检索结果-南通市图书馆

作者：余婷福建师范大学

学位级别：硕士

蛋白酶体是大型多亚基蛋白酶复合体,由20S核心颗粒(core particle,CP)和不同种类的调节颗粒(regulatory particle,RP)两部分组成。其中蛋白酶体调节颗粒作为蛋白酶体的重要组成部分之一,参与调控许多重要信号通路的蛋白质降解,在维持细... 详细信息

蛋白酶体是大型多亚基蛋白酶复合体,由20S核心颗粒(core particle,CP)和不同种类的调节颗粒(regulatory particle,RP)两部分组成。其中蛋白酶体调节颗粒作为蛋白酶体的重要组成部分之一,参与调控许多重要信号通路的蛋白质降解,在维持细胞稳态中发挥重要作用。目前已陆续解析了三类蛋白酶体调节颗粒及其与20S CP的蛋白酶体复合物结构,这些结构信息为深入了解蛋白酶体的作用机制及其在癌症治疗领域的药物设计提供重要的参考信息。本文的研究对象,人类蛋白酶体调节颗粒200(PA200)是一种单链ATP非依赖性蛋白酶体调节颗粒,可以与人类的20S CP结合形成蛋白酶体复合物,催化乙酰化组蛋白的多泛素非依赖性降解,在DNA修复和精子发生中发挥重要作用。本论文首先通过昆虫表达系统过表达PA200,纯化获得PA200单体蛋白,在体外与人源20S CP拼装获得PA200-20S CP复合物,通过酶活测定,证明本实验中所使用的20S CP和PA200-20S CP复合物蛋白均具有一定的糜蛋白酶活性,且PA200-20S CP复合物的糜蛋白酶活性高于单独的20S CP,说明PA200作为蛋白酶体调节颗粒可以增强20S CP的糜蛋白酶活性;为了进一步探究PA200调节20S CP活性的分子机制以及PA200的底物识别机制,本研究利用冷冻电镜技术(cryo electron microscopy,cryo-EM)解析了人源蛋白酶体调节颗粒PA200单体2.72?以及PA200与20S CP复合物3.75?分辨率结构。从整体上看,PA200呈现穹顶状结构,覆盖在20S CP的一端;本论文进一步深入分析了PA200与20S CP结合界面氨基酸(aa)残基之间的相互作用,阐明了PA200诱导20S CP通道打开的分子机制:PA200利用C-末端的Hb YX基序(YYA)诱导20S CPα-环重排从而使20S CP结合PA200一端的通道打开。此外,通过与PA200酵母同源蛋白Blm10结构的比对,我们发现PA200上存在两个由带正电荷的氨基酸残基组成的独特开口,且这两个开口均结合了额外的电子云密度,根据其独特的电子云密度推断它们可能是肌醇磷酸酯5,6-[PP]-Ins P4和Ins P6。进一步的高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)实验表明两个开口结合的小分子确实是5,6-[PP]-Ins P4和Ins P6,这类小分子在组蛋白去乙酰化过程中发挥了重要作用,因此我们推测PA200结合此类物质的能力可能与溴样结构域(BRDL)识别乙酰化H4组蛋白,以及PA200-20S CP复合物降解乙酰化组蛋白之间存在某种关联,这也为后续继续揭示PA200-20S CP蛋白酶体复合物识别并降解乙酰化组蛋白提供了思路,并由此推测这两个开口很可能是底物经由PA200进入20S CP的通道。同时,为了分析PA200的乙酰化识别机制,本论文首先将PA200的BRDL结构和序列与典型的人类BRD家族进行对比分析,发现PA200的BRDL只有82个氨基酸残基,且ZA环明显较短,明显区别于典型的人类BRD家族,因此不能将PA200划分到八个典型的人类BRD家族之中。本研究进一步探究了PA200与不同个数乙酰化位点H4组蛋白多肽的相互作用关系,初步推测在体外环境下组蛋白需要一个以上的Kac位点才可以与PA200结合,有可能还需要额外的翻译后修饰帮助两者的结合。总之,本研究结果为研究人类PA200介导的底物降解过程中20S CP通道打开的分子机制以及探索PA200在乙酰化介导的蛋白酶体降解中识别H4组蛋白的机制提供了重要的参考。

关键词： PA200 PA200-20S CP复合物结构冷冻电镜

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嗜肺军团菌效应蛋白LidE的功能初探

嗜肺军团菌效应蛋白LidE的功能初探

作者：何达明福建师范大学

学位级别：硕士

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一类可引起被称为“军团病”的重症肺炎的机会致病菌。该细菌侵染人肺泡巨噬细胞后,引起发热伴随脏器损伤进而导致人由于器官衰竭而死亡。嗜肺军团菌的致病性依赖于其独特的IVB型分泌系统（Type ... 详细信息

