检索结果-南通市图书馆

作者：罗迪茵福建师范大学

学位级别：硕士

原核生物经历长时间与噬菌体等外源性入侵遗传组件(mobile genetic elements,MGE)博弈,不断进化出多项机制以对抗侵害,CRISPR-Cas系统便是其中一种重要的后天免疫防御机制。CRISPR-Cas系统由极具结构特征的CRISPR阵列(clustered regular... 详细信息

原核生物经历长时间与噬菌体等外源性入侵遗传组件(mobile genetic elements,MGE)博弈,不断进化出多项机制以对抗侵害,CRISPR-Cas系统便是其中一种重要的后天免疫防御机制。CRISPR-Cas系统由极具结构特征的CRISPR阵列(clustered regularly inter spaced short palindromic repeat)以及靠近该规律阵列分布的可编码Cas(CRISPR-associated)效应蛋白相关基因组成,具备多重基因编辑修饰功能。依据参与cr RNA(CRISPR RNA)加工处理及靶标底物干扰过程效应蛋白的不同分为第一大类和第二大类。其中,第二大类CRISPR-Cas系统仅由单效应蛋白介导完成干扰过程,包括靶向切割双链DNA的Cas9和Cas12a(分别来源于II型和V-A型系统)以及识别并切割单链RNA的VI型Cas13系统。Cas12i作为新报道的V型CRISPR-Cas系统成员之一,既可自主加工前体cr RNA(pre-cr RNA),同时可切割靶标ds DNA底物,此外还具备体积较小、可编程调控和显著差异的切割活性等特性,使其一跃成为高保真基因组编辑、基因治疗应用的潜力新星。本研究共解析2类不同状态Cas12i1的三元复合物晶体结构,包括预裂解状态及裂解后状态,同时结合生化实验进行相应的功能探究,以阐明靶标ds DNA双链解链、R-loop环形成和切割裂解的机制。研究发现,Cas12i1蛋白呈现双叶型结构,其中,识别(REC)叶包括Helical-I结构域及PI结构域(PAM interacting domain,PAM相互作用结构域),核酸酶(NUC)叶包括WED结构域(wedge domain,楔形结构域)、Ruv C结构域(核酸酶结构域,含Ruv C I-III)、Helical-II结构域及Nuc(alkaline nuclease)结构域,由cr RNA、靶标双链DNA组成19 bp的R-loop环结构,结合于双叶间带正电囊袋中,呈现T型构象。同时,鉴定出Cas12i1蛋白的Helical-I结构域中一个“拉链”基序(含氨基酸残基160–177 aa)对双链DNA解旋极其关键。经体外生化实验证实,Ruv C域中3个氨基酸残基D647、E894和D1074为NTD链切割的关键切割位点,而W915、H946、N649、R652及R962等氨基酸残基对裂解活性也具有不同程度的影响。另外Helical-II结构域中一Loop环区(包括氨基酸残基724–737 aa)在协助TD链装载到Cas12i1中Ruv C域活性位点起重要作用。生化实验表明Cas12i1的裂解活性存在温度及金属离子依赖性。基于系列的结构分析与功能研究,我们最终提出一个Cas12i1激活的多步骤顺势裂解模型,为合理设计CRISPR-Cas12i系统,提高保真度和效率提供更多的机制见解。

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粪肠球菌噬菌体裂解酶Lys170结构与功能研究

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作者：许小龙福建师范大学

学位级别：硕士

抗生素滥用导致临床中的致病菌出现不同程度耐药,粪肠球菌（Enterococcus faecalis,简称***）作为一种革兰氏阳性菌,是引起医院大规模感染的常见病原体,在宿主内易位寄生引发脑膜炎、败血症和心内膜炎等疾病。因为对大分子物质有较低的... 详细信息

