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重楼皂苷I抑制卵巢癌细胞增殖和转移、诱导其凋亡分子机制的初步探索

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重楼皂苷I抑制卵巢癌细胞增殖和转移、诱导其凋亡分子机制的初步...

作者：徐海燕浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的重楼皂苷Ⅰ具有明显的抗肿瘤、调节免疫和心血管等作用。课题组前期研究发现重楼皂苷Ⅰ能明显抑制高转移人卵巢癌细胞株HO-8910PM的增殖和转移,诱导细胞凋亡。在本研究中,我们将进一步探讨重楼皂苷Ⅰ作用的分子机制。方法根据前期... 详细信息

目的重楼皂苷Ⅰ具有明显的抗肿瘤、调节免疫和心血管等作用。课题组前期研究发现重楼皂苷Ⅰ能明显抑制高转移人卵巢癌细胞株HO-8910PM的增殖和转移,诱导细胞凋亡。在本研究中,我们将进一步探讨重楼皂苷Ⅰ作用的分子机制。方法根据前期实验结果,以1.5ug/ml重楼皂苷Ⅰ处理HO-8910PM细胞48小时为实验组,没有药物处理的HO-8910PM细胞为对照组,提取HO-8910PM细胞总RNA,扩增生物素标记的cRNA后与Illumina磁珠表达谱芯片进行杂交和扫描。用Illumina bead studio application软件和DAVID数据库进行生物信息学分析,实验重复2次。筛选芯片结果中表达差异非常显著,而且与肿瘤增殖、凋亡和转移关系比较明确的基因做实时定量RT-PCR验证。结果在2次实验中具有重复性变化趋势的差异基因有123个(Diffscore小于-13或大于13)。其中,有70个基因在重楼皂苷Ⅰ处理的实验组中表达下调,53个基因表达上调。它们分别与细胞凋亡、增殖、迁移、侵袭和血管生成等相关。信号通路富集度分析显示,重楼皂苷Ⅰ处理细胞后,经典的MAP激酶通路(ERK1/2,也外信号调节激酶)、内质网通路和wnt信号通路被激活。RT-PCR结果显示WNT5A、PIK3C2B基因表达下调,JUN、PPP1R15A基因表达上调,与基因芯片结果一致;MYC、CDH2、MAPKAPK3基因表达下调,与基因芯片结果相反,其中MYC基因差异无统计学意义。结论重楼皂苷Ⅰ可能通过MAPK信号通路,内质网通路,wnt通路,上调JUN、PPP1R15A基因的表达,下调WNT5A、PIK3C2B、CDH2、MAPKAPK3基因表达,从而抑制HO-8910PM细胞增殖和转移,诱导其凋亡。

关键词：重楼皂苷Ⅰ 卵巢癌增殖凋亡转移分子机制

奈达铂与ABT-737联合用药对实体瘤细胞的抑制作用及其机制研究

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奈达铂与ABT-737联合用药对实体瘤细胞的抑制作用及其机制研究

作者：李丽燕浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的奈达铂为第二代铂类化合物,具有类似于顺铂的抗实体瘤活性,且更低的肾毒性和胃肠毒性。ABT-737是Bcl-2家族蛋白抑制剂,能抑制Bcl-2,Bcl-xL和Bcl-w的活性,引起肿瘤细胞发生凋亡,然而Mcl-1高表达往往引起ABT-737的实体瘤耐药。本研究... 详细信息