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一类可引起被称为“军团病”的重症肺炎的机会致病菌。该细菌侵染人肺泡巨噬细胞后,引起发热伴随脏器损伤进而导致人由于器官衰竭而死亡。嗜肺军团菌的致病性依赖于其独特的IVB型分泌系统（Type IVB Secretion system,T4BSS）,其中IVB分泌系统向宿主细胞内转运的效应蛋白对于细菌侵染宿主以及胞内生长繁殖至关重要。近年来研究人员发现军团菌效应蛋白可介导多种蛋白质翻译后修饰,如腺苷酸化修饰（AMPylation）,以促进细菌感染以及胞内生长。实验室前期解析了效应蛋白LidE（Lpg2406）的晶体结构,尽管其与腺苷酸转移酶Fic（Filamentation induced by c AMP）家族的结构高度相似,但LidE却不具有腺苷酸转移酶的活性。为探究效应蛋白LidE的生物学功能,本研究以嗜肺军团菌效应蛋白LidE为研究对象,结合结构生物学、体外生化实验和细胞功能试验等方法解析LidE的功能,阐明LidE在嗜肺军团菌感染过程中发挥的生物学功能。本论文的主要研究结果如下:（1）通过高通量筛选及等温滴定量热实验（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）验证发现LidE特异性结合核苷酸分子UTP及UDP。（2）通过X-射线晶体衍射技术解析了LidE-UTP-Mn以及LidE-UDP的复合物结构,并揭示了其UTP/UDP结合口袋及其关键氨基酸S45、R49、R112、及S301。（3）利用UTP类似物UTPαS和Biotin-16-UTP证明LidE具有催化磷酸尿苷化修饰（UMPylation）的酶学活性,且其活性具有金属离子依赖性,如Mn和Zn。（4）通过分析LidE-UDP以及LidE-UTP-Mn复合物结构及点突变实验验证,发现氨基酸R49、D52、Q294及S301对其酶活性至关重要。其中,在LidE-UTP-Mn复合物结构中,氨基酸D52和S301靠近UTP分子α磷酸基团,推测D52、Q294及S301是LidE的催化位点,其中S301起主要的亲核攻击作用。（5）我们使用免疫荧光实验对效应蛋白LidE的亚细胞定位进行探究发现LidE大量分布于细胞核。总之,我们初步证明嗜肺军团菌效应蛋白LidE具有催化UMPylation的酶学活性,且发现其可能定位于细胞核发挥功能,我们将继续筛选底物蛋白进而阐述其在嗜肺军团菌侵染宿主过程中发挥的生物学机制。

关键词：嗜肺军团菌 LidE Fic酶磷酸尿苷酸化修饰

小麦秆锈菌效应蛋白AvrSr35触发小麦抗性基因Sr35介导的免疫分子机制的研究

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小麦秆锈菌效应蛋白AvrSr35触发小麦抗性基因Sr35介导的免疫分子...

作者：赵燕波福建师范大学

学位级别：硕士

小麦秆锈病(Wheat Stem Rust)是小麦的一种常见病害,由禾秆锈菌(Puccinia graminis ***)感染引起,流行范围广,传染能力强。1999年乌干达出现的小麦秆锈菌新种Ug99对目前商用小麦的特异性抗秆锈基因——核苷酸结合富亮氨酸重复受体(nucle... 详细信息

小麦秆锈病(Wheat Stem Rust)是小麦的一种常见病害,由禾秆锈菌(Puccinia graminis ***)感染引起,流行范围广,传染能力强。1999年乌干达出现的小麦秆锈菌新种Ug99对目前商用小麦的特异性抗秆锈基因——核苷酸结合富亮氨酸重复受体(nucleotide-binding,leucine-rich repeat receptor,NLR)Sr31具有抗性,使全球小麦产业遭受重创。近年来,国际上有近百个小麦抗秆锈基因被筛选,其中来自单粒小麦(Triticum monococcum)的新型抗杆锈病蛋白Sr35可识别Ug99的效应蛋白AvrSr35,使小麦获得对Ug99及其变种的抗性,但其分子机制暂不清楚。本论文利用结构生物学和生物化学策略,以效应蛋白AvrSr35和小麦抗性蛋白Sr35为研究对象,研究效应蛋白AvrSr35与小麦抗性蛋白Sr35的相互作用机制,对深入理解Ug99的致病机理和小麦相关的免疫应答以及制定有效的小麦秆锈病菌的防治措施具有重要作用。首先,本论文通过体外GST-pull down、分子凝胶排阻色谱、分析高速离心以及微量热涌动法验证了AvrSr35和Sr35之间存在较强的相互作用,并测定其解离常数为7.8mM。随后,本论文通过X-ray晶体衍射法解析了AvrSr35的晶体结构,其晶体结构显示:AvrSr35空间结构简单,由两个单分子斜角对称形成二聚体构象,每个单分子由20条长短不一的α-螺旋构成。为探究AvrSr35的二聚化对结合Sr35的影响,本论文分别突变位于AvrSr35二聚化界面的氨基酸D350A和R381A获得其单体,并通过测量其与Sr35的解离常数,发现AvrSr35突变体与Sr35的结合能力与野生型类似,表明AvrSr35与Sr35的结合不依赖于其二聚化。为进一步确定AvrSr35结合Sr35的区域,本论文构建并分析多个AvrSr35蛋白截短体与Sr35的结合能力,结果表明171-558 aa片段是介导结合Sr35的核心片段,其中P480-I505 aa构成的loop除外。据文献报道,激活的NLRs会寡聚形成抗病小体发挥免疫功能。在ATP存在的条件下,Sr35经AvrSr35激活后可由ATP诱导形成Sr35抗病小体。通过冷冻电镜技术,本论文收集了一套3.4(?)的Sr35抗病小体结构数据,通过密度图分析得知,Sr35抗病小体由两个Sr35-AvrSr35复合物聚集而成的五聚体相向连接而成。通过对Sr35蛋白的氨基酸序列比对、同源建模及分子对接实验进一步表明,AvrSr35的结合引起Sr35 NOD结构域的重排,而ATP的插入会稳定NOD结构域的激活构象,进一步诱导Sr35的寡聚,最终形成抗病小体。综上,本论文从结构生物学的角度对小麦秆锈菌Ug99的效应蛋白AvrSr35激活小麦抗性蛋白Sr35的分子机制进行初探,提出了抗性蛋白直接识别病原体机制的分子模型。

