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作者：赵博天津医科大学

学位级别：硕士

研究发现,低脂联素血症与T2DM发展过程中的高胰岛素血症和胰岛素抵抗有关。故有学者提出,脂联素也可作为探讨患者将来发生糖尿病的一个独立因子。在牙周炎和糖尿病的发生发展机制过程中,炎症反应失调和加剧是关键,有研究报道,对伴有糖... 详细信息

研究发现,低脂联素血症与T2DM发展过程中的高胰岛素血症和胰岛素抵抗有关。故有学者提出,脂联素也可作为探讨患者将来发生糖尿病的一个独立因子。在牙周炎和糖尿病的发生发展机制过程中,炎症反应失调和加剧是关键,有研究报道,对伴有糖尿病牙周炎患者进行牙周干预治疗后,患者血清脂联素水平上升,牙周及全身状况得到改善,有可能减少糖尿病及其并发症的发生和发展。然而,糖尿病伴牙周炎患者的局部炎症状况及其参与机体胰岛素抵抗的发生发展是否均与脂联素水平变化有关,这些问题都尚未得到解决。通过动物实验,建立伴有糖尿病的牙周炎动物模型,研究脂联素与血糖水平及炎症状态是否具有相关性,为研究糖尿病与牙周炎的相关性及日益增多的糖尿病伴有牙周炎患者的临床治疗及预防提供一些理论依据。目的：通过检测健康、糖尿病及糖尿病伴牙周炎昆明系小鼠牙龈组织中脂联素基因及蛋白含量的变化,检测三组鼠的血浆中脂联素含量,探讨脂联素含量与血糖水平及牙周炎症状态是否具有相关性。方法：45只3周龄的昆明系小鼠按不同造模方式分为三组： A组对照组(15只),标准颗粒饲料喂养。 B组糖尿病组(15只)。 15只健康鼠通过四氧嘧啶(Alloxan)注射法4周建立小鼠糖尿病模型(12mg/100g体重来诱导)。 C组糖尿病+牙周炎模型(15只)。 15只健康鼠先与B组同时建糖尿病模型,糖尿病组造模成功后左、右上颌第一磨牙及第二磨牙牙颈部丝线结扎联合高糖喂养6周建立小鼠糖尿病+牙周炎模型。通过测检AB两组小鼠不同时间的血糖、空腹胰岛素水平(Fins)及胰岛素抵抗指数,并与空白对照组对比来确认小鼠糖尿病组造模成功。通过牙周组织病理组织学检查及CBCT扫描观察牙槽骨丧失程度判断小鼠糖尿病+牙周炎模型造模成功。分别取三组小鼠的牙龈组织,用RT-PCR、western blot检测牙龈组织中脂联素基因及蛋白含量的变化,并于鼠处死时取三组鼠的血浆,通过ELISA方法测量血浆中脂联素含量进行对比和统计学分析。结果： 1.本实验发现,B组造模后20天,小鼠血糖、空腹胰岛素水平(Fins)及胰岛素抵抗指数大于正常值,与空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01),小鼠糖尿病组造模成功。 2.牙龈组织病理组织学检测显示糖尿病伴牙周炎组小鼠牙龈炎症表现最明显、在单纯糖尿病组部分小鼠可见牙龈组织轻度炎症、健康组小鼠牙龈未见明显炎症;CBCT扫描结果显示糖尿病伴牙周炎组小鼠牙槽骨丧失程度最明显,糖尿病组小鼠次之,健康组小鼠未见明显骨丧失。小鼠糖尿病+牙周炎组造模成功。 ***-PCR、western blot检测小鼠牙龈组织中脂联素基因及蛋白表达水平在三组间比较均有差异,存在统计学意义(P<0.05)。在健康组表达水平最强,在糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组小鼠中表达水平依次减弱。 4. ELISA结果显示APN蛋白在健康组小鼠血浆中表达水平最强,在糖尿病组、糖尿病伴牙周炎组小鼠血浆中表达水平依次减弱;组间比较均有差异,存在统计学意义(P<0.05)。结论： 1.可通过四氧嘧啶(Alloxan)注射法有效建立小鼠糖尿病模型。可通过牙周局部结扎联合高糖喂养有效建立小鼠糖尿病伴牙周炎模型。 2.糖尿病伴牙周炎组小鼠与糖尿病组小鼠、健康组小鼠相比,牙龈炎症及骨丧失程度最明显,脂联素基因和蛋白含量在小鼠牙龈组织中表达显著降低。提示糖尿病可能通过降低脂联素水平促进牙龈局部炎症的发生、发展;与此同时,牙周炎可能协同降低脂联素水平,促进糖尿病的发展。 3.糖尿病后牙龈组织及血浆中脂联素表达降低可能是牙周炎发病及加重的重要因素之一,APN可能在糖尿病和牙周炎相互影响关系中起着一定作用,是糖尿病的保护性因子,且有一定的抗炎作用。为临床治疗和预防牙周炎提供理论依据。

