HPLC条件下,以姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素作为模型化合物,利用HFL/SME或Stirrer-L/SME结合HPLC对3种中药中筛选出的姜黄素类活性成分进行分离、富集和测定。结果:实验结果表明:(1)通过与对照品的保留时间比对,初步确定筛选出的姜黄素类活性成分是姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素;(2)细胞与活性成分间的结合能力与化合物在中药中的含量无关,微量姜黄素类活性化合物可能有较强的抗癌活性,中药抗癌机制有多成分、多靶点的作用特点;(3)姜黄素类活性成分可作用在癌细胞的膜和器上,可作为磷脂酶C的抑制剂;(4)HFL/SME和Stirrer-L/SME的萃取机制是纤维壁孔或搅拌子通过与目标分析物形成电荷转移超分子的吸附以及有机溶剂的萃取的共同作用;(5)HFL/SME和Stirrer-L/SME操作简单、快速、富集倍数高、无需任何特殊装备。结论:HFCF-HPLC与HFL/SME或Stirrer-L/SME结合可以对姜黄、郁金、莪术中微量姜黄素类抗癌活性成分、作用靶点及其含量进行研究,验证中药多成分、多靶点的作用特点,为阐明了中药的药效物质基础,建立中药个性化的活性成分质量标准提供科学依据和试验方法。另外HFL/SME和Stirrer-L/SME是两种简单、快速、浓缩倍数高、环境友好的新型样品前处理技术。

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中空纤维细胞捕获和中空纤维液相微萃取—高效液相色谱法研究半枝莲中黄酮类和酚酸类的抗癌活性

中空纤维细胞捕获和中空纤维液相微萃取—高效液相色谱法研究半枝...

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作者：冯美琴山西医科大学

学位级别：硕士

目的:建立中空纤维细胞捕获-高效液相色谱法(Hollow fibre cell fishing with high performance liquid chromatography,HFCF-HPLC)及中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法(Hollow fibre liquid phase microextraction with HPLC,HFLPME-H... 详细信息

目的:建立中空纤维细胞捕获-高效液相色谱法(Hollow fibre cell fishing with high performance liquid chromatography,HFCF-HPLC)及中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法(Hollow fibre liquid phase microextraction with HPLC,HFLPME-HPLC);将HFCF-HPLC和HFLPME-HPLC结合研究半枝莲中黄酮类和酚酸类在体外的抗肾癌活性和灯盏花素注射液中野黄芩苷(含量>85%,半枝莲的主要活性成分)及其代谢物野黄芩素在体内的抗肝癌、肾癌活性。方法:将种植有人肾癌ACHN细胞或充满ACHN细胞膜和细胞器混悬液的中空纤维插入到半枝莲醇提或者水提液中,筛选和鉴定半枝莲中的抗肾癌黄酮类活性成分野黄芩苷、黄芩苷、木犀草素、芹菜素、汉黄芩素等和酚酸类活性成分原儿茶酸等,并结合HPLC,确定它们的结构,研究它们与ACHN细胞的结合能力及结合部位,探讨它们与靶点的作用特点。将内腔充满辛醇的中空纤维插入到半枝莲水提液中,萃取、富集和浓缩半枝莲中筛选出的黄酮类和酚酸类活性成分,并结合HPLC,测定这些活性成分的含量。将灯盏花素注射液给大鼠腹腔注射一定时间后,取血浆、尿液、肝和肾脏样品,将种植人肾癌ACHN细胞、人肝癌HepG-2细胞和内腔充满辛醇的中空纤维分别置血浆、尿液和肝肾脏匀浆样品中,研究灯盏花素中野黄芩苷及其代谢物野黄芩素的血药浓度、到达靶点后与相应靶细胞ACHN或HepG-2的结合能力、组织浓度分布和药代动力学,进一步研究野黄芩苷及其代谢物野黄芩素的抗肝癌、肾癌活性。结果:在本实验的条件下,通过HFCF-HPLC对半枝莲中黄酮类和酚酸类抗癌活性成分研究可知:(1)半枝莲可以明显诱导ACHN细胞凋亡,尤其是早凋。(2)经过与对照品的保留时间比对,半枝莲中筛选出并能确定结构的活性成分有:野黄芩苷、黄芩苷、木犀草素、芹菜素、汉黄芩素和原儿茶酸;未能确定结构,但与癌细胞结合能力强的活性成分有X1、X2、X3和X4。(3)原儿茶酸、野黄芩苷、木犀草素、汉黄芩素的含量分别为3.3、4.1、0.27、0.22 mg/g,但是黄芩苷和芹菜素的含量低于检测限。(4)腹腔注射灯盏花素注射液12 min后,在大鼠血浆中可筛选到野黄芩苷及其代谢物野黄芩素;野黄芩苷与ACHN和HepG-2细胞的结合能力较强,野黄芩素与它们的结合能力较弱;在相应的组织样品中野黄芩苷比野黄芩素与ACHN细胞的结合能力强,二者对HepG-2细胞的影响较弱。(5)野黄芩苷和野黄芩素的药时曲线均出现双峰,分别在0.25和0.5 h达峰,峰浓度Cmaxs分别为2.23和2.57μg/mL,消除半衰期t1/2βs分别为20.87±1.26 h和11.60±1.28 h,总生物利用度AUC0-∞分别为31.22和26.25 mg/(L×h)。结论:本文结合HFCF-HPLC和HFLPME-HPLC研究半枝莲中微量黄酮类和酚酸类以及灯盏花素中野黄芩苷及其代谢物野黄芩素的抗癌活性,可以得出(1)半枝莲中微量黄酮类和酚酸类成分具有潜在的抗肾癌活性,超微量成分的抗癌活性更强。因此,黄酮类和酚酸类的抗肾癌活性与其在半枝莲中的含量无关。(2)大鼠腹腔注射灯盏花素注射液后,其主要成分野黄芩苷能迅速被吸收并部分代谢为野黄芩素,二者迅速到达靶器官肝和肾,对相应HepG-2细胞和ACHN细胞进行干预,并维持一定的浓度。但值得一提的是,本研究只探讨了半枝莲或灯盏花素注射液中主要成分的抗癌活性,并不是所有成分或代谢物的活性,所以半枝莲或灯盏花素注射液中所有成分及代谢物的共存可能导致活性累积或协同作用。本文的研究结果为半枝莲或灯盏花素注射液的抗癌活性及其药效物质基础研究提供了实验基础,HFCF-HPLC和HFLPME-HPLC相结合为中药活性成分的体内外研究提供了新思路和新方法。