目的奈达铂为第二代铂类化合物,具有类似于顺铂的抗实体瘤活性,且更低的肾毒性和胃肠毒性。ABT-737是Bcl-2家族蛋白抑制剂,能抑制Bcl-2,Bcl-xL和Bcl-w的活性,引起肿瘤细胞发生凋亡,然而Mcl-1高表达往往引起ABT-737的实体瘤耐药。本研究旨在探讨奈达铂合用ABT-737的潜在抗实体瘤活性,并对奈达铂逆转ABT-737实体瘤耐药的机制进行初步探讨,为拓展两药的临床抗实体瘤应用提供理论基础和实验数据。方法1.采用SRB法检测奈达铂合用ABT-737对不同实体瘤细胞的增殖抑制作用,同时集落形成实验检测合用对实体瘤细胞增殖的影响;***染色结合流式细胞术检测合用诱导细胞凋亡的能力;***-1染色法检测合用对细胞线粒体膜电位的影响;4.采用Western blot法检测合用对相关蛋白表达的影响;5.荧光定量PCR法检测合用对相关蛋白mRNA表达的作用;6.利用质粒转染法扩增目标蛋白的表达。结果1.奈达铂与ABT-737合用协同抑制人实体瘤细胞增殖;2.奈达铂与ABT-737联合用药协同抑制人肺癌细胞A549克隆的形成;3.奈达铂与ABT-737联合用药协同诱导A549和95D细胞发生凋亡;4.奈达铂与ABT-737联合用药通过线粒体通路诱导A549和95D细胞发生凋亡;5.奈达铂与ABT-737联合用药能抑制XIAP和Mcl-1蛋白,从而激活Caspase-3,引起PARP的切割,最终诱导实体瘤细胞发生凋亡;6.奈达铂与ABT-737联合用药无法从转录水平抑制Mcl-1蛋白的表达;7.奈达铂与ABT-737联合用药协同效应与促进Mcl-1蛋白降解有关;8.过表达Mcl-1蛋白能逆转奈达铂与ABT-737联合用药所诱导的实体瘤细胞凋亡。结论奈达铂与ABT-737联合用药通过促进Mcl-1蛋白的降解,从而激活Caspase-3和裂解PARP,引起实体瘤细胞发生凋亡,最终发挥协同抗实体瘤的效果。

关键词：奈达铂 ABT-737 联合用药 Mcl-1 实体瘤

异叶败酱提取物DI对胃癌细胞的抑制作用及机制研究

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异叶败酱提取物DI对胃癌细胞的抑制作用及机制研究

作者：张丹浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的：异叶败酱是一种传统的中药,其根和根茎富含挥发油,具有一定的药用价值,民间用于治疗子宫癌和宫颈癌。我们的前期研究通过对异叶败酱有效成分的分离提取,得到了一种具有抗肿瘤活性的化合物单体Deacetyl isovaltratum (DI)。本研究... 详细信息

目的：异叶败酱是一种传统的中药,其根和根茎富含挥发油,具有一定的药用价值,民间用于治疗子宫癌和宫颈癌。我们的前期研究通过对异叶败酱有效成分的分离提取,得到了一种具有抗肿瘤活性的化合物单体Deacetyl isovaltratum (DI)。本研究旨在探讨DI对人胃癌细胞AGS和HGC-27的作用,并对其可能的机制进行初步探讨,为抗肿瘤候选药物的筛选和研究提供实验基础和开发方向。方法：采用MTT法检测DI对不同类型的肿瘤细胞的增殖抑制作用,同时进行集落形成实验检测细胞增殖变化;采用流式细胞技术检测DI作用后细胞周期变化以及细胞凋亡率;采用Hoechst33258荧光染色法观察DI作用后细胞的凋亡情况;采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位的变化;采用Western blot法检测相关蛋白的表达;以及采用Tubulin聚合实验观察细胞微管的变化。结果：DI能抑制多种实体瘤细胞的增殖,对胃癌细胞AGS和HGC-27在72h的IC50分别为5.78±0.12μM和14.07±0.55μM。随着浓度的增加也能抑制AGS和HGC-27细胞的集落形成;流式细胞技术结果表明DI能引起人胃癌细胞AGS和HGC-27的G2/M期阻滞,而Tubulin聚合实验结果显示DI能促进细胞微管聚合,抑制有丝分裂,使细胞阻滞在M期;Western blot结果显示,一定浓度的DI作用不同时间后,AGS和HGC-27的p-Chkl蛋白表达量上升,而cdc25c和cdc2蛋白表达则逐渐下调。DI还能通过改变线粒体膜通透性,激活caspase3,引起PARP的切割,最终诱导AGS和HGC-27细胞凋亡。结论：DI可能通过调控Chkl-cdc25c-cdc2通路,促进微管聚合抑制解聚,抑制细胞有丝分裂,引起细胞周期阻滞,从而诱导人胃癌细胞株AGS和HGC-27凋亡。

关键词：胃癌 DI 细胞增殖细胞周期凋亡

土木香提取物对胰腺癌细胞的抑制作用及机制研究

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土木香提取物对胰腺癌细胞的抑制作用及机制研究

作者：曾健梅浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的我们的前期研究通过对土木香有效成分的分离提取,得到了具有抗肿瘤活性的混合物:土木香提取物(inula helenium *** acetate extract,EEIHL)。本研究将探讨EEIHL抗胰腺肿瘤的作用,并对其可能的作用机制进行研究,为抗胰腺癌候选药物... 详细信息