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重度牙周炎患牙牙槽嵴保存术效果的CBCT评价

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作者：于洋天津医科大学

学位级别：硕士

目的通过锥形束CT(Cone beam Computer Tomography,CBCT)观察重度牙周炎患牙拔除后即刻行牙槽嵴保存术(Alveolar Ridge Preservation,ARP)对缺牙区牙槽嵴高度与宽度、缺失牙邻牙骨量以及缺牙区的骨密度和轮廓的影响,并与拔牙创自然愈合... 详细信息

目的通过锥形束CT(Cone beam Computer Tomography,CBCT)观察重度牙周炎患牙拔除后即刻行牙槽嵴保存术(Alveolar Ridge Preservation,ARP)对缺牙区牙槽嵴高度与宽度、缺失牙邻牙骨量以及缺牙区的骨密度和轮廓的影响,并与拔牙创自然愈合的位点进行比较。评价牙槽嵴保存术对不同程度骨缺损的患牙拔牙区牙槽骨骨量保存的效果。方法因重度牙周炎需要拔除的共46名患者的75颗患牙纳入研究,其中包括31颗前牙和44颗后牙。纳入标准:(1)因重度牙周炎需要拔除的患牙;探诊深度>6mm;附着丧失≥5 mm;牙槽骨吸收超过根长的1/2;后牙有Ⅱ度及以上根分叉病变;(2)至少剩余2个骨壁,骨壁的剩余高度≥3mm;(3)至少存在一颗邻牙;(4)经过牙周基础治疗,能够保持良好的口腔卫生状况。患者均同意参加实验,已签署知情同意书。排除标准:(1)年龄7mm)。实验组的患牙,采用微创拔牙技术拔除后,彻底清创,于拔牙窝内植入Bio-Oss?骨粉和Bio-Oss?Collagen,覆盖Bio-Gide?可吸收胶原膜,减张,缝合。对照组的患牙,微创拔除后,彻底清创搔刮拔牙窝,复位,缝合。运用CBCT+3D-Invivo5 dental软件进行测量。首先,测量牙齿拔除前与拔除6个月后,该牙位的近中、中央、远中三个矢状面上的牙槽骨颊、舌侧的高度,以及最高的剩余牙槽嵴顶下方1mm、4mm、7mm处的宽度。测量牙槽骨高度时,下颌患牙以下颌骨下缘的水平切线为基线,上颌患牙以上颌窦下缘或鼻窦下缘的水平切线为基线,测量颊侧或舌侧牙槽嵴顶到该切线的距离。然后,测量冠状位时该患牙的邻牙邻面的颊、舌侧和中点处釉牙骨质界(CEJ)到牙槽嵴顶的距离。最后,运用Lekholm和Zarb分类法,根据缺牙区的骨密度分为Ⅰ类骨,观察拔牙窝愈合6个月后的密度及轮廓。轮廓的评价标准为:自然饱满愈合良好者记为2分;形态略凹陷低平者记为1分;形态不规则明显凹陷者记为0分。计算出拔牙前后在不同的位置骨量发生的改变。运用软件SPSS20.0,采用独立样本t检验和卡方检验的方法对相关数据进行统计学分析。结果1.实验组的牙槽骨在垂直方向和水平方向上的吸收量低于对照组。牙槽骨高度的吸收量,在缺牙区的近中颊、近中舌和远中颊侧有统计学差异(P0.05)。***对骨轮廓与密度具有明显的影响,实验组的骨轮廓会更加平缓,并且骨质相对较好,其中影像学上显示的Ⅱ类骨明显多于对照组。不同骨缺损程度的患牙,ARP对骨轮廓与影像学上显示的密度的影响亦有显著性差异(P<0.05),B组(骨缺损较大)的患牙,行ARP后效果更加明显。结论***能够有效地保存重度牙周炎患牙缺牙区牙槽骨的高度与宽度,对于重度骨缺损的患牙效果更显著。***能够有助于恢复邻牙邻面的骨壁高度。***有助于维持缺牙区牙槽嵴顶平缓的形态,以及良好的骨密度,为进一步的修复治疗尤其是种植修复提供更好的基础条件。

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bFGF和TGF-β1对人牙龈成纤维细胞生物学活性的影响

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作者：梁妍天津医科大学

学位级别：硕士

目的：通过组织块法培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast, HGF),观察HGF体外培养的生物学特性,探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast factor, bFGF)和转化生长因子β1 (transfer growth factor-β1, TGF-β1)单独... 详细信息