抗生素滥用导致临床中的致病菌出现不同程度耐药,粪肠球菌（Enterococcus faecalis,简称***）作为一种革兰氏阳性菌,是引起医院大规模感染的常见病原体,在宿主内易位寄生引发脑膜炎、败血症和心内膜炎等疾病。因为对大分子物质有较低的通透性、较厚的细胞壁以及能获取抗性基因等因素,临床出现了抵抗不同抗生素的粪肠球菌菌株,其中万古霉素被认为是治疗革兰氏阳性菌的最后一道防线,但也鉴定出耐万古霉素的菌株,所以寻求新的治疗方法成为当务之急。噬菌体作为细菌的天敌成为首选,可是噬菌体以活病毒的方式入侵宿主使得开发成为困难。但在噬菌体裂解细菌后期分泌一类对细菌细胞壁的主要成分肽聚糖起切割作用的裂解酶（lysin）,其本质是蛋白质,相对于噬菌体来说,裂解酶具有更好的可控性、更高的特异性和更强的裂解能力,因此成为了研究的热点。噬菌体裂解酶的结构一般由N端的催化结构域（catalytic domain,CD）以及C端的细胞壁结合结构域（cell binding domain,CBD）组成,两者通过Linker连接。来自噬菌体F170/08的Lys170是早期发现的裂解酶之一,能裂解粪肠球菌,但裂解的特异性菌株以及裂解机理都是未知,因此我们通过生物化学手段、使用结构生物学方法解决这一问题。本论文首先选用大肠杆菌表达系统对Lys170进行表达与纯化,然后对临床分离出的致病菌进行筛选找到对粪肠球菌40号菌株有高效的裂解能力;同时使用X射线晶体学方法解析1.40?分辨率的蛋白结构,可能由于Linker区域柔性导致最后电子密度图只有C端的Lys170 CBD（氨基酸202-289）;结构分析表明Lys170 CBD以四聚体状态存在溶液中,每个单体以三个连续的β折叠为中心,两侧各覆盖一个α螺旋的形式组成;将四聚体结合的七个氨基酸位点进行突变分析,表明Y203完全破坏Lys170 CBD的四聚体界面并丧失杀菌能力,说明Lys170 CBD四聚体的形成对全酶发挥裂解能力至关重要;考虑到Lys170 CBD结合细胞壁,对结构进行表面带电性分析并突变了六个可能参与结合细胞壁的带正电荷的氨基酸位点,使用平板滴定实验鉴定出R235、R236两个位点对于结合粪肠球菌的细胞壁很重要。综上所述,本论文对Lys170的结构和功能探索,帮助了解其裂解机制,为后续抗菌药物研发提供理论基础。

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生物学科高阶思维评价指标体系的建立与评估

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作者：刘添福建师范大学

学位级别：硕士

核心素养下的教育改革势在必行,培养具备高阶思维的创新型人才是教育对社会需求的回应。关于推动高阶思维培养的教学模式、高阶思维评价方式的研究热度持续攀升,不断促进如项目化学习等推动学生高阶思维培养教学模式的发展。然而在课堂... 详细信息

核心素养下的教育改革势在必行,培养具备高阶思维的创新型人才是教育对社会需求的回应。关于推动高阶思维培养的教学模式、高阶思维评价方式的研究热度持续攀升,不断促进如项目化学习等推动学生高阶思维培养教学模式的发展。然而在课堂教学实践中,现有研究多指向高阶思维培养的教学设计和高阶思维外显化学习行为的观察,缺乏有效的高阶思维水平评价工具。因此,本研究基于高阶思维的内涵解析和项目化学习优秀案例的分析,尝试建构一套科学有效的高阶思维评价体系,重点进行评价指标和标准的设计与实践研究。本研究主要包含三个方面的内容:首先,借助于文献分析法,分析国内外有关思维评价、高阶思维内涵和高阶思维评价的理论研究成果,对项目化学习、高阶思维内涵及项目化学习培养高阶思维优越性进行了探讨。结合系统思维测量框架、问题表征的一般思维模式等,初步建立高阶思维评价指标体系;其次,在初步建立的评价指标基础上,借助专家咨询法,结合专家对于具体指标重要程度的意见,利用专家排序法公式计算出具体评价指标的相对权重,建立完整的高阶思维评价指标体系;最后,将目光聚焦于生物学科,在高中生物学科的知识基础上,根据高阶思维评价指标,编制了结合生物学科的高中学生高阶思维调查问卷,并实施了问卷调查分析学生高阶思维水平。本研究得出以下结论:1.建构了一套完整的高阶思维水平评价指标体系,包括:系统分析1个一级指标,信息需要、识别定义问题、实施挑战和洞察问题发展4个二级指标,又将各二级指标具体细化为2个三级指标,形成了一套高阶思维评价指标体系;2.编制了高阶思维水平评价工具,问卷调查数据分析结果表明:本研究所建构的评价指标体系所编制的高中学生高阶思维调查问卷,具有良好的内部一致性信度、内容效度和良好的区分度,能够准确测量学生高阶思维水平;3.学生在“启发搜索”和“识别要素”维度表现相对较好,在“评价”维度上学生整体表现较弱。总体来说,当前学生整体高阶思维水平较弱,两份问卷调查结果均未达到及格水平,在课堂教学实践中,教师应关注学生高阶思维发展情况,并根据学生真实情况作出教学改进。