目的我们的前期研究通过对土木香有效成分的分离提取,得到了具有抗肿瘤活性的混合物:土木香提取物(inula helenium *** acetate extract,EEIHL)。本研究将探讨EEIHL抗胰腺肿瘤的作用,并对其可能的作用机制进行研究,为抗胰腺癌候选药物的筛选和研究提供可靠依据和开发方向。方法采用CCK8法检测EEIHL对胰腺癌细胞的增殖作用的影响,并通过克隆形成实验检测EEIHL对细胞增殖的变化;采用PI染色法检测EEIHL作用后细胞周期的分布情况以及细胞凋亡率;采用DAPI染核法观察EEIHL作用后细胞核形态的变化;采用JC-1染色法检测给药后细胞线粒体膜电位的变化;采用BioVision试剂盒检测Caspase-3的活性变化;采用划痕实验观察EEIHL对胰腺癌细胞迁移作用的影响;荧光定量PCR法检测E-Cadherin mRNA、Snail mRNA的表达;采用Western blot法检测相关蛋白的表达。结果EEIHL能抑制胰腺癌细胞的增殖,EEIHL对胰腺癌细胞Capan-2和CFPAC-1在48h 的 IC50 分别为 4.68±0.17 μg/ml 和 3.47± 0.60 μg/ml;EEIHL 能抑制 Capan-2 和CFPAC-1细胞的集落形成;EEIHL能引起胰腺癌细胞CFPAC-1的G0/G1期阻滞;EEIHL通过改变线粒体膜通透性,引起PARP的切割,最终诱导Capan-2和CFPAC-1细胞发生凋亡;且EEIHL抑制CFPAC-1细胞的迁移,我们还发现EEIHL下调Snail mRNA、E-cadherin mRNA 表达。结论EEIHL能抑制胰腺癌细胞Capan-2和CFPAC-1的增殖;EEIHL能在体外诱导Capan-2和CFPAC-1凋亡,同时抑制CFPAC-1的迁移。

关键词：胰腺癌 EEIHL 细胞增殖细胞周期凋亡

二甲基塞来昔布增敏ABT-737抗胃癌的作用和机制研究

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二甲基塞来昔布增敏ABT-737抗胃癌的作用和机制研究

作者：王咪咪浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的：ABT-737是类似BH-3的小分子物质,能够抑制抗凋亡的Bcl-2家族蛋白Bcl-2,Bcl-xL和Bcl-w的活性,引起凋亡蛋白Bid, Bad及Bim等从抗凋亡蛋白中释放。ABT-737能够拮抗Bcl-2和Bcl-xL,但是和另一个抑凋亡家族蛋白Mcl-1的亲和力较小,因而... 详细信息

目的：ABT-737是类似BH-3的小分子物质,能够抑制抗凋亡的Bcl-2家族蛋白Bcl-2,Bcl-xL和Bcl-w的活性,引起凋亡蛋白Bid, Bad及Bim等从抗凋亡蛋白中释放。ABT-737能够拮抗Bcl-2和Bcl-xL,但是和另一个抑凋亡家族蛋白Mcl-1的亲和力较小,因而在某些实体瘤中Mcl-1蛋白高表达时,造成肿瘤细胞对ABT-737耐药。本文研究了ABT-737与二甲基塞来昔布联合用药的药效学及其机制研究。方法：(1)MTT法检测ABT-737与二甲基塞来昔布(DMC)联合用药抑制人胃癌细胞增殖。(2)利用PI单染或Annexin V/PI双染法流式细胞术检测凋亡率。(3)利用JC1染色法检测线粒体膜电位变化。(4)Western blotting法检测蛋白的表达。(5)激光共聚焦检测AIF细胞内定位。(6)荧光定量PCR法检测mRNA的表达。(7)利用SiRNA技术沉默基因表达。结果：二甲基塞来昔布与ABT-737联合用药较塞来昔布联合ABT-737具有更强的的抗肿瘤作用,且二甲基塞来昔布不显著影响细胞内PGE2的水平。二甲基塞来昔布与ABT-737合用通过改变线粒体膜通透性,增强Mc1-1的降解,且与Mcl-1的蛋白水平呈明显的负相关,但不显著上调Noxa, Bim和Bak等促凋亡蛋白的水平,提示该凋亡作用可能与caspase的激活无关。进一步发现,二甲基塞来昔布与ABT-737合用能够激活AIF的核转位,最终引起两药发生协同效果。结论：二甲基塞来昔布与ABT-737联合用药通过降解细胞内的Mcl-1蛋白,促进AIF核转位,从而产生caspase非依赖凋亡。

关键词： ABT-737 二甲基塞来昔布 McI-1 AIF

Ibr-7抑制mTOR/p70S6K信号通路增敏吉西他滨抗胰腺癌的作用机制研究

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Ibr-7抑制mTOR/p70S6K信号通路增敏吉西他滨抗胰腺癌的作用机制研...

