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第1章骨质疏松女性即刻椎体骨折风险评估模型的建立与验证目的:评估骨质疏松患者发生即刻椎体骨折的风险高低,对高危人群进行准确、有针对性的治疗,可获得最佳的社会效益。但目前可用于评估骨质疏松患者即刻椎体骨折的工具较少。我们的研究目标是建立和验证一种新的椎体骨折预测模型,可靠地估计骨质疏松女性即刻椎体骨折的风险高低,以期对不同骨折风险的人群进行分层管理提供指导。方法:这项多中心、回顾性研究收集了国内三家医院接受骨密度(Bone mineral density,BMD)检查的女性骨质疏松症患者(检查时间:2016.1.1-2016.12.31,2020.2.1-2022.1.10)。通过电子病历系统检索来获得的这些骨质疏松患者的临床资料。南方医科大学南方医院的临床资料以2:1的比例随机分为模型开发队列和验证队列,使LASSO(the least absolute shrinkage and selection operator regression)回归筛选变量,Logistic 回归构建模型,Hosmer-Lemeshow test评估模型的拟合效果,受试者工作特征曲线下面积(receiver operating characteristic curve,AUC)评估模型的区分度,决策曲线分析(Decision curve analysis,DCA)、拟合优度和临床影响曲线(clinical impact curve,CIC)评估模型的临床适用性。另外两家医院(赣州市人民医院和赣南医学院第一附属医院)的临床资料用于外部验证。数据分析时间为2022.1.11-2022.4.10。结果:研究对象包括1064名妇女(中位[四分位数间距,interquartile range,IQR]年龄,65.7[59.1-71.2]岁),随机分为模型开发组(709[67%])和验证组(355[33%])。采用多变量Logistic回归、LASSO回归,并结合参考其他文献的报道,筛选出最佳的预测变量。构建单变量模型(NFLT)包含变量:BMD最低T值(LSD T),NFOVF模型包含双变量:既往有椎体骨折史、LSD T,NF+age模型:既往有椎体骨折史、LSD T和年龄。NFLT模型在开发和内部验证队列的AUC分别为0.741和0.747,NFOVF模型在开发和内部验证队列的AUC分别为0.788和0.774。NF+age模型在开发和内部验证队列的AUC分别为0.789和0.779。NFLT模型在外部验证队列上的AUC分别为0.707和0.657,NFOVF模型在外部验证队列上的AUC分别为0.790和0.741,而NF+age模型分别为0.786和0.748。NFOVF模型和NF+age模型在拟合优度、DCA和CIC上均表现良好。NFOVF模型和NF+age模型之间的预测效率差异无统计学意义(P<0.05)。前瞻性随访中骨折发生率也基本符合我们的预期。结论:本研究基于临床资料和BMD构建了骨质疏松即刻椎体骨折预测模型,对于骨质疏松性椎体骨折风险预测,腰椎和髋关节位置的LSD T可以提供强有力的预测效能。基于LSD T和椎体脆性骨折史的模型是椎体风险分类的一个有价值的工具。我们提出的个性化的列线图,可用于女性骨质疏松患者预测即刻椎体骨折的风险高低,有助于为骨质疏松患者提供指导,这为未来的研究提供了基础。第2章 NFOVF与FRAX模型的初步比较目的:在建立NFOVF模型的基础上,我们尚不清楚NFOVF和FRAX模型在划分病人特征上存在哪些差异,因此我们的研究目的是比较NFOVF和FRAX模型在同一批骨质疏松患者基线资料、生活质量和用药情况上的区别。方法:这项单中心、回顾性研究收集了来自南方医科大学南方医院门诊就诊的女性骨质疏松患者。通过在门诊与患者进行面对面的询问和医院电子病历系统提取我们所需要的变量,如年龄、生活质量、用药情况等。将所有符合纳入标准的患者临床资料采用均值替代法进行缺失数据的填补,评估正态性,按FRAX高风险与低风险、NFOVF高、中、低风险进行分组,数据采用中位数(四分位数)表示,采用非参数检验比较各组间的用药和生活质量情况是否存在统计学差异。结果:研究对象包括91名符合要求的参与者(中位[IQR]年龄,65.0[59.0-68.0]岁),按 FRAX 高风险(38[42%])、低风险(53[58%])和 NFOVF 高风险(8[9%])、中风险(50[55%])、低风险(33[36%])组,采用非参数检验各组间统计学差异。无论是在FRAX风险组中还是在NFOVF风险组中,各组的用药情况、跌倒风险基本无明显统计学差异。FRAX高风险组的ODI得分28.1[21.6,40.1]高度低风险组23.4[15.3,29.7]存在统计学差异。

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甲状旁腺激素的非PLC依赖PKC通路对骨代谢的初步研究

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作者：胡少宇南方医科大学

学位级别：硕士

背景:骨质疏松症是一类伴随年龄衰老或医学原因一起的,以骨量丢失、骨密度降低、骨组织显微结构破坏、骨脆性增加、骨强度下降,以及易于发生骨折为主要临床特征的代谢性、全身性骨骼疾病。WHO于1994年制定了以骨密度测量为基础,诊断骨... 详细信息