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CRISPR-Cas系统Ⅴ型效应蛋白Cas12g的结构生物学研究

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作者：陈静福建师范大学

学位级别：硕士

CRISPR-Cas系统是原核生物抵御噬菌体和外来核酸入侵的防御系统,由规律成簇的间隔短回文重复DNA序列和编码相关Cas蛋白的基因组成。根据Cas效应蛋白功能复合物结构及特点的不同,可以将CRISPR-Cas系统分为两大类。其中,研究者发现并报道... 详细信息

CRISPR-Cas系统是原核生物抵御噬菌体和外来核酸入侵的防御系统,由规律成簇的间隔短回文重复DNA序列和编码相关Cas蛋白的基因组成。根据Cas效应蛋白功能复合物结构及特点的不同,可以将CRISPR-Cas系统分为两大类。其中,研究者发现并报道了新型第二大类Ⅴ型效应蛋白Cas12g,其宿主细菌源自温泉,故热稳定性高。此类蛋白具有特异性识别RNA底物的特点,有利于提高核酸诊断方法的性能,如在常温下进行RNA检测时不会改变其灵敏度。同时,Cas12g apo-form分子量仅89 kDa,相对较小的蛋白尺寸有助于其在体内转录组工程的应用。然而,目前对Cas12g效应蛋白结构与发挥功能的分子机制缺乏了解,严重限制该蛋白作为新型基因编辑工具的应用潜能,故本研究开展对Cas12g效应蛋白结构与相关功能分析。本研究通过大肠杆菌表达Cas12g效应蛋白,经Ni柱亲和层析、离子交换层析、分子排阻层析纯化获得目的蛋白,运用X-ray晶体衍射法解析Cas12g apo-form结构。Cas12g晶体结构整体上呈现双叶型分布,可分为REC Lobe和NUC Lobe;REC Lobe由REC1和REC2两大结构域组成。NUC Lobe由WED、RuvC及Nuc结构域组成。WED与RuvC结构域在蛋白质一级序列中分布不连续,但在三维空间的分布较为集中。随后,通过T7 RNA聚合酶的体外转录纯化获得目的sgRNA。将Cas12g效应蛋白、sgRNA和Target RNA按1:0.9:1.1摩尔比例混合孵育,纯化后获得Cas12g-sgRNA二元复合物与Cas12g-sgRNA-Target RNA三元复合物。体外制备的复合物用于晶体筛选与低温冷冻电镜样品的制备。经低温冷冻电镜数据收集与处理,获得3(?)分辨率的Cas12g-sgRNA二元复合物初始模型。基于目的蛋白与sgRNA的二级结构预测分析,探究Cas12g效应蛋白复合物的切割底物。利用凝胶迁移实验表明,Cas12g可以对ssRNA进行识别与切割,但无法对ds DNA底物进行识别与切割,而酶活突变后的Cas12g(D513A)则缺失此功能。结合Cas12g apo-form结构与Cas12g复合物结构(PDB:6XMF、6XMG)进行构象比对分析与蛋白质骨架的重叠比较,推测Cas12g发挥功能时的激活机制:在Cas12g效应蛋白结合靶RNA之前,有部分基序会覆盖于RuvC结构域的活性位点,起到盖子的作用,防止靶RNA进入相关活性中心;而sgRNA与靶RNA形成异源双链体的过程中,盖在RuvC结构域活性位点上的基序发生移动,暴露活性中心位点,进而招募非特异性RNA。本研究旨在通过解析Cas12g apo-form及其复合物结构,解释Cas12g蛋白被激活后发挥其RNase活性的结构基础和分子机理,为今后CRISPR-Cas12g系统的合理改造与应用提供结构基础和理论依据。