作者：顾杨琴浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的胰腺癌是临床上致死率最高的恶性肿瘤之一,其5年生存率仅为5%。因其发病隐匿,胰腺癌在确诊时大多已处于晚期,失去了手术切除的机会,因此化学药物治疗是晚期胰腺癌治疗的重要手段。然而,大部分胰腺癌患者对药物治疗敏感性低,即使是... 详细信息

目的胰腺癌是临床上致死率最高的恶性肿瘤之一,其5年生存率仅为5%。因其发病隐匿,胰腺癌在确诊时大多已处于晚期,失去了手术切除的机会,因此化学药物治疗是晚期胰腺癌治疗的重要手段。然而,大部分胰腺癌患者对药物治疗敏感性低,即使是临床一线药物吉西他滨（Gemcitabine,Gem）,客观有效率也不到20%,严重影响了胰腺癌患者的预后,因此寻找对胰腺癌更为有效的药物迫在眉睫。Ibr-7是我们团队在前期工作中得到的一个依鲁替尼（Ibrutinib,Ibr）衍生物,已发现对非小细胞肺癌具有较强的体内外抗肿瘤活性。本论文将对Ibr-7增敏吉西他滨抗胰腺癌的作用机制开展初步研究。方法1.细胞增殖实验:用CCK-8法检测Ibr-7、Ibrutinib和吉西他滨处理48 h后对人胰腺癌细胞BxPC-1、SW1990、CFPAC-1和AsPC-1的增殖抑制情况。*** blotting 实验:Ibr-7、Ibrutinib 和吉西他滨处理 8 h 后对 BxPC-3、SW1990和CFPAC-1细胞蛋白水平的变化。3.流式细胞术检测细胞凋亡:采用Annexin-FITC/PI双染,检测Ibr-7、Ibrutinib和吉西他滨处理24 h后对BxPC-3和SW1990细胞诱导凋亡的能力。***染色实验:采用DAPI染色,观察Ibr-7、Ibrutinib和吉西他滨处理24 h后诱导BxPC-3细胞核形态变化的能力。***-seq分析:吉西他滨单用或联合Ibr-7处理BxPC-3细胞24h后,富集mRNA转化为cDNA,通过illumina NovaseqTM 6000对其进行测序,使用HISAT2软件将测序结果进行比对和分析,对基因进行GO和KEGG富集分析。***-PCR分析:Ibr-7、Ibrutinib和吉西他滨处理8h后,用Real Time-PCR法检测BxPC-3细胞内TRIM32的mRNA水平的变化。***32敲除实验:采用siTRIM32转染敲低TRIM32,观察BxPC-3细胞增殖和细胞集落形成能力的变化。采用吉西他滨处理24 h后,观察敲低TRIM32后细胞增殖能力的变化。***32过表达实验:采用慢病毒转染过表达TRIM32,观察BxPC-3细胞增殖能力和侵袭能力的变化。采用Ibr-7和吉西他滨处理24 h后,观察过表达TRIM32后细胞增殖能力的变化。9.动物实验:建立BALB/c裸鼠胰腺癌模型,采用Ibr-7和吉西他滨单用或联合给药后,观察裸鼠肿瘤体积大小的变化。结果1.细胞增殖实验结果显示,Ibr-7在人胰腺癌细胞株BxPC-3、SW1990、CFPAC-1和 AsPC-1 上的 IC50分别为 1.8±0.2、1.9±0.2、1.0±0.1 和 2.1±0.4μM,而Ibrutinib在细胞上的 IC50 分别为 164.4±11.9、124.5±11.1、11.6±2.6 和 24.0±0.9 μM。在 BxPC-3细胞上,2 μM的Ibr-7联合10 μM的吉西他滨的抑制率为94.0%±0.6%,CI值为0.1;在SW1990细胞上,2 μM的Ibr-7联合10 μM的吉西他滨的抑制率为79.3%±1.3%,CI值为0.2。*** blotting 结果显示,8 μM的 Ibr-7 处理 BxPC-3、SW1990 和 CFPAC-1 细胞8 h后,可显著抑制磷酸化mTOR、p70S6和S6蛋白的表达。在BxPC-3和SW1990细胞上,8 μM 的 Ibr-7 可显著下调 PARP、XIAP、Pro-caspase 3 和 Pro-caspase 9 凋亡蛋白的表达水平,上调Cleaved caspase3和Bax的蛋白表达水平,同时抑制Mcl-1、Bcl-2和Bcl-XL等线粒体蛋白的表达。2 μM的Ibr-7联合8μM的吉西他滨处理BxPC-3、SW1990和CFPAC-1细胞24 h后,抑制磷酸化mTOR和p70S6K蛋白的表达。3.流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,采用8 μM的Ibr-7和Ibr处理24h后,BxPC-3细胞的凋亡率分别为74.7%±5.6%和22.1%± 1.6%,SW1990细胞的凋亡率分别为68.9%±6.1%和 5.8%±1.5%,CFPAC-1 细胞的凋亡率分别为 63.4%±4.3%和 10.8%±3.2%。2μM的Ibr-7联合8 μM的吉西他滨处理24h后,BxPC-3细胞的凋亡率为40.0%±2.5%,SW1990细胞的凋亡率为38.8%±1.7%。***染色实验结果显示,8 μM的Ibr-7作用于BxPC-3细胞24 h后,可诱导肿瘤细胞产生凋亡小体。在BxPC-3和SW1990细胞上,2 μM的Ibr-7联合8 μ