目的：通过组织块法培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast, HGF),观察HGF体外培养的生物学特性,探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast factor, bFGF)和转化生长因子β1 (transfer growth factor-β1, TGF-β1)单独及联合应用对HGF增殖、I型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)及糖胺多糖(glycosaminoglyca, GAG)分泌的影响,研究bFGF和TGF-β1单独及联合应用促进牙龈组织再生的作用。方法：1.采用组织块培养法进行人牙龈成纤维细胞的原代培养。2-6代细胞用于实验,倒置相差显微镜下观察细胞形态。抗角蛋白染色及波形丝蛋白染色进行细胞来源鉴定。2.实验分组：根据实验过程中人牙龈成纤维细胞培养液成分的不同进行分组,每组设8个复孔。(1)对照组：培养液为仅含5%FBS的DMEM;(2) bFGF干预组：培养液中除含5%FBS的DMEM,还分别含有bFGF 0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml;(3)TGF-β1干预组：培养液中除含5%FBS的DMEM,还分别含有TGF-β1 0.1ng/ml、1ng/ml、lOng/ml、50ng/ml、100ng/ml。(4) bFGF联合TGF-β1干预组：优选bFGF和TGF-βl干预组中促细胞增殖最佳浓度进行联合培养。3.四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl terazolium, MTT)动态检测bFGF及TGF-β1对人牙龈成纤维细胞增殖活性的影响。酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)及阿利新蓝法分别检测细胞增殖活性最强时bFGF及TGF-β1对HGF上清液中I型胶原及糖胺多糖含量的影响。结果：1.采用组织块原代培养法成功培养出人牙龈成纤维细胞。倒置相差显微镜下观察可见,组织块接种3-7d后即有细胞从其周围游出,细胞呈长梭形,并围绕组织块呈放射状排列。传代后细胞生长迅速。经细胞来源鉴定,所培养细胞呈现抗角蛋白染色阴性,抗波形丝蛋白染色阳性,证实所培养细胞为中胚层来源的成纤维细胞。***法动态检测结果显示,接种后第3天开始bFGF和TGF-β1对HGF的增殖作用均较对照组明显(p<0.05),在第5天时两种生长因子对细胞增殖的促进作用最强。两种生长因子促HGF增殖的最佳浓度分别为10ng/ml及1ng/ml,两者的联合作用对细胞的增殖作用更明显(P<0.05)。3. ELISA法检测显示,一定浓度范围内(0.1ng/ml～100ng/ml), bFGF对于HGF的胶原合成具有抑制作用;而TGF-β1对其则有明显的促进作用。两种生长因子促细胞增殖最佳浓度联合应用时促进作用更明显(P<0.05)。4.阿利新蓝法显示,一定浓度范围内(0.1ng/ml～100ng/ml), bFGF及TGF-β1对于人牙龈成纤维细胞的糖胺多糖合成均具有促进作用,两种生长因子促细胞增殖最佳浓度联合应用时效果更明显(P＜0.05)。结论：1.采用组织块原代培养法可成功培育出人牙龈成纤维细胞;细胞传代后,生长旺盛,分裂较快,能够满足实验中所需的大量细胞。***和TGF-β1在一定浓度范围内都能促进人牙龈成纤维细胞增殖及糖胺多糖分泌,但最佳显效浓度不同;两种生长因子对于I型胶原的分泌分别具有抑制和促进作用。3.一定浓度的bFGF和TGF-β1联合应用对于人牙龈成纤维细胞增殖及细胞外糖胺多糖的分泌具有协同促进作用;对于]型胶原的分泌具有拮抗作用,促进作用占优势。

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*** LPS与胞外ATP对人牙龈成纤维细胞促炎促凋亡作用影响

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作者：王子恢天津医科大学

学位级别：硕士

目的:本文旨在阐明牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,*** LPS)与ATP调控人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)S100A8与S100A9的表达及相关机制,并初步探究ATP对HGFs活性的影响及其相关... 详细信息