背景:骨质疏松症是一类伴随年龄衰老或医学原因一起的,以骨量丢失、骨密度降低、骨组织显微结构破坏、骨脆性增加、骨强度下降,以及易于发生骨折为主要临床特征的代谢性、全身性骨骼疾病。WHO于1994年制定了以骨密度测量为基础,诊断骨质疏松的标准为骨密度值低于或等于正常年轻人2.5个标准差即可诊断为骨质疏松,有过一次或多次骨折经历的都肯定有严重的骨质疏松。随着全球人口的老龄化,骨质疏松在全世界常见病、多发病中的地位逐渐上升至第七位。在我国骨质疏松症也已跃居常见病第六位,患病人数已达到9500万。其中50～60岁的发生率为21%,60～70岁的为58%,70岁以上几乎是100%,尤以绝经后妇女的发生率更高,据调查显示,50岁以上男性及40岁以上女性都有不同程度的骨质疏松,随着年龄的增加,骨质疏松的发生率明显增加。健康人的骨密度(矿物质含量)在30岁以前是上升的,并在30～39岁达到高峰,到40岁以后逐渐下降,矿物质量下降往往没有感觉或者感觉轻微,只有在减少12%以上时才会出现变矮、驼背、弯腰等临床症状,并且随着年龄的增加和矿物质含量的减少而加重。当患者发生骨折时,此时的矿物质含量丢失已达25%以上。目前治疗骨质疏松的主要方法分为饮食治疗和药物治疗,通过调整饮食结构、补充钙剂及维生素D等具有一定的治疗效果。药物治疗主要分为抑制骨吸收药物和促进骨形成药物,前者包括雌激素替代疗法、降钙素、维生素D及其代谢产物、二膦酸盐、异黄酮衍生物等,后者有甲状旁腺激素、氟化物、他汀类药物、钙剂、锶盐、男性激素治疗等。在增加骨量促骨形成的代谢药物中,目前只有甲状旁腺激素(商用名:特里帕肽)获得认可。甲状旁腺激素对骨代谢具有独特的作用,这是其它药物所不具备的。这些作用主要包括增加骨密度、促进骨微结构的重塑以及降低骨折的发生率。甲状旁腺激素(PTH)是调节骨代谢的重要激素之一。美国FDA于2002年批准使用低剂量甲状旁腺激素间断注射用于治疗骨质疏松,在2010年,我国批准使用PTH用于治疗绝经后老年女性、老年男性及由糖皮质激素引起的骨质疏松症。其治疗效应可能是通过抑制细胞凋亡从而增加成骨细胞数量最终增加骨量来实现的。虽然间断性小剂量应用可促进骨形成,但是连续大剂量应用会促进骨吸收以及可能存在致癌的风险和减低PTH的疗效,因此优化PTH,促进疗效,缩短使用时间,避免其副作用是目前PTH领域研究的重要方向之一。PTH引起的这两种极端的效应,是由于PTH的作用效果是与时间和剂量相关的。体内和体外研究表明,PTH具有刺激成骨细胞的增殖、分化和凋亡的能力。PTH及其相关肽(PTHrP)调节成骨细胞的增殖、分化和凋亡是通过激活甲状旁腺受体1(PTHR1)及其下游的多个信号途径实现的。目前研究表明,PTH的生物学效应主要通过以下三条信号通路的激活:分别是cAMP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC通路。PTH主要通过cAMP/PKA这条通路对骨的代谢进行调节,但这种调节是双向的并且与应用剂量相关。PLC/PKC信号通路对PTH的破骨作用起辅助增强的效应,而nonPLC/PKC信号通路具有能够特异性的对某些部位进行成骨调节的作用。参与介导PTH/nonPLC/PKC的亚信号通路还没有明确的界定,但是与其相关的研究提示存在多因子的参与及多亚信号通路的介导的可能。1)PTH(1-34)的 C 端结构,包括 PTH(3-34)和 PTH(29-34),介导nonPLC/PKC信号通路,具体的信号介导机制需要深入研究。2)不能排除cAMP/PKA参与介导nonPLC/PKC的可能。最近我们的研究发现cAMP/PKA选择性PTH模拟肽,G1y1Arg19hPTH(1-28),可激活PKC,提示cAMP/PKA可能部分参与 PTH/nonPLC/PKC 信号途径。3)Rho A/Rho Kinase/PLD 可能介导nonPLC/PKC。通过对这三条通路的研究以及在甲状旁腺激素基本结构的基础上,研究具有更强的成骨作用、结构更短、副作用更小的模拟肽是研究的重要方向之一。改变任何蛋白的氨基酸序列或者构象都会改变该蛋白的能力,PTH(1-34)也不例外,其构象的改变及氨基酸序列的变化都有可能影响某些信号通路的激活能力。如:PTH(1-34)完整的N端结构是cAMP/PKA和PLC/PKC通路的激活的必要条件;G1y1替换Ser1可使PTH(1-34)失去激活PLC的特性;Arg19替换Glu19能够补偿因29-34氨基酸残基缺失而引起的受体结合力减弱;当Leu 24,Leu28,val31突变成Glu后,PTH(5-34)不与受体结合;在PTH(1-14)的氨基酸残基中,Val2,G1u4,Ile5,Lys7,Met8,His9突变成Ala后,不能激活cAMP/PKA信号通路;在PTH

