Lgt家族效应蛋白识别底物的结构机制

作     者：李祥亮 

作者单位：福建师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：欧阳松应

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：嗜肺军团菌 Lgt家族效应蛋白 结构生物学 真核延伸因子1A 

摘      要：嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)是一种引发人类严重肺炎的军团菌病的革兰氏阴性病原体。嗜肺军团菌感染宿主细胞后通过其特有的IVB型分泌系统向宿主细胞分泌300多种效应蛋白。这些效应蛋白介导多种蛋白质翻译后修饰,如泛素化、乙酰化及糖基化等,在感染期间发挥不同的生物学功能。糖基化修饰是在糖基转移酶作用下,将糖基转移至底物蛋白质并形成糖苷键的过程,糖基化修饰与蛋白质的合成和致病菌的毒力有关。嗜肺军团菌编码的糖基化修饰相关的效应蛋白包括Lgt家族效应蛋白(包括Lgt1、Lgt2和Lgt3)、LtpM、SidI及SetA等,其中Lgt家族效应蛋白以UDP-葡萄糖为供体糖基化修饰宿主细胞延伸因子1A(eukaryotic elongation factor 1A,eEF1A)的第53位丝氨酸,抑制宿主细胞的蛋白质翻译。尽管Lgt1的结构已解析,但Lgt家族效应蛋白识别底物eEF1A的分子机制暂还不清楚。本研究以嗜肺军团菌糖基转移酶Lgt3为研究对象,以结构生物学手段解析Lgt3的结构,通过结构分析和体外糖基转移酶活性检测以探究Lgt家族效应蛋白识别底物的分子机制:(1)本研究通过X射线晶体衍射技术解析了Lgt3的106-610位氨基酸的蛋白质结构,发现Lgt3包含四个结构域,分别是NTD结构域、GT结构域、PD结构域和CTD结构域。(2)Lgt家族效应蛋白以保守的保留催化机制将UDP-葡萄糖的葡萄糖基转移至底物。与GT-A糖基转移酶家族类似,Lgt3的GT结构域保守性较高,包含两个Rossmann fold结构域,且其催化中心拥有经典的DxD基序,对DxD基序的双突变会导致糖基转移酶活性的丧失。(3)结构比对发现Lgt家族效应蛋白的整体结构存在差异:Lgt1的NTD结构域与GT结构域横向堆叠,形成细长的整体结构;Lgt2的NTD-Ⅱ结构域和PD结构域形成GT结构域的突起,将NTD-Ⅰ结构域夹在中间,形成紧凑的整体结构;而Lgt3的NTD-Ⅰ结构域和CTD结构域更为灵活,致使这部分结构无法解析。(4)Lgt家族效应蛋白可以通过抑制宿主蛋白质的合成进而抑制宿主未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR),但我们的实验表明Lgt家族结构上的差异性并不会对UPR的抑制程度产生差异。而当我们在体外检测Lgt家族效应蛋白的糖基转移酶活性时,却发现Lgt家族对eEF1A衍生十肽有不同的活性:Lgt1因其底物识别口袋E445和E446残基的存在而带大量负电荷,能够识别eEF1A衍生十肽中的正电残基K51和K53,使其活性较高;相反,Lgt2具有带正电荷的底物识别口袋,与带正电的十肽有静电排斥作用,因而活性较低。当eEF1A衍生的HLH作为底物时,Lgt2带正电荷的底物识别口袋与HLH的负电荷区域相互作用,因而有较高的亲和力;相反,静电排斥作用使得Lgt1对HLH几乎没有活性。而Lgt3对十肽和HLH都显示出较高的糖基转移酶活性,表明其底物识别机制与Lgt1和Lgt2不相同。综上所述,我们的研究表明Lgt家族效应蛋白识别底物eEF1A的机制各不相同。这些结果为糖基转移酶的作用机制提供了结构基础,突出了糖基转移酶在嗜肺军团菌生命周期中的重要作用。