目的:本文旨在阐明牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,*** LPS)与ATP调控人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)S100A8与S100A9的表达及相关机制,并初步探究ATP对HGFs活性的影响及其相关机制,为牙周炎的辅助性药物治疗提供新的靶点及方向。1.研究人相对健康与牙周炎患者牙龈组织中P2X7R(P2X receptor 7)的表达水平和分布、细胞定位及其与牙周临床指标的关系。并检测ATP刺激HGFs后P2X7R的m RNA和蛋白表达水平及其亚细胞定位。2.检测*** LPS与ATP刺激HGFs后S100A8和S100A9的表达水平及细胞亚定位变化,并探究相关受体及通路。3.检测ATP刺激HGFs后细胞活力的变化并探讨其对细胞凋亡的调控作用及其内在机制。方法:1.将健康和牙周炎牙龈组织样本常规多聚甲醛固定并脱水处理及石蜡包埋,制作连续切片,免疫组织化学染色法研究P2X7R在人相对健康与牙周炎牙龈组织中的表达和分布,利用Image J半定量测量P2X7R的表达强度及阳性细胞率。2.体外培养原代HGFs,免疫组化染色鉴定细胞来源。利用Real-time PCR,Western blot和免疫荧光检测*** LPS和/或ATP对HGFs中S100A8,S100A9和P2X7R表达的影响及其细胞亚定位。采用TLR4(Toll-like receptor4)阻断剂,TLR2(Toll-like receptor 2)阻断剂及P2X7R阻断剂确定相关受体,Western blot法检测信号通路的活化并应用通路阻断剂筛选参与*** LPS与ATP调控S100A8和S100A9表达的可能信号通路。3.通过CCK8和AO/EB细胞活死染色确定ATP对HGFs细胞活力与凋亡的影响,并采用P2X7R阻断剂,caspase-3抑制剂及线粒体通透性转换孔道(Mitochondrial permeability transition pore,m PTP)抑制剂探究ATP对细胞活力变化及凋亡影响的内在机制。结果:1.不同状态牙龈组织中均有P2X7R的表达:在相对健康牙龈组织中,上皮全层呈弱阳性表达,结缔组织中有少量成纤维样细胞,微血管内皮细胞和浸润的中性粒细胞呈弱阳性表达;在牙周炎牙龈组织中,上皮全层呈强阳性表达,结缔组织中大量浸润的中性粒细胞和微血管内皮细胞以及部分成纤维样细胞呈中阳性至强阳性表达。牙周炎组上皮和结缔组织中P2X7R表达强度和阳性细胞率均显著高于健康组(P<0.05),与牙周临床参数PD(Probing Depth)、CAL(Clinical Attachment Loss)和BI(Bleeding Index)呈正相关(P<0.05)。体外培养的HGFs中可检测到P2X7R的表达,ATP以浓度依赖的方式上调HGFs中P2X7R的表达水平,其中12小时后m RNA和蛋白表达水平达到峰值。免疫荧光显示P2X7R主要分布于胞质和胞膜中,加入ATP刺激后荧光强度升高。*** LPS和/或ATP显著增加了S100A8,S100A9和P2X7R在m RNA和蛋白水平上的表达,同时*** LPS和/或ATP可使S100A8定位于胞质,S100A9定位于胞质和胞核。*** LPS通过TLR2而非TLR4上调S100A8和S100A9的表达水平,ATP通过P2X7R上调S100A8和S100A9的表达水平。*** LPS与ATP均可通过激活并受到P38,ERK1/2,JNK1/2和NF-κB信号通路上调S100A8和S100A9表达水平。***以时间和浓度依赖的方式抑制HGFs的活力并促进HGFs死亡,其在HGFs的功能性受体为P2X7R。通过抑制caspase-3活化和m PTP开放,ATP所诱导的HGFs死亡可被部分抑制。结论:1.P2X7R参与牙周炎病程的进展并且ATP可能通过P2X7R介导引起免疫炎症反应。*** LPS与ATP分别通过TLR2和P2X7R活化HGFs中P38,ERK1/2,JNK1/2和NF-κB信号通路并促进S100A8和S100A9的表达,从而影响局部的炎症状态。并且免疫荧光显示S100A8和S100A9可在HGFs的胞质中共定位,说明二者可能形成S100A8/A9异二聚体并作为HGFs的分泌蛋白从而在细胞外环境发生生物学作用。***可以通过P2X7R降低HGFs细胞活力并促进细胞死亡,其中部分细胞死亡是由m PTP开放

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多功能纳米微球特异性检测牙龈卟啉单胞菌的实验研究

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作者：秦尉天津医科大学

学位级别：硕士

目的分别通过高温油相法和化学共沉淀法制备上转换纳米粒子和磁纳米粒子,然后对这两种纳米粒子进行改性以更好的与牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体结合,从而达到富集并识别混合菌液中牙龈卟啉单胞菌的目的。本研究旨在为上转换纳米材料和磁纳... 详细信息