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CRISPR-Cas12c1效应蛋白识别与靶向DNA切割机制研究

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作者：林锦莹福建师范大学

学位级别：硕士

CRISPR-Cas系统为原核生物用于抵制外源质粒和噬菌体发挥适应性免疫调控的功能。CRISPR-Cas系统的Cas蛋白组成及基因组位点结构具有显著的多样性,根据效应器模块的构架将其分成第一大类(Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型)和第二大类(Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型)... 详细信息

CRISPR-Cas系统为原核生物用于抵制外源质粒和噬菌体发挥适应性免疫调控的功能。CRISPR-Cas系统的Cas蛋白组成及基因组位点结构具有显著的多样性,根据效应器模块的构架将其分成第一大类(Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型)和第二大类(Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型),其中第二大类CRISPR-Cas系统的研究较为深入,II型Cas9效应蛋白、V型Cas12a和Cas12b效应蛋白等在基因编辑领域均有广泛应用。Cas12c系统归类于CRISPR-Cas系统第二大类V-C型,与sg RNA(tracr RNA、cr RNA)结合指导切割靶双链DNA,已经确定的是在V-C型CRISPR-Cas系统中存在两种效应蛋白:Cas12c1和Cas12c2,这两种效应蛋白在PAM识别序列方面较为独特,与其他CRISPR V型系统相比所需要识别的PAM序列较少,仅需识别1-nt至2-nt长度的PAM序列,较少的PAM序列方便了核酸的工程性设计,在基因组编辑中扩大了对于靶DNA的选择空间;但Cas12c效应蛋白的酶切机制在此之前尚不明确。本研究将从结构生物学的角度解释Cas12c1效应蛋白独特的PAM识别特性和DNA切割的分子机制。我们成功解析了Cas12c1-sg RNA-DNA三元复合物晶体结构,结合体外生化实验对Cas12c1效应蛋白的结构和分子机制进行了总结和分析:(1)发现在Cas12c1-sg RNA-ds DNA三元复合物的结构中,Cas12c1蛋白呈现出由REC lobe(α-helical recognition lobe)和NUC lobe(Nuclease lobe)组成的紧凑的双叶结构,两个lobe之间形成带有大量正电荷的通道结合有RNA-DNA异源双链体;(2)通过体外生化实验验证了Cas12c1效应蛋白识别PAM序列为5’-TG-3’,在研究中发现残基R152、N299和R374的侧链分别与d T(-2*)、d G(-1*)之间形成氢键,与其他Ⅴ型CRISPR系统不同的是Cas12c1的d G(-1*)与d A(-2)之间也形成了氢键,并且Cas12c1效应蛋白中的PI loop环插入NTD链的PAM区,直接参与靶DNA链的识别与解旋,这几点或许是Cas12c1效应蛋白的PAM区较为特别的一个原因。探究Cas12c1效应蛋白识别PAM序列的机制,为未来改造CRISPR效应蛋白提供一个思路;(3)PAM区识别后靶双链DNA解旋,TD(Target DNA)链与部分sg RNA结合形成异源双链体,其中sg RNA中的C(1)～C(7)作为seed region对Cas12c1效应蛋白异源双链体的形成是必不可少的;WED结构域中的β1链和REC1结构域中的helix-α8对靶双链DNA的解旋和促进异源双链的形成有重要作用;(4)确定了位于Ruv C结构域中氨基酸D969、E1060和D1266是Cas12c1主要的酶切活性位点,且部分Ruv C结构域和部分Nuc结构域中的β发夹结构形成一个酶切口袋包裹着酶切位点,该酶活口袋能够将TD链和NTD链送至酶切位点;(5)不同于其他Ⅴ型CRISPR-Cas系统的是,当解旋后的NTD链与TD链甩到酶切位点后,Cas12c1效应蛋白对这两者几乎同时进行切割,且仅形成单一的切割位点,这一特性有助于将Cas12c1设计为高保真的基因组编辑工具;确定了24-bp长度以上的靶双链和16-nt长度以上的靶单链DNA能够激活Cas12c1-sg RNA效应复合物的DNase活性;本研究的实验方法和结果分析为Ⅴ-C型CRISPR效应蛋白的应用提供更加丰富准确的结构基础,阐明了Cas12c1-sg RNA效应复合物识别并靶向切割DNA的机制,为CRISPR-Cas12c1系统投入基因组编辑等领域提供有价值的理论依据。