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信号选择性甲状旁腺素模拟肽影响脊柱融合的动物实验研究

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作者：张兆飞南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景植骨融合在脊柱疾患的手术治疗中是最常用的手术方法之一,腰椎手术的成败与融合的成败休戚相关。自体骨植骨融合是融合的金标准。在美国,每年有将近五十万病人因为脊柱或者骨折而通过目前融合手术来缓解严重的腰痛或骨... 详细信息

研究背景植骨融合在脊柱疾患的手术治疗中是最常用的手术方法之一,腰椎手术的成败与融合的成败休戚相关。自体骨植骨融合是融合的金标准。在美国,每年有将近五十万病人因为脊柱或者骨折而通过目前融合手术来缓解严重的腰痛或骨折不愈合翻修来促进愈合而接受治疗。在这些手术中脊柱手术占了1/2。在进行各种脊柱融合手术或明显骨缺损的骨折治疗时,往往在术中需要进行植骨。面对自体骨,同种异体骨,DBM等形形色色备选植骨材料,究竟为病人选择哪种植骨材料是临床脊柱外科医生一直面临的一个困惑。使用自体骨植骨融合已获广大学者的公认,尽管目前有很多种异体骨,但始终不可能完全取代自体骨,自体骨植骨有很多优点等（如费用低廉,无免疫排斥性等）,但是自体骨植骨同时也带来了很多问题,如自体骨移植出现的不融合率在逐年增加,由此可导致邻近节段退变、不稳、假关节形成等。如何提高脊柱融合率已成为当前研究的热点。甲状旁腺素（parathyroid hormone, PTH）是甲状旁腺分泌的一种激素,主要调节机体的钙磷代谢及骨代谢。大量研究证实,甲状旁腺激素及其片段和类似物具有直接和强有力的刺激骨生长作用,尤其在小梁骨丰富的脊柱、骨质疏松的患者。各年龄人群的骨折修复和宇航员失重造成的骨丢失者中均显示出理想的疗效。椎骨和非椎骨骨折的发生率均下降。目前国外已开发的PTH类似物有两种,分别为美国Lilly公司采用大肠杆菌表达系统成功开发的rhPTH（1-34）和Allelix公司运用蛋白酶缺失的大肠杆菌表达系统,并对天然PTH的基本序列改造成功研发的rhPTH（1-84）。PTH类似物特立帕肤（teriparatide）是由美国礼来（Lilly）公司开发,已于2002年在美国、奥地利、丹麦、芬兰、德国、希腊、冰岛、爱尔兰、荷兰、挪威、葡萄牙、瑞士上市,并于2003年和2004年在英国和澳大利亚相继上市,是目前唯一治疗骨质疏松症的药物。特立帕肽为人甲状旁腺激素类似物,通过与细胞表面受体特异性地高亲和力结合来介导,增加成骨细胞的活性及数量而促进骨的形成,而应用于骨质疏松症及预防骨质疏松性骨折的治疗,它具有与天然甲状旁腺激素（PTH）N端34个氨基酸序列相同的结构,它可以与PTH-1受体结合,发挥PTH对骨骼与肾脏的生理作用;同时不存在C端肽对骨代谢的不利影响。研究表明该药可以促进骨形成,增加骨密度,降低骨折风险,并可与其他治疗骨质疏松症药物联合应用增强疗效。Anastasilakis等[1]对22例绝经后骨质疏松症妇女分别应用特立帕肽20 u g·d-1与每周利塞膦酸钠35mg,在开始治疗前、治疗后第3个月、第6个月观察骨转换指标改变,1年后停用药物。研究发现,反映骨形成相关指标如血清碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原N端前肽（PNP）在特立帕肽组明显增加（P＜0.001）,而在利塞膦酸钠组明显下降（P＜0.001）;反映骨吸收指标血清Ⅰ型胶原C端肽（CTX）在特立帕肽组也增加,而在利塞膦酸钠组下降,提示特立帕肽独特具有促进骨形成与骨吸收的双重作用。目前原发性骨质疏松症常规治疗药物如双膦酸盐、降钙素、雌激素类,其作用机制均是通过抑制破骨细胞活性达到治疗骨质疏松症效果,而特立帕肽是目前唯一认为具有促进骨合成代谢的药物。单独或联合应用特立帕肽,可以增加骨密度、改善骨微结构、降低骨折风险。Lilly’s公司对1637名患骨质疏松症-相关骨折的绝经后妇女的Ⅲ期临床试验结果表明,rhPTH（1-34）具有显著降低病人患中度或严重脊椎骨折危险率及非脊椎骨折危险率的明显疗效。PTH对于患骨质疏松症的大鼠和人不但能刺激骨形成而且还能增加骨质量和强度。因灵长类动物骨重建和结构与人骨相似,所以灵长类动物逐渐被应用到实验中,研究证实,连续6个月每天皮下注射重组人PTH（rhPTH）（1-34）,能够增加卵巢切除猴的脊椎骨矿物质密度,不影响血清离子化钙水平或尿钙排泄。这是目前第一个被批准具有促骨形成的药物,因而受到各国的特别关注。hPTH（1-34）是骨形成药物,通过增加成骨细胞数及（或）其活力来促进新骨生长。间歇性应用PTH有较强的成骨作用但作用机制尚不完全清楚。目前主要有以下观点：抑制成骨细胞凋亡;促进成骨母细胞与成骨细胞的增生与分化,此过程可能与核结合因子有关;促进骨衬里细胞向成骨细胞转化;调节成骨细胞自分泌与旁分泌。PTH具有很强的成骨作用,现在已有大量的文献报道小剂量hPTH（1-34）能够增加全身BMD,治疗骨质疏松。hPTH（1-34）对脊柱融合率的影响,也有文献报道能够提高融合率,增加融合区的骨量。已经证实hPTH（1-34）主要是通过激活PTH1R受体,从而激活了几个信号转导通路,包括cAMP/PKA、NonPLC/PKC和PLC/PKC等。经研究证明PL