目的分别通过高温油相法和化学共沉淀法制备上转换纳米粒子和磁纳米粒子,然后对这两种纳米粒子进行改性以更好的与牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体结合,从而达到富集并识别混合菌液中牙龈卟啉单胞菌的目的。本研究旨在为上转换纳米材料和磁纳米材料在口腔检测及诊断领域的应用提供一个新的思路,同时为进一步行多种牙周致病因子的同时检测提供研究基础。方法1.使用高温有机溶剂法制备绿色上转换纳米粒子(NaYF:Er Yb);通过透射电镜(TEM)表征NaYF:Er Yb纳米粒的形貌;使用荧光光谱仪表征NaYF:Er Yb的光谱;Zeta电位及粒度分析仪分别表征NaYF:Er Yb的晶体结构和表面电荷。2.采用化学共沉淀法制备磁纳米粒子(FeO);通过TEM表征FeO的形貌;使用振动样品磁强计(VSM)来评估FeO的磁强度。3.使用二氧化硅包裹Na YF:Er Yb纳米粒子和FeO纳米粒子分别制得两种纳米微球(NaYF:Er@SiO和FeO@SiO);通过TEM表征两种纳米微球的形貌;使用荧光光谱仪表征NaYF:Er@SiO的光谱;使用VSM来评估FeO@SiO的磁强度。4.探究NaYF:Er@SiO和FeO@SiO的非特异性吸附作用;使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来活化SiO纳米微球后结合抗体,之后与牙龈卟啉单胞菌反应,然后与活化后未结合抗体的微球与牙龈卟啉单胞菌反应作对比;使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜观察两组反应结果。5.验证牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体的特异性;活化NaYF:Er@SiO后与牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体结合,然后分别与牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌及变形链球菌混合,同时设置空白对照组,仅在磷酸盐液中加入已结合抗体的NaYF:Er@SiO;使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜观察反应结果。6.混合菌液中检测牙龈卟啉单胞菌;将结合牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体的NaYF:Er@SiO和FeO@SiO加入含有牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、变形链球菌及中间普氏菌的混合菌液中;使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜观察反应结果。7.评价检测系统的灵敏性;调节牙龈卟啉单胞菌菌液的浓度(105,104,103,102,10和0 CFU/mL)分别加入结合牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体的NaYF:Er@SiO和FeO@SiO纳米微球,离心洗涤后使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜观察反应结果。结果***:Er Yb纳米粒子和NaYF:Er@SiO纳米微球的理化性状观察:透射电镜下可见NaYF:Er Yb纳米粒子和NaYF:Er@SiO纳米微球的分散性较好,大小均一,NaYF:Er Yb的平均粒径约为30 nm,NaYF:Er@SiO的平均粒径约为100 nm。荧光光谱显示,在519 nm、542 nm和655 nm处可见明显的3个吸收峰,且NaYF:Er@Si O的波峰强度较NaYF:Er Yb并未明显降低。***纳米粒子和FeO@SiO纳米微球的理化特性观察:透射电镜下可见FeO纳米粒子和FeO@SiO纳米微球分散性较好比较均匀,FeO的形貌为不规则的球形,平均粒径约为7 nm,FeO@SiO为规则的球形,平均粒径为50 nm。常温下磁滞回力曲线显示,包硅后FeO纳米粒子的磁强度未发生明显改变。3.荧光显微镜下可见经EDC/NHS活化后结合抗体的纳米微球组在980nm NIR激发下可见绿色荧光,而EDC/NHS活化后未结合抗体的纳米微球组在980nm NIR激发下未见任何绿色荧光。4.荧光显微镜下可见经980nm NIR激发下,除牙龈卟啉单胞菌组外,空白对照组、具核梭杆菌组及变形链球菌组均无绿色荧光。5.将结合牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体的NaYF:Er@SiO和FeO@SiO加入至混合菌液中,反应后洗涤分离经980nm NIR激发后荧光显微镜下可见绿色荧光。6.除空白组外,梯度浓度的牙龈卟啉单胞菌菌液加入NaYF:Er@SiO-Ab和FeO@SiO-Ab后离心洗涤,使用外置980nm NIR激发器的荧光显微镜均可发现绿色荧光。结论1.使用高温有机溶剂法制备绿色上转换纳米粒子理化性状良好,包硅改性后并不会明显改变其荧光强度,且分散性良好,大小均匀。2.使用化学共沉淀法制备磁纳米粒子磁强度良好,包硅改性后并不会明显改变其磁强度,且分散性良好,大小均匀。3.未结合抗体的情况下,上转换纳米微球和磁纳米微球并不会吸附细菌,即无非特异性吸附作用。4.使用本研究所建立的检测系统可在10 CFU/mL的牙龈卟啉单胞菌菌液中检测出牙龈卟啉单胞菌,说明该检测系统检测灵敏性良好。

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钙卫蛋白调控内皮细胞黏附分子表达的作用及机制

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作者：田广杰天津医科大学

学位级别：硕士

目的:牙周病是非常常见的口腔疾病,是成年人群牙齿缺失的主要原因之一,且与多种全身系统性疾病相关联,严重危害患者全身健康。钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9是S100蛋白家族的重要成员,具有参与细胞骨架调控、促进白细胞募集... 详细信息

目的:牙周病是非常常见的口腔疾病,是成年人群牙齿缺失的主要原因之一,且与多种全身系统性疾病相关联,严重危害患者全身健康。钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9是S100蛋白家族的重要成员,具有参与细胞骨架调控、促进白细胞募集、参与免疫反应等多种作用。大量数据表明,在牙周炎组织如牙龈组织、龈沟液中,钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9的表达水平明显升高,甚至在牙周炎患者的血浆中钙卫蛋白浓度显著高于牙周健康者。此外,动物实验数据表明,牙周炎症可诱导微血管内皮表达S100A8、S100A9,且活化的血管内壁有炎症细胞的黏附。由以上客观证据受到启发,提出猜想:钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9可能在牙周免疫炎症反应中发挥重要作用,并影响内皮细胞黏附分子的表达。因此,本研究拟通过体外实验,用不同浓度人重组钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9刺激内皮细胞,检测黏附相关分子ICAM-1、VCAM-1的表达水平,并筛选其发挥作用的功能性受体,研究其作用机制,从而分析钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9在牙周炎局部炎症中对微血管内皮细胞的作用影响。方法:1.细胞培养:人脐静脉内皮细胞系(*** 926),购买自中国科学院上海细胞库,并进行体外培养。2.人重组钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9对内皮细胞表达细胞间黏附分子(ICAM-1)、血管间黏附分子(VCAM-1)的影响:不同浓度、不同时间人重组钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9刺激*** 926细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-q PCR)方法检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1在m RNA水平的表达,通过免疫印迹实验(Western Blot)方法检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达。3.筛选在人重组钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9刺激下,影响内皮细胞黏附分子差异表达的功能性受体:TAK242(TLR4阻断剂)、FPS-ZM1(RAGE受体阻断剂)预孵育***926细胞1小时,之后加入人重组钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9刺激*** 926细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-q PCR)方法检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1在m RNA水平的表达,通过免疫印迹实验(Western Blot)方法检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表达,并筛选出影响内皮细胞黏附分子表达的功能性受体。结果:1.与空白对照组相比,人重组钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9刺激*** 926细胞6h,黏附相关分子ICAM-1、VCAM-1在m RNA及蛋白水平的表达明显升高,且高低浓度之间具有一定差异;2.与阳性对照组相比,加入TAK242(TLR4受体阻断剂)和FPS-ZM1(RAGE受体阻断剂)的组别,黏附相关分子ICAM-1、VCAM-1的m RNA水平及蛋白水平表达明显降低,且仅在高浓度加药时表达差异显著。结论:1.在钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9的刺激下,可使内皮细胞相关黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达水平上调;***4和RAGE均为影响内皮细胞黏附分子表达的功能性受体,提示:牙周炎患者牙周局部过表达的钙卫蛋白S100A8/A9及其亚基S100A8、S100A9可能在TLR4和RAGE两个受体的介导下活化下游信号通路,上调黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达,进一步加重牙周炎局部炎症反应。