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粪肠球菌噬菌体裂解酶LysIME-EF1三维结构与分子作用机理研究

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作者：周彪福建师范大学

学位级别：硕士

在全球范围内,随着抗生素滥用现象越来越严重,越来越多的致病菌表现出多种耐药性。因耐药细菌感染而导致死亡的人数在逐年攀升,迫切需要研究出新型抗菌制剂。噬菌体及其裂解酶因高效且专一的杀菌能力,使其在新型抗菌试剂的研发中展现出... 详细信息

在全球范围内,随着抗生素滥用现象越来越严重,越来越多的致病菌表现出多种耐药性。因耐药细菌感染而导致死亡的人数在逐年攀升,迫切需要研究出新型抗菌制剂。噬菌体及其裂解酶因高效且专一的杀菌能力,使其在新型抗菌试剂的研发中展现出非凡活力。粪肠球菌（Enterococcus faecalis,简称***）属于革兰氏阳性菌,又名粪链球菌,是一种普遍存在于人或动物肠道、口腔及生殖道内的正常菌群,当其在体内异位寄生时可引起人的心内膜炎、脑膜炎、败血症、泌尿道感染及化脓性腹部感染等多种疾病。近年来由于多重耐药性粪肠球菌的频繁出现导致抗菌治疗愈发困难,人类健康受到巨大威胁。在前期的研究中,噬菌体裂解酶Lys IME-EF1能够高效的裂解***,尤其对近30株临床上引起多种疾病的致病性粪肠球菌具有高效的裂解活性,显示出具有巨大的潜在应用价值。研究发现Lys IME-EF1的N端为CHAP结构域（cysteine,histidine-dependent amidohydrolases/peptidases domain）,中间为一段Linker区,C端为细胞壁结合结构域（Cell-wall binding domain,CBD）。为了阐述Lys IME-EF1高效裂解粪肠球菌临床株的分子机理,我们通过X-射线晶体衍射确定了它的三维结构。出人意料的是,裂解酶Lys IME-EF1显示出独特的三维结构,其整体结构由一分子全长的Lys IME-EF1和额外的三分子CBD形成异源四聚体,通过深入分析这一新颖的结构,发现在Lys IME-EF1基因ORF内502-504位编码的甲硫氨酸密码子（ATG）的上游有一个核糖体结合位点（Ribosomal binding site,RBS）,这是导致Lys IME-EF1额外三分子CBD产生的原因。随后,研究发现Lys IEM-EF1独特的异源四聚体结构赋予其高效裂解粪肠球菌临床株的能力,破坏Lys IME-EF1 CBD四聚体结构几乎消除了其对粪肠球菌临床株的裂解能力。在此基础上,本研究通过流式细胞分筛技术以及细胞裂解实验等方法找到了Lys IME-EF1 CBD结合细胞壁的关键氨基酸。总之,该研究首次从结构与功能角度阐明了粪肠球菌噬菌体中的单个基因编码多组份裂解酶的作用机理,对多重耐药性粪肠球菌的抗菌药物开发具有重大意义。

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基于生物学科项目化学习培养劳动素养的策略研究

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作者：刘国锋福建师范大学

学位级别：硕士

劳动教育是中国特色社会主义教育制度的重要组成部分,能够发挥全面育人,全方位育人的重要作用,将劳动教育纳入人才培养的全过程是大势所趋。目前,劳动素养的培养多见于劳动课程和综合实践活动中,在生物学科当中培养劳动素养的研究较少... 详细信息