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信号选择性甲状旁腺素模拟肽影响小鼠成骨细胞的基因表达谱分析

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作者：冯瑞强南方医科大学

学位级别：硕士

背景：自从Pornmer在1885年提出骨质疏松以来,人们对骨质疏松的认识也随着历史的发展和技术的进步而逐渐深化。早年一般认为全身骨质减少即为骨质疏松,美国则认为老年骨折为骨质疏松。直到1990年在丹麦举行的第三届国际骨质疏松研讨... 详细信息

背景：自从Pornmer在1885年提出骨质疏松以来,人们对骨质疏松的认识也随着历史的发展和技术的进步而逐渐深化。早年一般认为全身骨质减少即为骨质疏松,美国则认为老年骨折为骨质疏松。直到1990年在丹麦举行的第三届国际骨质疏松研讨会,以及1993年在香港举行的第四届国际骨质疏松研讨会上,骨质疏松才有一个明确的定义,并得到世界的公认：原发性骨质疏松是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的,致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨胳疾病,并拟定每年的10月20日为“国际骨质疏松日” 我国的骨质疏松流行病学调查发现,40岁以上的骨质疏松患病率为16.1%,随年龄增加,骨质疏松发生率递增,60岁以上人群22.6%,超过80岁时50%人群均有患病。随着人类社会的发展以及医疗水平和护理水平的提高,骨质疏松越来越成为临床护理和治疗的重点,同时我国也逐渐步入老龄化社会,由骨质疏松所带来的社会负担也逐渐增加,骨质疏松的机理研究和治疗已经成为-个热点。目前骨质疏松治疗的药物主要是抗骨吸收的药物,比如二磷酸盐、雌激素、降钙素denosumab（核因子Kappa B配体的抗体）、odanacatib（破骨酶cathepsinK的抑制剂）、胰高血糖素样肽2等,以放缓骨吸收为主要目的,对骨量的增加有限。骨吸收抑制药使骨吸收量明显减少的同时,也使骨形成量轻度减少,既出现骨转化率（单位时间的骨重建量）减慢,同时呈现骨形成大于骨吸收,因此骨密度升高。但是抗骨吸收药物可能产生一些副作用,比如足量的2种骨吸收抑制药的联合用药,如果雌激素足量,联合Alendronate足量,骨形成作用降低,那么骨折愈合率降低,可能妨碍适量骨形成所保障的生理性微骨折的修复。 PTH是体内重要的骨代谢调节激素,目前唯一临床可用的促进骨合成代谢的药物。天然的PTH由84个氨基酸构成,其N端34个氨基酸残基（PTH（1-34））具有同84个氨基酸相同的受体结合和受体激活功能,研究证实PTH（1-34）主要通过PKA和PKC两种信号途径发挥作用。随着对PTH信号通路研究的深入,发现PTH N端前两位氨基酸为PTH信号转导的关键性区域,第1位丝氨酸（Ser）突变成甘氨酸（Gly）可极大削弱PTH的PLC激活作用。19位谷氨酸突变成精氨酸（Arg）可以补偿29-34氨基酸残基缺失引起的受体结合力的减弱。实验证明G1R19（1-28）和G1R19（1-34）仅具有极小的PLC激活作用,G1R19（1-28）仅仅激活cAMP/PKA信号途径;G1R19（1-34）由于存在PTH（29—34）结构,除了激活cAMP/PKA信号途径,还能激活PKC （non-PLC/PKC信号途径）。三种肽可以增加小鼠远端股骨骨密度,并且PTH（1-34）和G1R19（1-34）增加股骨密度的量强于G1R19（1-28）。 Wnt基因在胚胎发育、成人组织修复以及肿瘤的发生发面发挥着重要的作用,而近年来Wnt信号通路对骨骼系统,尤其是成骨细胞和软骨细胞的调节作用的研究逐渐增多。Wnt信号通路对调节骨量方面具有重要作用,研究证实PTH（1-84）可以通过激活Wnt信号传导通路来发挥成骨作用。那么PTH发挥成骨作用通过不同的信号途径,这些途径与Wnt信号通路之间存在什么样的关系,目前还没有见到相关研究的文献报道。目的 1.改进传统的酶消化法,通过Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶消化获取成骨细胞,提供一种温和、高效的成骨细胞原代培养方法。 2.本研究通过表达谱基因芯片技术,筛选信号选择性甲状旁腺素模拟肽成骨效应影响的差异基因,并且探索PTH成骨效应的不同信号通路与Wnt相关因子的关系,为阐明PTH成骨效应的机制提供理论基础。材料与方法 1.选择出生2d的C57BL乳鼠分离颅盖骨,利用Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶,37℃震荡消化20min,弃去第一次上清,收集后四次上清液,加入10%FBS终止消化,2000rpm离心5分钟,弃上清后,接种于细胞培养瓶和六孔板中。取接种于6孔板中的原代成骨细胞进行鉴定：①ALP染色：培养14d时,取部分细胞,PBS冲洗3遍,按照ALP染色试剂盒说明行ALP染色,细胞质染成蓝色为阳性。②茜素红染色：取部分细胞加入成骨诱导液（10%FBS、50μg/mL维生素C、100mmol/L β-甘油磷酸钠）,28d时以PBS冲洗2遍,4%多聚甲醛固定,0.1%茜素红37℃孵育30min,观察红色钙结节的形成。 2.将贴壁生长的传一代细胞,PBS冲洗三遍,1%FBS维持培养12h,然后随机分成4组,分别接受10nM PTH（1-34）,10nM G1R19（1-34）,100nM G1R19（1-28）和等体积的0.1%TFA作用4h,利用Trizol法提取总RNA,送