关键词：小麦秆锈病效应蛋白AvrSr35 植物免疫受体Sr35 结构生物学

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Lgt家族效应蛋白识别底物的结构机制

Lgt家族效应蛋白识别底物的结构机制

作者：李祥亮福建师范大学

学位级别：硕士

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)是一种引发人类严重肺炎的军团菌病的革兰氏阴性病原体。嗜肺军团菌感染宿主细胞后通过其特有的IVB型分泌系统向宿主细胞分泌300多种效应蛋白。这些效应蛋白介导多种蛋白质翻译后修饰,如泛素化、乙... 详细信息

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)是一种引发人类严重肺炎的军团菌病的革兰氏阴性病原体。嗜肺军团菌感染宿主细胞后通过其特有的IVB型分泌系统向宿主细胞分泌300多种效应蛋白。这些效应蛋白介导多种蛋白质翻译后修饰,如泛素化、乙酰化及糖基化等,在感染期间发挥不同的生物学功能。糖基化修饰是在糖基转移酶作用下,将糖基转移至底物蛋白质并形成糖苷键的过程,糖基化修饰与蛋白质的合成和致病菌的毒力有关。嗜肺军团菌编码的糖基化修饰相关的效应蛋白包括Lgt家族效应蛋白(包括Lgt1、Lgt2和Lgt3)、LtpM、SidI及SetA等,其中Lgt家族效应蛋白以UDP-葡萄糖为供体糖基化修饰宿主细胞延伸因子1A(eukaryotic elongation factor 1A,eEF1A)的第53位丝氨酸,抑制宿主细胞的蛋白质翻译。尽管Lgt1的结构已解析,但Lgt家族效应蛋白识别底物eEF1A的分子机制暂还不清楚。本研究以嗜肺军团菌糖基转移酶Lgt3为研究对象,以结构生物学手段解析Lgt3的结构,通过结构分析和体外糖基转移酶活性检测以探究Lgt家族效应蛋白识别底物的分子机制:(1)本研究通过X射线晶体衍射技术解析了Lgt3的106-610位氨基酸的蛋白质结构,发现Lgt3包含四个结构域,分别是NTD结构域、GT结构域、PD结构域和CTD结构域。(2)Lgt家族效应蛋白以保守的保留催化机制将UDP-葡萄糖的葡萄糖基转移至底物。与GT-A糖基转移酶家族类似,Lgt3的GT结构域保守性较高,包含两个Rossmann fold结构域,且其催化中心拥有经典的DxD基序,对DxD基序的双突变会导致糖基转移酶活性的丧失。(3)结构比对发现Lgt家族效应蛋白的整体结构存在差异:Lgt1的NTD结构域与GT结构域横向堆叠,形成细长的整体结构;Lgt2的NTD-Ⅱ结构域和PD结构域形成GT结构域的突起,将NTD-Ⅰ结构域夹在中间,形成紧凑的整体结构;而Lgt3的NTD-Ⅰ结构域和CTD结构域更为灵活,致使这部分结构无法解析。(4)Lgt家族效应蛋白可以通过抑制宿主蛋白质的合成进而抑制宿主未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR),但我们的实验表明Lgt家族结构上的差异性并不会对UPR的抑制程度产生差异。而当我们在体外检测Lgt家族效应蛋白的糖基转移酶活性时,却发现Lgt家族对eEF1A衍生十肽有不同的活性:Lgt1因其底物识别口袋E445和E446残基的存在而带大量负电荷,能够识别eEF1A衍生十肽中的正电残基K51和K53,使其活性较高;相反,Lgt2具有带正电荷的底物识别口袋,与带正电的十肽有静电排斥作用,因而活性较低。当eEF1A衍生的HLH作为底物时,Lgt2带正电荷的底物识别口袋与HLH的负电荷区域相互作用,因而有较高的亲和力;相反,静电排斥作用使得Lgt1对HLH几乎没有活性。而Lgt3对十肽和HLH都显示出较高的糖基转移酶活性,表明其底物识别机制与Lgt1和Lgt2不相同。综上所述,我们的研究表明Lgt家族效应蛋白识别底物eEF1A的机制各不相同。这些结果为糖基转移酶的作用机制提供了结构基础,突出了糖基转移酶在嗜肺军团菌生命周期中的重要作用。