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液相微萃取在中药呋喃香豆素成分分析及药物蛋白结合参数测定中的应用

液相微萃取在中药呋喃香豆素成分分析及药物蛋白结合参数测定中的...

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作者：张彦杰山西医科大学

学位级别：硕士

目的以4种呋喃香豆素化合物为萃取对象,探讨中空纤维液相微萃取(HFLPME)和分散液相微萃取(DLLME)两种样品前处理方法的萃取机理;并与高效液相色谱(HPLC)结合对两种萃取方式进行可行性比较。方法对HFLPME和DLLME实验条件包括中空纤维种... 详细信息

目的以4种呋喃香豆素化合物为萃取对象,探讨中空纤维液相微萃取(HFLPME)和分散液相微萃取(DLLME)两种样品前处理方法的萃取机理;并与高效液相色谱(HPLC)结合对两种萃取方式进行可行性比较。方法对HFLPME和DLLME实验条件包括中空纤维种类、萃取溶剂、溶剂体积、萃取时间、搅拌速度等进行优化,比较二者的萃取效果和萃取时间、净化、准确度和可操控性等。结果在优化的实验条件下,用HFLPME/HPLC和DLLME/HPLC对4种呋喃香豆素化合物(补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素)进行测定。富集倍数分别在12.2-18.5倍和11.6-21.6倍,检测限分别在1.2-5.0μg/L和1.0-3.0μg/L,RSD均小于6.2%。两种方法对4种呋喃香豆素化合物的萃取效果没有显著的不同。结论两种萃取方式的富集倍数、准确度和精密度均好,对弱极性化合物有良好的萃取效率等。两种萃取方式的不同在于HFLPME容易操作,比较稳定;DLLME耗时较短,无需专门的萃取材料;与HFLPME相比,DLLME萃取时间极短,适用于实验室中批处理样品;而HFLPME由于中空纤维的化学结构对化合物的选择性,使HFLPME对复杂基质样品的净化能力强;测定补骨脂素和氧化前胡素的线性范围较DLLME宽,而异欧前胡素的线性范围较之窄;HFLPME和DLLME分析中药中4种化合物的平均回收率分别在90.8%-106.5%和97.2.1%-106.1%;两种萃取方法获得较高的富集倍数,检测出了中药白芷及其制剂中微量成分补骨脂素。目的建立中空纤维液相微萃取(HFLPME)-高效液相色谱法(HPLC)测定中药中4种呋喃香豆素类化合物(补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素)在牛血清白蛋白(BSA)中的总浓度及游离药物浓度的测定方法,分别计算出了4种成分与BSA的结合率,并利用Klotz方程计算出各自的结合参数。方法利用中空纤维液相微萃取装置,分别取作为供相的样品溶液(蛋白溶液与空白溶液)于2 mL的玻璃管中,将注满接受相(正庚醇)的中空纤维管放置于样品溶液中,在转速1800rpm下萃取60min,收集接受相,高效液相色谱仪分析。结果利用中空纤维液相微萃取法直接测定4种药物的蛋白结合率,结果表明两种或以上药物与蛋白作用时,相互之间的蛋白结合率没有影响。补骨脂素、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素与蛋白的结合率分别为58%-62%,18%-21%,27%-33%和40%-48%,结果表明补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素三者的蛋白结合率均较高,而氧化前胡素的蛋白结合率较低。4种药物成分与BSA的结合常数分别为1801、212、937.3、4025M-1,结合位点数分别为1.2、1.6、0.6和0.3。结论本方法可以作为测定游离药物浓度,研究药物与蛋白结合的一种简单、快速、有效的方法。