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甲状旁腺素通过PKA依赖及非依赖途径激活PKC信号通路的实验研究

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作者：孟越南方医科大学

学位级别：硕士

背景：骨质疏松症是以骨量的减少和骨微结构的破坏为特征的一种全身性代谢性骨病,会导致骨脆性增加,造成患者骨折发生率增高。随着我国社会老龄化进程的加剧,骨质疏松症的发病率逐年升高,严重影响着老年人的身体健康与生活质量。在我国... 详细信息

背景：骨质疏松症是以骨量的减少和骨微结构的破坏为特征的一种全身性代谢性骨病,会导致骨脆性增加,造成患者骨折发生率增高。随着我国社会老龄化进程的加剧,骨质疏松症的发病率逐年升高,严重影响着老年人的身体健康与生活质量。在我国,对于骨质疏松症的治疗以抗骨质吸收为主,无法达到增加骨量的目的。2002年美国FDA批准低剂量PTH间断性皮下注射治疗骨质疏松,2010年PTH被批准进入中国市场,治疗女性绝经后重度骨质疏松。研究证实,甲状旁腺素增加骨量效果明显,对于骨质疏松及其导致的骨折、关节假体松动以及二磷酸盐长期使用所引起的非典型骨折等均具有明显的疗效。在临床治疗的评价中,甲状旁腺素(商用名：特立帕肽)被证实具有可靠的抗骨质疏松作用。甲状旁腺素具有促骨质形成、增加骨密度和降低骨折发生风险等明显的作用,但其具有间断小剂量促进骨形成,连续大剂量促进骨吸收的双向调节作用。这种特殊的双重调节作用导致PTH的疗效并不十分理想。而不同剂量所造成的不同效应跟甲状旁腺素结合受体导致不同信号通路被激活有关。目前研究显示,PTH的生物学作用主要是通过三条信号通路的激活：分别是cAMP/PKA、 PLC/PKC和nonPLC/PKC通路。其中,PTH主要通过cAMP/PKA这一通路对骨的代谢起调节作用,但这种调节是双向的,与应用的剂量相关。PLC/PKC信号通路对PTH的破骨作用有辅助增强的功能,而nonPLC/PKC通路能够特异性对某些部位进行成骨调节作用。参与介导PTH/nonPLC/PKC的亚信号通路还没有清晰的界定,但是相关的研究提示存在多因子参与、多亚信号通路介导的可能。1)PTH(1-34)的C端结构,包括PTH(3-34)和PTH(29-34),介导nonPLC/PKC信号途径,具体的信号介导机制需要深入研究。2)不能排除cAMP/PKA参与介导nonPLC/PKC的可能。最近我们的研究发现cAMP/PKA选择性PTH模拟肽,GlylArgl9hPTH(1-28)(即G1R19(1-28)),可激活PKC,提示cAMP/PKA可能部分参与PTH/nonPLC/PKC信号途径。3)Rho A/Rho Kinase/PLD可能介导nonPLC/PKC。通过对这三条通路的研究,在甲状旁腺素基本结构基础之上,研究具有更强的成骨作用、结构更短的模拟肽是研究的重要方向之一。在甲状旁腺素信号通路的研究中,cAMP和PLC的研究相对比较成熟,PKC的研究相对困难,主要是因为缺乏灵敏快捷地检测PKC活化的技术。以往对于PKC激活的检测方法主要包括PKC分子细胞内转位,PKC分子局部氨酸残基的磷酸化等,这些方法只能间接检测PKC的活性,而且需要借助放射性同位素的作用,需要较高的实验条件和技术,而且放免法背景高,灵敏度低,不利于研究的进行。荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术,是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移),这种技术近些年被广泛的用来研究信号通路,其对分子的活化具有直接灵敏的反映。Newton等人最先报道了检测PKC活化的FRET系统,即在青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)之间插入了特异性PKC作用底物和FHA2磷酸化肽段的结合域,构成了CKAR分子。转染了此质粒的细胞可以表达出CKAR报告分子,通过共聚焦显微镜分析两种荧光强度的相对改变,即比较两者之间的比值变化(C/Y),可以作为判断刺激物是否激活PKC的证据。采用这个实验模型联合构建的甲状旁腺素稳定转染细胞系,通过改变甲状旁腺素的氨基酸的排列结构和受体的信号通路表达,研究不同通路及分子对于PKC活化的作用及强度,更好的研究并优化PTH模拟肽的作用。目的：构建目的质粒pcDNA3.1(+)-PTHR及pcDNA3.1(+)-DSEL。通过G418压力筛选法构建两种稳定转染细胞系并进行鉴定。通过前期建立的FRET技术及共聚焦显微镜检测FRET体系在稳定转染细胞系中的表达是否可以满足PKC活化的检测。通过不同的抑制剂与多种甲状旁腺素模拟肽,探究PKC活化所需要的条件,探究可能参与nonPLC/PKC通路的途径,以及各条通路之间的关系。最后通过RT-PCR检测与这些通路相关的基因的表达,并验证实验结果。方法：通过碱裂解法从扩增的含有目的质粒的大肠杆菌中提取目的质粒,并通过质粒提取试剂盒纯化。紫外分光光度计测量质粒浓度及纯度。通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因片段)和质粒pcDNA3.1(+),二者分别由DNA限制性内切酶EcoRI与NotI双酶切,