关键词：嗜肺军团菌 Lgt家族效应蛋白结构生物学真核延伸因子1A

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细菌从头合成生物素分子机制的研究

细菌从头合成生物素分子机制的研究

作者：张思韬福建师范大学

学位级别：硕士

微生物从头合成生物素主要经历两个阶段,第一阶段为庚二酸单酰Co A/ACP(pimeloyl-Co A/ACP)的催化合成。第二阶段是生物素双杂环的催化合成。相对于第一阶段,第二阶段在不同微生物之间相对保守主要由BioF、BioA、BioD和BioB依次催化合... 详细信息

微生物从头合成生物素主要经历两个阶段,第一阶段为庚二酸单酰Co A/ACP(pimeloyl-Co A/ACP)的催化合成。第二阶段是生物素双杂环的催化合成。相对于第一阶段,第二阶段在不同微生物之间相对保守主要由BioF、BioA、BioD和BioB依次催化合成。庚二酸单酰Co A/ACP主要有三条途径合成:BioC-BioH途径、BioI-BioW合成途径以及BioZ途径。目前为止,BioC-BioH途径和BioI-BioW途径的分子机制阐述的较为清楚,而BioZ的分子机制依旧不清晰。首先,本文通过蛋白质晶体结构生物学方法解析了分辨率为1.58(?)弗朗西斯氏菌BioJ蛋白的晶体结构和分辨率为1.99(?)根瘤农杆菌BioZ蛋白的晶体结构。通过与BioH结构比对发现BioJ的催化中心为S151、D248和H278。BioJ的体外酶活反应发现BioJ可以催化戊二酸单酰ACP乙酯、庚二酸单酰ACP甲酯和庚二酸单酰乙酯。通过无根进化树的建立,发现BioZ属于β-酮酯-ACP聚合酶家族。将BioZ的结构与Fab H的结构进行比对发现BioZ的催化中心为C115、H255和N285。通过体外脂肪酸合成体系,鉴定出BioZ的底物为庚二酸单酰Co A/ACP和丙二酸单酰ACP。通过ITC分别测得BioZ与庚二酸单酰Co A/ACP和丙二酸单酰ACP的亲和力,发现BioZ与庚二酸单酰Co A/ACP的亲和力较大。有意思的是在BioZ反应口袋底部带正电荷的S84、R147和S287可以有效的中和戊二酸单酰Co A/ACP的脂酰基尾端羧基带的负电荷,且这三个氨基酸在BioZ识别戊二酸单酰Co A/ACP时起到关键作用。综上所述,本篇文章解析了弗朗西斯氏菌的BioJ蛋白和根瘤农杆菌BioZ蛋白的晶体结构,并鉴定出了BioJ蛋白和BioZ蛋白的反应机制。并提出了BioZ识别底物的分子模型。

关键词：生物素生物素合成 BioJ BioZ

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嗜肺军团菌效应蛋白Lem26结构功能探究

嗜肺军团菌效应蛋白Lem26结构功能探究

作者：王嘉君福建师范大学

学位级别：硕士

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一种寄生在胞内的革兰氏阴性致病细菌,通过IV型分泌系统分泌300多个效应蛋白作为武器调控宿主细胞功能,进而在宿主细胞中完成增殖并感染宿主,最终引起社区获得性肺炎（也称为“空调病”）等呼吸... 详细信息