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液相微萃取在中药齐墩果酸和熊果酸分析及其与蛋白结合中的应用研究

液相微萃取在中药齐墩果酸和熊果酸分析及其与蛋白结合中的应用研...

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作者：郝耀梅山西医科大学

学位级别：硕士

同分异构体的三萜酸化合物齐墩果酸（oleanolic acid, OA）和熊果酸（ursolic acid, UA）具有非常低的紫外吸收，且通常同时存在于同种植物中，二者的同时分离和测定不易。目的：本文利用分散液相微萃取（dispersiveliquid-liquid micro... 详细信息

同分异构体的三萜酸化合物齐墩果酸（oleanolic acid, OA）和熊果酸（ursolic acid, UA）具有非常低的紫外吸收，且通常同时存在于同种植物中，二者的同时分离和测定不易。目的：本文利用分散液相微萃取（dispersiveliquid-liquid microextraction, DLLME）结合高效液相色谱法同时萃取和测定中草药枇杷叶和白花蛇舌草中OA和UA的含量，为复杂样品中药有效成分的分离、纯化和浓缩提供一个简便、环境友好的前处理方法。方法：考察了萃取剂种类与体积、分散剂体积、供相pH、离子强度、萃取时间、供相体积、离心转速和时间等因素对DLLME的影响。结果：在优化的条件下，OA和UA得到了良好的萃取效率，富集倍数分别达到1378和933，OA和UA的线性范围分别为0.07%-30.4μg/mL，和0.08%-33.6μg/mL，相关系数均为0.9963;OA和UA的检测限均为0.02μg/mL;平均回收率范围分别在88.2%-116.2％和85.7%-108.2％之间，RSD低于8.6％。结论：该方法能同时萃取和测定白花蛇舌草和枇杷叶样品中的OA和UA，有机溶剂用量少，是一种简便、有效、环境友好的中药复杂成分分析前处理的方法。本文利用中空纤维溶剂棒微萃取（hollow fiber solvent bar microextraction,HFSBME）结合高效液相色谱法(HPLC)用于中草药中两种同分异构三萜酸化合物的浓缩和含量测定。目的：对HFSBME萃取机理进行分析讨论，将其应用于真正样品中齐墩果酸(oleanolic acid,OA)和熊果酸(ursolic acid,UA)的浓缩和含量测定。方法：对HFSBME影响因素进行了选择和优化;与几种萃取模式的萃取结果进行比较并讨论其萃取机理;对HFSBME萃取后分析物的富集倍数和萃取效率及其关系进行定义和推导。结果：在优化的条件下，利用HFSBME结合HPLC对4种中药材样品中OA和UA进行同时萃取、浓缩和含量测定。测得OA和UA富集倍数分别为141.8和47.3;线性范围分别为3.6-1820.0ng/mL和4.2-2080.0ng/mL;检测限为1.3和1.5ng/mL;平均回收率范围分别在93.2%-116.7％和83.3%-114.2％之间。结论：HFSBME结合HPLC可同时、快速的对两种同分异构三萜酸化合物进行浓缩和含量测定，且具有操作简单、快速，灵敏度高、检测限低等特点。本文将中空纤维溶剂棒微萃取（hollow fiber solvent bar microextraction，HFSBME）结合高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）用于药物蛋白结合的研究。目的与方法：HFSBME结合HPLC同时、快速地测定两种同分异构三萜酸齐墩果酸(oleanolic acid, OA)和熊果酸(ursolic acid,UA)与牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）和人血清白蛋白（human serumalbumin, HSA）的蛋白结合率，计算并获得相应的结合常数和结合位点数;尝试了药物与结直肠癌细胞HCT116的相互作用，用消炎痛进行了阳性对照实验，得出初步结论。结果：OA和UA与BSA的结合率分别为73.5%和90.9%，结合常数分别为53500和90900，结合位点数均为0.2;与HSA的结合率分别为81.1%和91.0%，结合常数分别为87400和121300，结合位点数分别为0.2和0.1。结论：HFSBME结合HPLC用于药物蛋白结合的测定，方法简单、可靠，为中草药中活性成分的筛选和药效学物质基础的阐明提供了可能的方法。

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