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磷脂酶C非依赖的蛋白激酶C信号通路在甲状旁腺素调节骨与肌肉代谢中的作用初探

磷脂酶C非依赖的蛋白激酶C信号通路在甲状旁腺素调节骨与肌肉代谢...

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作者：何友华南方医科大学

学位级别：硕士

背景:甲状旁腺素(Parathyoid Hormone,PTH)是一种临床上常用的抗骨质疏松药物,有关其信号转导特征与其生物学作用的关系目前仍有待明了。我们的前期研究显示,PTH激活甲状旁腺素Ⅰ型受体通过nonPLC/PKC信号途径提升松质骨骨量,改善骨小... 详细信息

背景:甲状旁腺素(Parathyoid Hormone,PTH)是一种临床上常用的抗骨质疏松药物,有关其信号转导特征与其生物学作用的关系目前仍有待明了。我们的前期研究显示,PTH激活甲状旁腺素Ⅰ型受体通过nonPLC/PKC信号途径提升松质骨骨量,改善骨小梁微结构。我们已经合成了特异性激活nonPLC/PKC信号途径的PTH模拟肽(MY-1),发现MY-1肽具有成骨细胞分化的作用,但不具有激活破骨细胞的作用,体内应用发现在胫骨,具有与PTH(1-34)等效的防切卵巢后骨丢失作用。我们在同样的动物模型中发现,小鼠椎旁肌肉出现改变。骨骼肌与骨统属于运动系统,在维持机体的稳定及运动功能发挥重要作用,二者均来源于中胚层,且表达甲状旁腺素受体。人类老化的过程中,肌肉较少往往伴随骨质疏松,而肌少症引发的跌倒风险是骨质疏松骨折发生的主要原因之一。因此研究PTH对骨与肌肉代谢作用及信号分子和途径,不仅有利于骨质疏松的研究,更有利于肌少症的预防和治疗。目的:利用我们前期研究获得的PTH模拟肽,以探究各信号通路在PTH调节骨骼和骨骼肌代谢中的作用,在综合的基础上,探讨PTH对肌肉骨骼系统的影响。方法:取32只7周龄C57BL/6J雌鼠,构建去势骨质疏松模型,皮下注射PTH模拟肽。在第4周末活体检测后肢腓肠肌肌力,取胫骨行显微CT松质骨定量分析,取胫骨做硬组织切片行骨形态计量学分析。取第4腰椎椎旁肌肉做病理切片切片,HE染色观测肌纤维面积和肌纤维细胞核数量,ATP酶染色观测肌纤维类型及数量。另取5只8周龄C57BL/6J小鼠体外提取BMSC、BMMs;诱导BMSC成骨分化行茜素红染色及钙定量,碱性磷酸酶染色及酶活性测定,诱导BMMs破骨分化行TRAP染色及酶活性测定;提取3日龄C57BL/6乳鼠颅骨原代成骨细胞,Real-time PCR检测骨代谢相关基因的表达;另取5只4周龄C57BL/6J小鼠提取腓肠肌肌卫星细胞,体外诱导Real-time PCR检测成肌代谢相关基因表达。结果:(1)胫骨松质骨定量:骨小梁体积分数PTH(1-34)组、MY-1组显著高于OVX组(P<0.05)与SHAM组无统计学差异;(2)胫骨上段病理切片显示:骨小梁面积百分数PTH(1-34)组、MY-1组显著高于OVX组(P<0.05)与SHAM组无统计学差异,骨小梁矿化沉积率PTH(1-34)组、MY-1组显著高于OVX组(P<0.05),且PTH(1-34)高于SHAM组。骨小梁单位周长破骨细胞数目PTH(1-34)组显著高于OVX组(P<0.05),MY-1组与OVX组无统计学差异。(3)BMSC成骨分化:茜素红染色可见PTH(1-34)组、MY-1组较对照组钙结节明显增加,碱性磷酸酶染色可见PTH(1-34)组、MY-1组较对照组出现深蓝染色,ALP定量显示PTH(1-34)组、MY-1组酶活性显著高于对照组(P<0.05),而PTH(1-34)组、MY-1组无统计学差异;(4)BMMs破骨分化:抗酒石酸酸性磷酸酶染色TRAP染色显示PTH(1-34)组TRAP阳性细胞数明显多于对照组(P<0.05),酶定量测定显示PTH(1-34)组显著高于较对照组(P<0.05),而MY-1组与对照组无统计学差异。(5)Real-time PCR检测颅骨原代成骨细胞及BMSC基因表达:PTH(1-34)组、MY-1组成骨特异基因(ALP,BSP OC、OPG)表达显著高于对照组(P<0.05)。而PTH(1-34)组Rankl基因表达显著高于对照组(P<0.05),MY-1组与对照组无显著差异。(6)腓肠肌肌力检测:OVX组最大收缩力较SHAM组显著降低(P<0.05),OVX组收缩至肌颤的有效收缩次数较SHAM组显著降低(P<0.05),PTH组显著高于OVX组(P<0.05),而MY-1组与OVX组无统计学差异。(7)椎旁肌病理切片:HE染色观察OVX组肌纤维平均横截面积较SHAM大,单根肌纤维平均细胞核数减少(P<0.05),PTH(1-34)组与SHAM组无统计学差异,MY-1组与OVX组无统计学差异;ATPase染色观察OVX组I型及II a型肌纤维数量较SHAM组低,II b型肌纤维较SHAM组高(P<0.05),而PTH组I型及II a型肌纤维数量较OVX高,II b型肌纤维数量低于OVX(P<0.05)。(8)成肌相关基因表达:成肌分化基因(Myf5、Myf6)PTH(1-34)组和MY-1组显著高于con组,(MyHc I、MyoG)基因MY-1组显著高于 con 组(P<0.05),MyoD 基因 PTH(1-34)显著低于 con 组(P<0.05)。结论:没有证据表明nonPLC/PKC通路PTH模拟肽MY-1促进破骨细胞的形成和分化,但能减轻由雌激素