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一种寄生在胞内的革兰氏阴性致病细菌,通过IV型分泌系统分泌300多个效应蛋白作为武器调控宿主细胞功能,进而在宿主细胞中完成增殖并感染宿主,最终引起社区获得性肺炎（也称为“空调病”）等呼吸系统疾病。近年来嗜肺军团菌耐药性问题也十分突出,这对公共卫生安全造成了极大地威胁,因此对嗜肺军团菌的致病机理的研究迫在眉睫,这将为疾病治疗、药物研发等方面提供借鉴。最近有研究报道了一种新型非经典泛素化途径,由嗜肺军团菌效应蛋白Sid Es家族介导。Sid Es家族效应蛋白利用其m ART结构域的ADP核糖基转移酶活性催化泛素（Ubiquitin,Ub）形成ADPr-Ub,随后其PDE结构域发挥磷酸二酯酶活性将ADPr-Ub水解为Pr-Ub并以共价的方式将Pr-Ub连接至底物或自身的丝氨酸上,实现对底物的泛素化修饰。Sid Es家族可以催化多种不同底物蛋白的非经典泛素化,包括小G蛋白（small GTPase）家族的Rab和Rag、Reticulon-4（Rtn4）以及Sid E蛋白本身,从而调控细胞多个信号通路,这一反应削弱了传统的泛素化级联,导致依赖于泛素的细胞过程紊乱。本课题研究对象军团菌效应蛋白Lem26（Lpg2523）具有类似于Sid Es家族蛋白功能的结构域:VIP2结构域和PDE结构域,二者可能分别具有ADP核糖基转移酶活性和磷酸二酯酶活性,但目前尚不清楚该效应蛋白在军团菌侵染宿主过程中的具体功能。那么Lem26是否也参与调控了宿主细胞的非经典泛素化过程?或者它通过新的机制调控宿主的某一通路?带着这个科学问题,我们以Lem26为研究对象,结合生物信息学、细胞生物学、分子生物学与结构生物学等技术对Lem26在宿主细胞内发挥的生物学功能进行了探索。通过生物信息学分析,我们推测Lem26可能具有ADP核糖基转移酶和磷酸二酯酶两种酶的活性。并且,Lem26与Sid Es家族在序列上具有同源性,关键酶活位点也具有保守性。为了验证Lem26是否也参与了非经典泛素化调控,我们首先通过在细胞内过表达Lem26,初步证明了Lem26具有ADP核糖基转移酶和磷酸二酯酶活性。进一步检测了Ub是否被Lem26进行ADP-核糖基化修饰,以及ADPr-Ub是否能被Lem26水解,结果表明Lem26并不能修饰Ub,以及水解ADPr-Ub,也就表明Lem26并不参与调控此类非经典泛素化过程。为了探究Lem26如何通过ADP核糖基转移酶活性和磷酸二酯酶活性调控宿主细胞信号通路,我们利用IP实验找到了疑似与Lem26相互作用的底物蛋白,同时使用e Af1521工具蛋白通过Pull-down实验富集被ADPr修饰的蛋白,接着通过质谱进行蛋白质鉴定及蛋白质ADP核糖基化修饰鉴定,将6次质谱结果进行统计比对分析以及相关文献查阅等,挑选出丰度值在20以上且功能明确的蛋白质,利用Co-IP实验,发现Lem26与已筛选的底物蛋白有相互作用,但是无法对他们进行ADP核糖基化修饰,底物筛选工作还在继续开展。理论上ADP核糖基转移酶可以结合并将NAD+催化生成ADPr,磷酸二酯酶可以将ADPr-底物蛋白水解为AMP和Pr-底物蛋白,这个过程Lem26可以结合NAD、AMP、ADPr和ADP。我们在体外通过荧光热漂移技术检测以上小分子是否可以改变Lem26稳定性,结果显示小分子不影响Lem26稳定性,从而判断他们在体外没有相互作用。为此我们还探究其他小分子与Lem26的相互作用（包括ATP、ADP、AMP、c AMP、GTP、GDP、GMP、UDP、CTP、NADP、TPP、Acetyl-Co A和FAD）,结果未发现可以与Lem26结合的小分子。为了解释以上问题,我们从Lem26结构的角度出发,进一步阐述Lem26的作用,利用大肠杆菌表达系统进行Lem26相关蛋白的表达,通过晶体学技术得到Lem26 VIP2结构域结构分辨率为2.23埃,Lem26 PDE结构域结构分辨率为1.49埃。通过结构分析,发现Lem26 VIP2比传统ART（包括Sid Es家族的m ART）结合NAD的口袋浅且狭小,口袋含有少量正电荷,保守基序R-S-E的氨基酸侧链方向发生改变,与预测的Lem26 VIP2中的R-S-E基序相比,氨基酸侧链方向也不一致。Lem26 PDE与Sid E家族是同源结构,具有保守的催化残基:H545、E602和H676,但组成与核酸作用的口袋的氨基酸具有不保守性,因此口袋构象不同。因此我们推测Lem26需要改变构象才能结合NAD、ADP和ADPr等小分子,从而发挥酶活,进而对底物进行修饰,调控/劫持宿主细胞通路。关于Lem26的工作内容将在博士期间继续探究,旨在为治疗嗜肺军团菌工作提供理论支持。

关键词：嗜肺军团菌效应蛋白 ADP核糖基转移酶磷酸二酯酶晶体

军团菌HEPN-MNT毒素-抗毒素系统的鉴定及生物学功能研究

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军团菌HEPN-MNT毒素-抗毒素系统的鉴定及生物学功能研究

作者：黄志杰福建师范大学

学位级别：硕士

毒素-抗毒素（Toxin-antitoxin,TA）系统广泛存在于细菌、古细菌基因组和原噬菌体中,通常由毒素和抗毒素两种组分构成。自1983首次发现TA系统以来,所有已测序的微生物体内几乎都有TA系统被发现,这些TA广泛参与到细胞的生命活动中,包括... 详细信息