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磁性上转换荧光编码微球特异性检测单纯疱疹病毒的实验研究

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作者：江圣杰天津医科大学

学位级别：硕士

目的本实验拟探讨一种基于磁性上转换纳米粒子能够快速特异性检测疱疹病毒的新方法,使用分散聚合法制备聚苯乙烯种子微球,利用种子聚合法制备多孔羧基化聚苯乙烯微球,采用高温熔胀法将上转换纳米粒子（upconversion nanoparticles,UCNs... 详细信息

目的本实验拟探讨一种基于磁性上转换纳米粒子能够快速特异性检测疱疹病毒的新方法,使用分散聚合法制备聚苯乙烯种子微球,利用种子聚合法制备多孔羧基化聚苯乙烯微球,采用高温熔胀法将上转换纳米粒子（upconversion nanoparticles,UCNs）NaYF4:Yb,Tm和磁纳米粒子（magnetic nanoparticles,MNPs）包埋至多孔聚苯乙烯微球中,从而制得一种磁响应性能和荧光强度最佳的磁性上转换荧光编码微球,并且能运用于单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus1,HSV-1）检测的磁性上转换荧光纳米材料,实现操作简单、快速,准确度高的目的。旨在为临床椅旁检验、精准个性化医疗提供实验基础。方法实验使用分散聚合法制备聚苯乙烯种子微球,利用种子聚合法制备多孔羧基化聚苯乙烯微球,再采用高温熔胀法将上转换（UCNs）NaYF4:Yb,Tm纳米粒子和磁纳米粒子（MNPs）包埋至多孔聚苯乙烯微球中,获得磁响应性能和荧光强度最佳的磁性上转换荧光编码微球。利用HELA细胞培养单纯疱疹病毒1型并利用Reed-Muench两氏法确定所培养的HSV-1的半数细胞培养物感染量TCID50。活化微球表面羧基基团,HSV-1的单克隆抗体与磁性上转换荧光编码微球偶联,加入病毒待检液,再用标记罗丹明染料的二抗与之反应,双抗夹心法检测病毒。验证磁性上转换微球的特异性,探究其能检出的最低病毒浓度。结果实验制得的聚苯乙烯微球大小均一,粒径小于5μm,高温溶胀法将磁粒子和上转换粒子包入其中后制得磁性上转换纳米粒子,纳米粒子无聚合现象。所制得的磁性上转换纳米微球同时具有磁性和上转换荧光粒子特性。通过HELA细胞培养病毒的方法获得了具有生物活性的疱疹病毒,收集疱疹病毒溶液通过Reed-Muench两氏法测定,浓度为10-4/0.1mlTCID50。磁性上转换纳米子结合HSV-1的单克隆抗体后具有特异性,能特异性结合HSV-1后与罗丹明标记的二抗反应荧光显微镜下显示紫色。通过检测不同梯度浓度的HSV-1发现当病毒液中仅有10TCID50HSV-1时仍可检出其中的HSV-1。结论通过连接磁性上转换纳米粒子和HSV-1单克隆抗体后利用双抗夹心法能特异性检出HSV-1,并通过纳米粒子的磁性,快速分离待检物,通过其上转换特性在荧光显微镜下快速简便的发现其显色反应。电镜下显示连接抗体的磁性上转换纳米微球表面由光滑变得粗糙,且能够连接病毒颗粒。特异性纳米微球分别与含有HSV-1、带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）的三组待检溶液反应,结果显示仅在HSV-1组有特异性显色反应,表明连接了单克隆抗体的微球具有特异性。通过检测不同浓度的HSV-1病毒液,发现其能检出10TCID50HSV-1病毒液中的HSV-1,表明此方法在病毒液中仅含10TCID50HSV-1时仍能检测出HSV-1的存在。

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新型双亲性载药温敏凝胶布洛芬/PECT的实验研究

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作者：贾玉荣天津医科大学

学位级别：硕士

目的使用纳米沉淀技术制备负载布洛芬(ibuprofen,IPF)新型温敏凝胶三嵌段共聚物--聚(5-乙二醇缩酮-ε-己内酯-ε-己内酯)-聚乙二醇-聚(5-乙二醇缩酮-ε-己内酯-ε-己内酯)(PECT)。观察其形貌、研究其相转变行为,以及对其药物释放特点进... 详细信息