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中国人骨质疏松症专用生存质量量表的设计与信效度研究

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作者：何藻鹏南方医科大学

学位级别：硕士

背景：骨质疏松症是一种以骨量低下,骨微结构损坏,导致骨脆性增加,易发生骨折为特征的全身性骨病。其严重后果是发生骨质疏松性骨折,骨折引起的疼痛及功能障碍导致患者生存质量明显下降。即使在没有发生骨折的情况下,骨质疏松症患者也... 详细信息

背景：骨质疏松症是一种以骨量低下,骨微结构损坏,导致骨脆性增加,易发生骨折为特征的全身性骨病。其严重后果是发生骨质疏松性骨折,骨折引起的疼痛及功能障碍导致患者生存质量明显下降。即使在没有发生骨折的情况下,骨质疏松症患者也可能要承受疼痛并出现躯体功能障碍、认知功能障碍、精神障碍,从而使日常活动受限、工作能力丧失、社会角色丧失、社会支持减少。为能准确描述骨质疏松症症状及其功能影响结果,健康相关生存质量的评估作为评价骨质疏松病人的一个重要临床工具已在世界范围内被广泛应用。随着生物-心理-社会医学模式的形成,疾病对于人体造成的负担,已不能完全被疾病状态（如器官损伤面积、瘤体的大小等指标）所描述,一些心理学因素,如个体的痛苦感、焦虑感及其实现家庭、社会功能的困难程度、经济负担和认知能力的下降也必须包含在其中。基于上述观点,“健康相关生存质量”的概念被提出。1993年WHO生存质量研究组将HRQOL定义为：不同文化和价值体系中的个体对于他们生活目标、期望、标准以及所关心的有关生活状态的体验,同时强调对自身价值和自我实现的认知以及对社会的责任感和义务。因此,生存质量不应以给患者所提供医疗服务的频率作为评定,而是注重患者在大多程度上能够获得寿命的延长,疼痛的减轻,机能的恢复,防止工作能力的丧失。WHO制定了生存质量的一般准则（维度）,主要包括身体机能、心理状态、独立生活、社会关系、生活环境和宗教信仰六个方面,围绕着生理、心理、社会三个领域的内容来评价患者的生存质量,评价疾病及其治疗方法对患者身体、心理和社会造成的影响。鉴于此,医学工作者对健康相关生存质量的理解与认识逐步加深,常采用各种量表工具考察人们的生理、心理、社会功能状态以及对生活各领域的满意度或总满意度作为指标评价,用以评估患者的生存质量状况。在HRQOL的引入和探索期,人们主要借用大量的一般人群评价量表来对病人的生存质量进行测定。此后,经过研究数据的积累,生存质量研究转向成熟,开始出现关于特定肿瘤或慢性病的生存质量测评,大量的面向疾病的特异性测定量表被研制开发并投入使用。骨质疏松症作为一常见老年慢性疾病,也被归入生存质量研究的范畴,研究中对骨质疏松症相关特异性量表的需求也越来越高。国外用生存质量量表评估骨质疏松症疾病进展和治疗效果,通常被用作骨质疏松性骨折病例的生物力学和影像学评估的次要评定结果,也逐步成为健康科学研究和临床试验的核心环节。目前国内学者进行骨质疏松症患者生存质量评估工作,常采用的工具有：1)普适性量表,如36条目简明健康状况调查问卷（Short Form36-item Questionnaire, SF-36）,条目内容的专科特异性不强,欠缺专科疾病变化的敏感指标;2)国外专用量表汉化版,如欧洲骨质疏松症基金会生活质量问卷（Quality of Life Questionnaire of the European Foundation for Osteoporosis, QUALEFFO）,直接汉化的条目内容不完全符合国人语言习惯、生活习惯,国内尚欠缺普通话版的信度、效度检验;3)自行建构、编制条目后制定的骨质疏松生活质量量表（Osteoporosis Quality of Life Scale, OQOLS）、骨质疏松症中医量表,有相关信度、效度检验,但编制过程复杂、保留条目较多、缺乏简式版本,影响了实际推广使用。不断有学者探讨生存质量的测定方法,生存质量量表的编制模式也相对成熟,但仍存在不少问题,比如量表制定过程中,条目池如何形成,如何广泛的全面的代表生存质量的内容。条目又如何筛选,如何去除重复冗余的内容,如何评价筛选方法,保证条目的代表性。如何确定条目选项的反应尺度等等。该过程涉及繁复的工作,难以在短期研究中着实完成,成为量表编制的难点以及影响量表质量的关键。由于历史的原因,已经有大量的外语量表产生并在国外大量应用,搜集国外量表条目可以作为搜集新量表条目池的一条捷径,绕过了条目设计与筛选的大量工作,但面临的是解决“跨文化”带来的内容理解差异、生活背景差异、习惯模式改变、调查操作难度等。能否通过标准化的翻译过程以及大量文化调适的工作使得成为我们能够使用的生存质量量表,是本研究尝试解决的一个问题。当然国外量表的原始版本均经过反复的信度、效度验证,但不一定能应用于不同国家不同语言文化背景的人群,尽管作了翻译和文化调适,我们还需要重新评估翻译版本的信度、效度目的：本研究旨在：设计一份简短实用的疾病专用生存质量量表,中国人骨质疏松症专用生存质量量表（Chinese Osteoporosis Quality of Life Questionnaire, COQOL）,能有效应用于国内原发性骨质疏松症患者的生存质量评估。量表具备较强的针对性、可接受性、可操作性、可行性