劳动教育是中国特色社会主义教育制度的重要组成部分,能够发挥全面育人,全方位育人的重要作用,将劳动教育纳入人才培养的全过程是大势所趋。目前,劳动素养的培养多见于劳动课程和综合实践活动中,在生物学科当中培养劳动素养的研究较少。此外,项目化学习具有很强的实践性、综合性、真实性等特点,且能够深化学生对核心概念的理解,引发学生跨情境的思考和实践,能有效的发展学生的核心素养等。因此,本研究旨在探索基于生物学科项目化学习培养劳动素养的策略。本研究改变传统的教学方法,利用生物学科项目化学习,提出基于生物学科项目化学习培养劳动素养的策略,为一线教师在生物学教学中有效的培养劳动素养提供借鉴。首先,通过调查法对当下生物学科教学中劳动素养培养现状,以及学生劳动素养水平现状进行问卷调查,以调查结果作为提出策略的事实依据;其次,通过文献法从劳动素养的内涵、生物学科特点及项目化学习的模式等方面整合理论依据;再者,从教学目标、情境设计、活动设计、教学评价等角度提出了基于生物学科项目化学习培养劳动素养的策略,进而运用本研究所提出的策略设计并实施了基于生物学科项目化学习培养劳动素养的教学实验,教学实践后,对照班与实验班之间在劳动素养上存在显著差异(p=0.001,p<0.05),验证了策略的有效性。研究成果如下:1.通过学生问卷和教师问卷调查了当下学生的劳动素养水平以及劳动素养培养现状,结果表明:学生对劳动价值观具有较正确的认知,但缺乏劳动实践,劳动习惯、创新能力和意识较差。教师对劳动素养培养的重要性及其意义的认识尚待提升,在学科教学中培养劳动素养缺乏有效的途径,具体实施较少。2.综合劳动素养、项目化学习等相关文献、初中学生劳动素养水平现状和初中教师劳动素养培养现状,提出了基于生物学科项目化学习培养劳动素养的策略,包括:(1)“融合劳动与生物学科核心素养,重设教学目标”,(2)“联系生活实际,创设真实劳动情境”,(3)“课内课外相结合,丰富活动设计”,(4)“挖掘教材内容,增添劳动元素”,(5)“以评价促发展,完善项目评价”。

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嗜肺军团菌效应蛋白Lem17结构及功能研究

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作者：钟文红福建师范大学

学位级别：硕士

乙酰化修饰是一种由乙酰基转移酶介导的蛋白质翻译后修饰,在许多基本的生物学过程中起着重要的调节作用。越来越多的研究表明蛋白质乙酰化修饰在病原菌的致病过程中具有重要作用。嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是引起一种急性... 详细信息

乙酰化修饰是一种由乙酰基转移酶介导的蛋白质翻译后修饰,在许多基本的生物学过程中起着重要的调节作用。越来越多的研究表明蛋白质乙酰化修饰在病原菌的致病过程中具有重要作用。嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是引起一种急性肺炎的革兰氏阴性致病菌,可由空气传播侵染人类肺泡巨噬细胞。嗜肺军团菌通过其特有的四型分泌系统转运330多种效应蛋白至宿主细胞,干扰宿主细胞功能,形成含有军团菌的液泡（Legionella-containing vacuole,LCV）以在宿主细胞中存活并复制。在课题前期,我们利用生物信息学分析预测发现嗜肺军团菌分泌多个可能具有乙酰基转移酶活性的效应蛋白。但是,目前针对嗜肺军团菌效应蛋白介导宿主靶蛋白乙酰化修饰的研究鲜有报道。在本研究中,我们利用分子生物学及结构生物学的研究方法鉴定出嗜肺军团菌效应蛋白Lem17（Lpg1949）为乙酰转移酶,并探究了其乙酰化修饰活性及对宿主靶蛋白的调控机制,为嗜肺军团菌利用乙酰化修饰调控宿主细胞免疫反应的分子机制提供参考。本文的主要研究结果具体如下:（1）Lem17具有乙酰转移酶的活性,且其活性依赖于宿主细胞中IP6的激活。（2）为阐明Lem17乙酰化修饰机制,我们解析了Lem17-IP6二元复合物结构,通过结构分析结合ITC实验发现氨基酸R45、K46、R50、R53、K187、K278、R281及R222是Lem17与IP6结合的关键氨基酸。此外,通过结构比对分析发现Lem17具有Yop J乙酰转移酶家族保守的C-H-D催化三联体,分别对应氨基酸C174、H105及D124。这些氨基酸的突变则导致Lem17的乙酰化活性丧失。（3）为探究Lem17的生物学功能,我们通过免疫沉淀耦合质谱技术鉴定其在宿主细胞内的靶标。研究发现Lem17靶向宿主JAK1激酶,并能够对JAK1的FERM-SH2以及JH1结构域的多个赖氨酸进行乙酰化修饰。Lem17介导的JAK1乙酰化修饰则会抑制JAK-STAT信号通路的激活。综上所述,本研究鉴定出嗜肺军团菌效应蛋白Lem17是一个Yop J家族样乙酰基转移酶,含有C-H-D催化基序;阐明了其乙酰转移酶活性且特异性结合辅助因子IP6的分子机制;揭示了Lem17选择性乙酰化修饰宿主细胞的JAK1进而抑制JAK-STAT通路,本文的研究结果为嗜肺军团菌效应蛋白介导的乙酰化修饰机制提供了重要的参考。