目的使用纳米沉淀技术制备负载布洛芬(ibuprofen,IPF)新型温敏凝胶三嵌段共聚物--聚(5-乙二醇缩酮-ε-己内酯-ε-己内酯)-聚乙二醇-聚(5-乙二醇缩酮-ε-己内酯-ε-己内酯)(PECT)。观察其形貌、研究其相转变行为,以及对其药物释放特点进行分析;再通过体外细胞实验测定生物安全性和抗炎效果,评价其释药情况以及生物学性能。旨在为制备既具有局部缓释特点,同时又能起到高效抗炎作用的凝胶提供研究基础。方法1.使用纳米沉淀技术制备负载IPF的PECT缓释凝胶和不载药的空白PECT缓释凝胶;通过扫描电镜(Scanning Electronic Microscope,SEM)、透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察载药与不载药凝胶形貌;采用小瓶翻转方法研究IPF/PECT分散液的相转变行为;体外测定药物释放曲线。2.采用组织块原代培养法培养健康人的牙龈成纤维细胞(Human Gingival Fibroblasts,HGFs);胰酶消化法进行传代培养;倒置相差显微镜观察HGFs形态以及生长情况;免疫组织化学方法进行细胞来源鉴定,生长良好的第4-6代HGFs用于实验。体外将已制备好的IPF/PECT纳米粒水溶液与HGFs共培养,设置不同药物浓度组(以PECT为标准);用四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl terazolium,MTT)于实验的第48h检测各组HGFs的增殖活性。3.使用牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis-Lipopolysaccharide,Pg-LPS)刺激HGFs,建立细胞炎症模型。体外分别加入相同IPF药物浓度的IPF水溶液和IPF/PECT纳米粒溶液,与炎症状态下HGFs共培养;定时取上清液,用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assays,ELISA)方法检测不同时间点各组HGFs前列腺素E-2(prostaglandin E-2,PGE2)分泌情况。结果1.载IPF纳米粒(IPF/PECT NPs)的物理性状观察:纳米沉淀技术制备负载IPF的PECT缓释凝胶,制成冻干粉储存。IPF/PECT冻干粉溶于双蒸水中配制为IPF/PECT NPs分散液,常温下为溶液状态,将小瓶置于37℃温箱可见溶液一分钟内发生相转变,成为半固体凝胶状态;纳米粒溶液透射电镜显示:IPF/PECT纳米粒粒径均匀,无明显聚合现象;半固体水凝胶扫描电镜显示:IPF/PECT凝胶孔径大小均一,较无载药凝胶孔径稍大,有利于药物释放;药物类似线性释放可达32天以上;药物累积释放量85%,无明显突释现象。2.培养HGFs及其与IPF/PECT纳米粒水溶液共培养结果:采用组织块原代培养法于体外成功培养出HGFs。使用倒置相差显微镜观察,接种70d后组织块四周即可见原代细胞游出,呈放射状排列,较多为长梭形,细胞传代后生长迅速,形态与原代细胞相一致。通过细胞来源鉴定,细胞抗角蛋白染色阴性,抗波形丝蛋白染色阳性,同时结合取材部位,证实本实验培养所得细胞为中胚层来源的HGFs。MTT法检测HGFs的增殖活性:不同浓度IPF/PECT与HGFs共同培养48h后,各组平均OD值分别为0.29±0.01、0.28±0.01、0.29±0.02、0.29±0.03、0.29±0.03、0.29±0.03、0.28±0.02,各实验组与对照组相比均无统计学意义(P﹥0.05)。3.不同时间点IPF/PECT与炎症状态下HGFs共培养的上清液中PGE2表达情况:1μg/ml Pg-LPS处理HGFs后PGE2表达显著上升。使用ELISA方法检测炎症细胞上清液中PGE2显示:在不同时间点IPF水溶液以及IPF/PECT NPs,PGE2水平均较对照组低;相同药物浓度IPF/PECT NPs组PGE2水平均低于IPF水溶液组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1.使用纳米沉淀技术可以制备出负载布洛芬的新型双亲性温敏原位凝胶。IPF与PECT质量比为5:100,为最大载药量,形态结构稳定,药物缓释效果良好。2.载药后的PECT新型缓释药物载体在体外对HGFs增殖无影响,具有良好的生物相容性。3.各时间点IPF/PECT与IPF抗炎效果相比,有明显优势,且随着时间的延长,IPF/PECT组的抗炎效果逐渐增强。

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低能量激光对人牙龈成纤维细胞抗炎作用的研究

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作者：高鹏飞天津医科大学

学位级别：硕士

研究目的:体外培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs),通过real-time qPCR、酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测低能量激光疗法(low level laser treatment,LLLT)对牙龈卟啉单胞菌(Porphy... 详细信息