毒素-抗毒素（Toxin-antitoxin,TA）系统广泛存在于细菌、古细菌基因组和原噬菌体中,通常由毒素和抗毒素两种组分构成。自1983首次发现TA系统以来,所有已测序的微生物体内几乎都有TA系统被发现,这些TA广泛参与到细胞的生命活动中,包括维持质粒稳定性、抵御噬菌体侵染和促进持留菌的形成等。根据抗毒素性质和对毒素的中和作用方式,目前TA系统可分为I-VIII型。其中VII型TA系统是近期被发现的一种新型TA系统,抗毒素蛋白通过对毒素蛋白进行翻译后修饰（腺苷酸化、磷酸化等）来抑制毒素活性。研究发现,希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）Hep T通过对m RNA切割来发挥毒性,而抗毒素蛋白Mnt A对Hep T腺苷酸化修饰来中和毒性。HEPN-MNT TA系统广泛存在于细菌中,但关于它的作用机理和研究报道还相对较少。在本研究中,通过生物信息学分析,我们发现,在嗜肺军团菌·费城1号中同样存在着HEPN-MNT TA系统,相关基因组编号为Lpg2920和Lpg2921,编码的蛋白分别具有RXHXY和GSXDXD基序。实验选用大肠杆菌BL21（DE3）表达系统,通过毒性实验研究Lpg2920和Lpg2921是否抑制菌株的生长,预测为抗毒素MNT的Lpg2921蛋白抑制了大肠杆菌的生长,而具有保守基序RXHXY的Lpg2920蛋白却并未表现出毒性。实验结果出乎我们的预料,具有保守基序GSXDXD的Lpg2921异源表达产生毒性的原因是什么,又是哪些因素导致预测为毒素HEPN的Lpg2920蛋白没有毒性,Lpg2920和Lpg2921是否与已解析的HEPN-MNT TA系统存在较大差异。于是我们对Lpg2920和Lpg2921的蛋白进行表达与纯化,在纯化过程中,我们发现,虽然尝试了多种结合方式,Lpg2920和Lpg2921似乎没有结合的趋势。为了验证Lpg2921是否为MNT抗毒素,我们通过荧光热漂移实验进行验证,结果显示在加入ATP和Mg后,Lpg2921的Tm值上升了15.7℃,表明Lpg2921能够结合ATP。为了验证Lpg2920能否被修饰,通过SDS-PAGE分离出混合孵育后的Lpg2920,高效液相色谱-质谱技术进行检测,但并未发现Lpg2920有被修饰过的现象。为了解开Lpg2920和Lpg2921的诸多疑问,本研究运用晶体学方法解析了Lpg2920蛋白和Lpg2921蛋白的晶体结构。通过与已解析的HEPN-MNT结构进行比对,我们发现,Lpg2920蛋白和Lpg2921蛋白与HEPN蛋白和MNT蛋白都具有较高的相似度,这也进一步表明Lpg2920和Lpg2921很可能构成HEPN-MNT TA系统。将Lpg2921保守基序GSXDXD氨基酸残基结构与Mnt A进行比对,我们尝试找到Lpg2921结合ATP的关键位点,主要氨基酸残基包括S47、D48、D50等。同时,我们也在嗜肺军团菌中过表达Lpg2920,以验证其是否具有种属特异性,但并未观察到细胞毒性的产生,这可能是由于肺军团菌蛋白功能冗余所导致。对于Lpg2920活性,我们也进行了体外验证,遗憾的是没有发现哪种核酸能够被Lpg2920切割。对于Lpg2921抑制大肠杆菌生长的原因,我们通过pull-down寻找底物,目前尚未找到哪些蛋白作为Lpg2921底物的可能。本论文通过生物信息学发现了在嗜肺军团菌中可能的HEPN-MNT TA系统。经过序列比对、结构解析等实验分析,都进一步增加了Lpg2920和Lpg2921构成1对TA的可能性。研究中,Lpg2920-Lpg2921与已解析HEPN-MNT之间的差异,表明Lpg2920-Lpg2921可能具有更为复杂的作用机制,实验为嗜肺军团菌的TA系统中和机制的研究提供了实验资料,以期进一步了解不同菌种TA系统的生物学功能,为HEPN-MNT系统的研究提供不同的见解。

关键词：军团菌 HEPN MNT Lpg2920 Lpg2921

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基于图卷积网络的蛋白质可溶性预测

基于图卷积网络的蛋白质可溶性预测

作者：李泽凯福建师范大学

学位级别：硕士

可溶性是蛋白质的一个重要的特征,它可以保证或阻止蛋白质行使其功能,蛋白质可溶也是进行其他研究的前提条件。大肠杆菌是过量表达大多数非糖基化蛋白质的首选宿主。然而,重组蛋白在大肠杆菌的异源表达往往使蛋白质具有不溶性,降低了重... 详细信息