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嗜肺军团菌效应蛋白Lpg2433结构及其功能初探

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作者：陈海航福建师范大学

学位级别：硕士

嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性致病菌,能够感染人体肺泡巨噬细胞引起严重肺炎,即军团菌病。在入侵宿主细胞后,嗜肺军团菌通过其Ⅳ型分泌系统将330多个效应蛋白转运至宿主细胞中,干扰宿主细胞的多种细胞进程,以形成其生存和复制所需的场所... 详细信息

嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性致病菌,能够感染人体肺泡巨噬细胞引起严重肺炎,即军团菌病。在入侵宿主细胞后,嗜肺军团菌通过其Ⅳ型分泌系统将330多个效应蛋白转运至宿主细胞中,干扰宿主细胞的多种细胞进程,以形成其生存和复制所需的场所——含嗜肺军团菌囊泡(LCV)。LCV的形成与宿主细胞的内质网密切相关。研究表明在感染过程中,嗜肺军团菌能够通过不同的策略调控宿主细胞内质网的稳态。而内质网作为细胞内重要的细胞器之一,参与胞内蛋白的成熟及转运,其稳态与细胞的存活及免疫反应密切相关。非折叠蛋白反应是维持内质网稳态的重要机制之一,参与细胞的天然免疫反应,在宿主细胞抵抗病原体入侵中具有重要作用。因此,阐明嗜肺军团菌调控宿主细胞内质网的非折叠蛋白反应以确保自身在宿主细胞内的生存和复制的分子机制对理解嗜肺军团菌与宿主内质网的关系具有重要意义。本文中,我们发现嗜肺军团菌效应蛋白Lpg2433可以抑制宿主细胞的非折叠蛋白反应,并通过分子生物学及结构生物学方法对其分子机制进行了初步探究。希望通过对效应蛋白Lpg2433功能机制的研究能更好阐明嗜肺军团菌与非折叠蛋白反应之间的关系,为解释病原体与宿主内质网之间的关系提供参考。本课题的主要结果如下:1、Lpg2433在细胞内过表达后能够抑制细胞内质网非折叠蛋白反应,下调非折叠蛋白反应相关受体蛋白PERK和ATF6以及其下游响应蛋白ATF4和CHOP的表达水平。2、通过qRT-PCR方法分析发现Lpg2433不影响非折叠蛋白反应相关蛋白的m RNA转录水平,推测Lpg2433的抑制作用可能是在蛋白水平。3、为揭示Lpg2433抑制非折叠蛋白反应的机制,我们通过免疫沉淀结合质谱鉴定的方法筛选Lpg2433的宿主靶标,发现Lpg2433与非折叠蛋白反应相关蛋白BiP直接相互作用。此外,Lpg2433 C末端的无序区域480-586主要参与与BiP的结合。4、通过X-射线衍射方法成功解析Lpg2433(1-331)蛋白的晶体结构,分辨率为2.4?。通过结构比对我们发现Lpg2433可能存在由半胱氨酸、组氨酸及谷氨酰胺组成的催化三联体C-H-Q。但通过点突变实验验证发现Lpg2433抑制非折叠蛋白反应的作用不依赖该催化三联体C-H-Q。综上所述,我们发现了嗜肺军团菌效应蛋白Lpg2433能够抑制非折叠蛋白反应,并鉴定出与Lpg2433互作的宿主的靶标蛋白BiP及解析了Lpg2433蛋白晶体结构。但关于Lpg2433抑制非折叠蛋白反应是否依赖于宿主BiP及其具体的分子机制还有待进一步探究。