研究目的:体外培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs),通过real-time qPCR、酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测低能量激光疗法(low level laser treatment,LLLT)对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激下HGFs分泌白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、细胞间粘附因子-1(Inter cellμLar adhesion molecμLe1,ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(CCL2)及转录因子c-Jun、c-Fos及NF-κB的影响,从分子水平进一步阐明牙周疾病的致病机理及低能量激光辅助抗炎的作用机制,为进一步揭示牙周病的病理机制和激光辅助牙周治疗提供理论依据。研究方法:选择天津医科大学口腔医院颌面外科门诊2017年08月至10月就诊的需要拔除阻生齿的患者,获得患者知情同意后,在术中收集用于原代培养的牙龈组织,所取组织无明显炎症。(1)组织块法培养原代HGFs,显微镜下观察其生长状况,经传代后取第3代细胞进行免疫组化染色进行来源鉴定,取4-6代细胞进行实验。(2)用浓度10μg/mL的P.g LPS刺激HGFs,在0h、2h、4h、6h、8h及24h时间点分别提取HGFs的总mRNA,观察各时间点IL-1β、ICAM-1、CCL2、c-Jun、c-Fos、NF-κB mRNA表达的情况,并选取各因子表达的峰值时间点,作为下一步实验的基础。(3)实验分组:空白对照组、LPS组、LPS+LLLT组,分别予以DMEM、10μg/mL P.g LPS、10μg/mL P.g LPS+5J/cm LLLT处理,在各炎症因子表达峰值时间点提取各组HGFs的总mRNA及培养液,观察炎症因子及转录因子的表达情况。(4)real-time qPCR检测HGFs中IL-1β、ICAM-1、CCL2、转录因子c-Jun、c-Fos及NF-κB的mRNA表达水平;ELISA检测培养液中IL-1β、ICAM-1、CCL2的蛋白表达。(5)采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析;计数资料以均数±标准差表示;组间比较采用独立样本t检验,取p0.05)。结论:(1)牙龈成纤维细胞受到P.g LPS刺激能合成分泌多种细胞因子发挥免疫炎症反应,炎症因子IL-1β、ICAM-1、CCL2及转录因子c-Jun、c-Fos及NF-κB在牙周炎的发生发展中起重要作用。(2)LLLT可降低炎症HGFs模型中炎症因子IL-1β、ICAM-1、CCL2及转录因子c-Jun、c-Fos及NF-κB的表达,抑制病原微生物在牙周炎致病过程中所起的作用,产生抗炎作用。

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Ⅱ型糖尿病前期龈炎患儿牙周可疑致病菌及龈沟液AST和IL-6检测

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作者：邰佰霞天津医科大学

学位级别：硕士

目的本研究应用16S rRNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)方法检测儿童Ⅱ型糖尿病前期的牙龈炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa... 详细信息

目的本研究应用16S rRNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)方法检测儿童Ⅱ型糖尿病前期的牙龈炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)、福赛斯坦纳菌(Bacteroides forsythus, Tf)、中间普氏菌(Prevotella intermedia, Pi)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)等5种可疑致病菌和计算其相对含量,通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和全自动生化分析仪分别测定龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)及天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)表达水平,分析牙周临床指标与5种可疑致病菌相对含量、IL-6和AST水平的相关性,从而探讨Ⅱ型糖尿病前期儿童牙周可疑致病菌、IL-6和AST水平与其牙龈健康状况的关系。方法以到天津医科大学口腔医院接受口腔健康检查的6-14儿童为对象若干名,经参试儿童和家长知情同意并天津医科大学伦理委员会审查批准后,进行如下检查：空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)口口服葡萄糖耐量试验2小时血糖(oral glucose tolerance test2h plasma glucose, OGTT2hPG)的检测;牙周临床指标检查包括：龈沟出血指数(sulcus bleeding index, SBI),牙周探诊深度(probing depth, PD)和菌斑指数(plaque index, PLI);龈沟液和龈下菌斑样本的采集以及全身健康状况的检查,进行严格的筛选,最后选取处于糖尿病前期状态和代谢正常的儿童共90名,按照血糖代谢状况及牙周状况分为3组,其中糖尿病前期伴牙龈炎患者30例(A组),代谢正常伴牙龈炎患者30例(B组),代谢正常且牙周健康者30例(C组),进行如下实验室检测： (1)应用PCR技术进行龈下菌斑样本中的5种可疑致病菌的检测。 (2)用全自动生化分析仪(7070型,HITACHI公司,日本)测定龈沟液样本内AST的水平。 (3)通过ELISA实验,测定龈沟液样本内IL-6的浓度。结果 1.A组PD明显高于B、C组,具有统计学差异(P0.05)。(见表1) 2.5种可疑致病菌的检出率：A、B组高于C组,具有统计学差异(P0.05)。(见表3) 3.5种可疑致病菌的相对含量：A组Pg、Tf、Aa的相对含量高于B、C组,与C组间具有统计学差异(P0.05);5种可疑致病菌的相对含量与牙周探诊深度(PD)、龈沟出血指数(SBI)有正相关性,有统计学意义(P0.05)。(见表6,7,8) 结论 1.Ⅱ型糖尿病前期牙龈炎患者在临床上牙龈炎症程度要高于单纯牙龈炎患者,应更加注意日常的菌斑控制,预防牙周炎的发生。 2.与单纯牙龈炎相比,Ⅱ型糖尿病前期牙龈炎其牙周可疑致病菌的种类和数量尚未发生明显改变,但是不排除Pg、Aa等菌发展为优势菌继续导致牙周炎发生的可能。 3.龈沟液内IL-6、AST水平随血糖浓度的升高而升高,同时随牙龈炎症程度的加重而升高,因此测定糖尿病前期儿童GCF中IL-6、AST水平,有可能成为评价牙龈炎趋向性的客观动态指标,对早期牙周炎的诊断有临床意义。

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