可溶性是蛋白质的一个重要的特征,它可以保证或阻止蛋白质行使其功能,蛋白质可溶也是进行其他研究的前提条件。大肠杆菌是过量表达大多数非糖基化蛋白质的首选宿主。然而,重组蛋白在大肠杆菌的异源表达往往使蛋白质具有不溶性,降低了重组蛋白的产量。通过实验提高重组蛋白的产量这种经验优化通常需要消耗大量的时间和资源,效率较低,因此,需要一个精确的计算模型来预测蛋白质的可溶性。在大规模生物数据的支持下,机器学习建立模型所需的时间和资源相对较少,机器学习预测蛋白质溶解度结合蛋白质工程来提高蛋白质溶解度是一个值得尝试的研究领域。本文分析了对蛋白质可溶性影响的重要因素,对现有的蛋白质可溶性数据库进行了介绍,并对目前已开发的通过机器学习预测蛋白质可溶性的方法进行了整理,从数据集、算法、特征的选取等多个角度对这些方法进行总结和评价。当前已发展的方法存在两个问题:(1)在数据的选择上,多数方法仅考虑蛋白质是否可溶,对于蛋白质的表达系统无太多关注,无法为针对某一特定表达系统提供较好的蛋白质可溶性优化方案;(2)Graphsol是唯一使用蛋白质接触图的方法,然而局限于训练数据库的蛋白质数据丰度较低且都是大肠杆菌蛋白质组蛋白,Graphsol无法为超量表达异源蛋白提供参考。本文基于Graphsol,选择图卷积网络(Graph Convolutional Neural Networks,GCN)作为基础模型,利用Protein Data Bank(PDB)数据库中带有大肠杆菌表达系统标签的数据和Target Track数据库中的部分数据建立新的数据库作为训练数据,旨在提供针对大肠杆菌表达系统的泛用性更好的蛋白质可溶性分类模型。本文从PDB数据库和Target Tacrk数据库中获取蛋白质序列数据,经条件筛选、除冗余以及数据平衡后建立新的训练数据库,并选取蛋白质的序列特征和结构特征构建节点特征矩阵,选取蛋白质接触图构建邻接矩阵,通过图卷积网络进行数据训练,建立分类模型预测蛋白质可溶性。进行模型性能评估时,考虑到本文模型为分类模型,本文选取准确度(Accuracy,ACC),灵敏度,特异度,马修斯相关系数(Matthews correlation coefficient,MCC)作为评估指标。5折交叉验证后,预测的准确度达到了0.827,敏感度为0.840,特异度为0.815,马修斯相关系数为0.654,表明模型的性能较好。本文使用NESG数据库和通过实验验证蛋白质可溶性的实验数据分别对模型进行验证,对NESG数据库的预测准确度为0.532,灵敏度为0.281,特异度为0.746,MCC值为0.071;实验数据均来源于大肠杆菌表达系统,预测准确度为0.666,灵敏度为0.261,特异度为0.857,MCC值为0.394,为以后大肠杆菌表达系统的蛋白质可溶性预测提供新的方向和思路。

关键词：蛋白质可溶性图卷积网络深度学习预测

嗜肺军团菌新型毒素-抗毒素系统HipBST鉴定及中和机制的研究

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嗜肺军团菌新型毒素-抗毒素系统HipBST鉴定及中和机制的研究

作者：吴用宇福建师范大学

学位级别：硕士

毒素抗毒素系统（Toxin-Antitoxin,TA）广泛存在于细菌,古细菌等原核生物中,在原核生物抵御噬菌体侵染、应对环境压力等过程中发挥重要作用。TA系统通常由一个抑制细菌生长的毒素和一个能抵消毒素毒性的抗毒素的双顺反子基因元件组成。... 详细信息

毒素抗毒素系统（Toxin-Antitoxin,TA）广泛存在于细菌,古细菌等原核生物中,在原核生物抵御噬菌体侵染、应对环境压力等过程中发挥重要作用。TA系统通常由一个抑制细菌生长的毒素和一个能抵消毒素毒性的抗毒素的双顺反子基因元件组成。在病原菌中TA系统通常介导持留菌的形成使许多传统的抗生素治疗失效。（1）我们发现嗜肺军团菌一个具有RING型E3泛素连接酶功能的效应蛋白Lpg2370与丝/苏氨酸激酶Hip A的C端具有20%的同源性,特别是负责结合ATP的P-loop是高度保守的。（2）通过Lpg2370的体外磷酸化反应发现其存在自磷酸化的现象,且通过质谱分析发现其在S54位点上进行了自磷酸化。这说明Lpg2370是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,而非是E3连接酶。而随后我们解析了效应蛋白Lpg2370的结构,从结构上也证实了Lpg2370具有典型的激酶结构,整体结构与Hip A＿C有着结构相似性。（3）为了深入研究Lpg2370的功能,鉴于Lpg2370的序列及结构与Hip A＿C有相似性,而hip A与上游的hip B组成一个II型TA。因此,我们通过分析lpg2370在基因组中的位置,意外的发现与lpg2370处于同一个操纵子的基因lpg2369和lpg2368,分别与Hip A＿N以及HipB有较高的序列同源性,这提示我们这三个基因的功能可能与TA有关。接着,我们通过体内毒性实验,发现在军团菌中过表达Lpg2370能够显著抑制军团菌的生长,而共表达Lpg2369和Lpg2368则可以解除Lpg2370对军团菌的生长抑制。此外,我们通过分子排阻色谱与ITC实验发现了Lpg2370和Lpg2369可以形成复合物,并且可以进一步和Lpg2368形成三元复合物,这说明Lpg2370-Lpg2369-Lpg2368组成一个三组分TA。（4）有趣的是,类似的三组分TA系统最近刚刚在致病性大肠杆菌*** O127中被鉴定,并且,通过进化分析发现这样的三组分HipBST TA广泛存在于包括肺炎双球菌等多种病原菌中。HipBST TA中毒素和抗毒素都来源于HipBA中的毒素Hip A的C端和N端,然而,这一新颖的HipBST TA系统的中和机制仍不清楚。为进一步阐明这个三组分HipBST TA系统的中和机制,我们又解析出了p Hip T-Amp-Pnp复合物和Hip T-Hip S复合物的结构。通过比较解析的HipBST中的多个结构,发现Hip T中与ATP结合相关的P-loop在Hip S与Hip T结合后,变成了一个α-helix,通过与p Hip T-Amp-Pnp复合物结构的比较分析发现,P-loop变化后的构象与ATP的结合位置产生冲突。我们通过ITC与Thermal shift实验进一步确定了Hip T可以与ATP结合,而当其形成Hip T-Hip S复合物后则完全失去了与ATP结合的能力。至此我们阐释了嗜肺军团菌HipBST类型TA中毒素被中和的分子机制。综上所述,我们鉴定了嗜肺军团菌中的效应蛋白Lpg2370是一个Hip A样蛋白激酶且与其上游Lpg2368,Lpg2369一同构成一个三组分II型TA系统HipBST,并阐释了该系统的中和分子机制。