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Cas12i1-crRNA二元复合物的结构生物学研究

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作者：李煜福建师范大学

学位级别：硕士

CRISPR-Cas（Clustered regμlarly interspaced short palindromic repeats and CRISPRassociated proteins,规律成蔟的短间隔回文重复序列和CRISPR相关蛋白）系统最早在细菌和古细菌中发现,提供抵抗噬菌体侵染的能力。拥有CRISPR系统... 详细信息

CRISPR-Cas（Clustered regμlarly interspaced short palindromic repeats and CRISPRassociated proteins,规律成蔟的短间隔回文重复序列和CRISPR相关蛋白）系统最早在细菌和古细菌中发现,提供抵抗噬菌体侵染的能力。拥有CRISPR系统的细菌和古细菌能够“记住”曾经入侵的外源核酸信息,并提供适应性免疫能力。经历了近三十载的研究之后,科学家们对CRISPR-Cas系统进行了功能和结构上的区分。由多个Cas蛋白组成Cascade复合体来发挥靶向干扰功能的CRISPR-Cas系统被归为第一大类,这类CRISPR-Cas系统由于基因组较为复杂,且效应复合体由多亚基组成使得其在应用上受到限制。第二大类CRISPR-Cas系统的组成则更为简单,由含有多个结构域的单个Cas蛋白来发挥干扰功能,这类Cas蛋白通常结构较为复杂,多个结构域各自行使不同的功能。由于第二大类CRISPR-Cas系统的组成简单,具备对切割位点的重编程能力,其中最著名的II型CRISPR-Cas9系统在2013年便已有了在哺乳动物细胞中进行基因组编辑的案例。在这之后新发现的V型CRISPR-Cas系统具有与Cas9不同的切割方式,其中Cas12a、Cas12b等均已被成功应用于基因组编辑。对新发现的CRISPR-Cas系统的研究有助于拓展基因组编辑方式,同时对CRISPR的进化分析提供更深入的了解。Cas12i1是第二大类V型CRISPR-Cas系统中新发现的效应蛋白,其切割双链ds DNA底物的非目标链即NTD链（Non Target strand）的活性要明显高于切割目标链即TD链（Target strand）的活性,Cas12i1的这种酶切活性在经过改造之后可用于高特异性的基因组编辑。本文解析了Cas12i1-crRNA二元复合物的晶体结构,并对结构进行了详细的分析,结合生化实验,对Cas12i1的功能和机制进行了总结。Cas12i1对DNA底物切割共分为两种不同的机制:Cis（顺式）切割和Trans（反式）切割。Cas12i1的Cis切割活性指的是Cas12i1在crRNA的指导下对与crRNA互补配对的靶ds DNA的TD链和NTD链进行序列特异性的定向切割,通常使靶ds DNA产生一个错位的双链断裂（Double strand break,DSB）,在体外生化分析实验中我们也观察到Cas12i1对靶ds DNA中对与crRNA的非互补链NTD的切割活性要明显高于对与crRNA的互补链TD的切割活性。Cas12i1的Trans切割活性则在由crRNA与靶ds DNA结合并产生序列特异性的Cis切割之后激活,Cas12i1可以结合环境中的任意单链ss DNA,产生序列非特异性的Trans切割活性,从ss DNA的5’端开始进行连续性的切割。此外,在我们得到的Cas12i1-crRNA二元复合物晶体结构中观察到了与crRNA结合的来源于大肠杆菌的伪靶寡核苷酸,模拟了靶DNA与crRNA的识别。同时在与本实验室其他成员所解析的Cas12i1-crRNA-Target三元复合物进行叠合分析后发现二元复合物中的PI（PAM Interaction）结构域在Cas12i1结合靶ds DNA的过程中经历了打开-关闭的动态变化过程,同时也观察到了其它结构域中发生的构象变化以激活Cas12i1的核酸内切酶活性。本研究为Cas12i1开发成为可靠的基因组编辑工具提供了有价值的见解。

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