关键词： Ibr-7 Ibrutinib 吉西他滨 mTOR/p70S6K 胰腺癌 TRIM32

二氢辣椒素和胡椒碱对依非韦伦代谢的影响及机制研究

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二氢辣椒素和胡椒碱对依非韦伦代谢的影响及机制研究

作者：刘潇雯浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的建立UPLC-MS/MS方法检测生物标本中的依非韦伦和代谢产物8-羟基依非韦伦,评价二氢辣椒素和胡椒碱对大鼠体外体内代谢依非韦伦的影响。方法制备大鼠肝微粒体,以依非韦伦为底物,在体外孵育体系中分别加入胡椒碱和二氢辣椒素作为抑制... 详细信息

目的建立UPLC-MS/MS方法检测生物标本中的依非韦伦和代谢产物8-羟基依非韦伦,评价二氢辣椒素和胡椒碱对大鼠体外体内代谢依非韦伦的影响。方法制备大鼠肝微粒体,以依非韦伦为底物,在体外孵育体系中分别加入胡椒碱和二氢辣椒素作为抑制剂37℃共同孵育,通过加入NADPH启动反应,加入冰乙腈结束反应;反应结束后离心取上清,建立UPLC-MS/MS方法检测并分析代谢物8-羟基依非韦伦生成量,计算其IC50和Ki值。18只健康SD雄性大鼠随机分成胡椒碱组、二氢辣椒素组和对照组(n=6)。分别连续灌胃胡椒碱、二氢辣椒素和生理盐水一周后,给予54 mg/kg剂量的依非韦伦,在0.083,0.25,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12和24 h时间点通过尾静脉收集300μL血液,通过3000r/min离心5 min分离血浆。建立UPLC-MS/MS方法检测并分析血浆中依非韦伦的含量,使用DAS 3.0软件进行药代动力学参数拟合。结果二氢辣椒素和胡椒碱对依非韦伦的IC50分别为16.84μM和41.01 μM。二氢辣椒素对依非韦伦为竞争性抑制,Ki值为1.895 μM。胡椒碱对依非韦伦为混合型抑制,Ki值为86.65μM,αKi值为54.15 μM。胡椒碱组和二氢辣椒素的AUC(0-t)相对于对照组大鼠分别增加了 67.4%和133.0%;清除率CLz/F分别下降了39.2%和53.8%;达峰时间Tmax平均延后了29.7%和23.7%。结论胡椒碱和二氢辣椒素在大鼠体内和体外肝微粒体孵育体系中对依非韦伦的代谢均有抑制作用,使用依非韦伦时需要考虑食物-药物相互作用的风险。

关键词：胡椒碱二氢辣椒素依非韦伦超高效液相串联质谱药物相互作用