关键词： TA系统 HipBA HipBST 晶体结构

嗜肺军团菌蛋白Lpg1168调控c-di-GMP代谢的结构生物学研究

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嗜肺军团菌蛋白Lpg1168调控c-di-GMP代谢的结构生物学研究

作者：王焕楠福建师范大学

学位级别：硕士

嗜肺军团菌是在水生环境中常见的革兰氏阴性菌,这种致病菌可以感染宿主肺泡巨噬细胞,引起严重的非典型肺炎。近年来所报道的由嗜肺军团菌感染的病例逐渐增多,且发现很多嗜肺军团菌株对抗生素药物出现耐药现象,因此我们一直致力于有关嗜... 详细信息

嗜肺军团菌是在水生环境中常见的革兰氏阴性菌,这种致病菌可以感染宿主肺泡巨噬细胞,引起严重的非典型肺炎。近年来所报道的由嗜肺军团菌感染的病例逐渐增多,且发现很多嗜肺军团菌株对抗生素药物出现耐药现象,因此我们一直致力于有关嗜肺军团菌的研究,希望通过对嗜肺军团菌的进一步了解为研发相关治疗药物提供更多信息。c-di-GMP是细菌中广泛存在的第二信使,参与调控细胞运动、生物膜的形成、致病因子的产生和群体感应等多种生理功能。因此c-di-GMP相关信号通路对于细菌的生活发挥着重要作用。Lpg1168是在嗜肺军团菌中编码的串联GGDEF和EAL结构域的复合蛋白。已知GGDEF结构域是位于参与c-di-GMP合成的鸟苷酸环化酶中的保守结构域,EAL结构域是位于参与c-di-GMP降解的磷酸二酯酶中的保守结构域,因此本研究以Lpg1168为主要研究对象,结合生物化学与结构生物学等手段,探究Lpg1168在嗜肺军团菌中参与c-di-GMP代谢的分子机制。本研究首先通过体外ITC实验和荧光热漂移实验检测到含有EAL结构域的Lpg1168截短体蛋白与c-di-GMP有较强亲和力,进而利用结构生物学的方法对Lpg1168/c-di-GMP复合物进行了结构解析,对结构分析发现:（1）与经典的具有EAL结构域的磷酸二酯酶相似,Lpg1168整体呈桶状结构,在其C端有一个c-di-GMP结合口袋。Lpg1168蛋白与c-di-GMP、金属离子的相互作用主要发生在桶状结构内部的β折叠上。（2）与经典的EAL保守结构域不同,Lpg1168蛋白中的保守基序由位于β2折叠上的E49-I50-L51残基构成,且EIL基序中的E49残基对c-di-GMP的结合起着关键作用。（3）对Lpg1168中与c-di-GMP相互作用位点定点突变发现,E49残基、N108残基、E140残基的突变会影响Lpg1168与c-di-GMP的相互作用。综上所述,本研究我们发现Lpg1168是嗜肺军团菌中一个具有磷酸二酯酶活性的蛋白,并阐明了其磷酸二酯酶活性且特异性结合c-di-GMP的分子机制,这为接下来进一步探究Lpg1168如何通过调控c-di-GMP相关信号通路,进而抑制生物膜形成的具体机制奠定基础,以为应对嗜肺军团菌的侵染或治疗嗜肺军团菌肺炎提供见解。

关键词：嗜肺军团菌 c-di-GMP EAL结构域结构生物学