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PLC非依赖PKC途径介导PTH成骨作用的体外研究

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作者：李俊青南方医科大学

学位级别：硕士

背景：随着社会老龄化的进程,骨质疏松症的发病率逐年上升,并严重影响着老年人的身体健康。目前,治疗骨质疏松症的药物以抗骨质吸收为主要作用,而对骨量的增加有限,近期来甲状旁腺素（PTH）被证实具有可靠的抗骨质疏松作用,可促进皮质... 详细信息

背景：随着社会老龄化的进程,骨质疏松症的发病率逐年上升,并严重影响着老年人的身体健康。目前,治疗骨质疏松症的药物以抗骨质吸收为主要作用,而对骨量的增加有限,近期来甲状旁腺素（PTH）被证实具有可靠的抗骨质疏松作用,可促进皮质骨和松质骨形成、增加骨密度、降低骨折发生率等,是目前临床可靠的促进骨合成代谢的药物。但PTH的疗效并不十分理想,主要是因为其对骨组织具有双向作用,这也与其激活多种信号通路有关。目前认为PTH主要激活三条信号通路：cAMP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC通路。既往研究发现,cAMP/PKA通路是PTH骨作用的主要机制,但有双向作用,PLC/PKC通路有辅助增强PTH的破骨作用,而nonPLC/PKC通路具有成骨部位特异性。目前,信号通路的研究主要通过检测蛋白激酶的活化,蛋白激酶活化的检测方法主要有细胞内转位、丝苏氨酸残基的磷酸化及特殊底物磷酸化,这些方法缺乏直接性及灵敏性。而荧光共振能量转移（FRET）技术近年来被广泛用于信号通路的研究,具有直接灵敏的特性。Newton等首先报道了检测PKC活化的FRET系统,在CFP和YFP之间插入了特异性PKC作用底物和FHA2磷酸化肽段的结合域;PKC-delta激活报告分子与其类似,插入了特异性PKC-delta作用底物和FHA2磷酸化肽段的结合域。当转染了两种质粒的细胞表达出CKAR分子和PKC-delta报告分子时,在共聚焦显微镜下根据荧光强度的相对改变（C/Y）就可以判断刺激物是否激活了PKC或PKC-delta。目的：提取、纯化及鉴别目的质粒：CKAR、PKC-delta、PTHR1及DSEL,再通过FRET技术及共聚焦显微镜证明PKC或PKC-delta活化的FRET系统可用于信号通路的研究,并探讨nonPLC/PKC通路是否有其他途径的参与,以及它们之间的关系。方法：运用热激法转化大肠杆菌,扩增目的质粒,并通过碱裂解法从大肠杆菌中提取质粒,再通过质粒提取试剂盒纯化质粒。通过紫外分光光度计测量其浓度和纯度,经酶切及凝胶电泳鉴定质粒。运用脂质体转染法分别将CKAR或PKC-delta质粒转染进HEK293细胞体内,培养48h后通过共聚焦显微镜分析CKAR或PKC-delta质粒是否可在细胞内正常表达以及在佛波酯（TPA）的刺激下FRET效率及青色荧光与黄色荧光强度的比值（C/Y）是否改变,判断它们是否具备检测PKC或PKC-delta活化的功能。 PTHR1是PTH的野生型受体,与PTH结合后激活三个通路,而DSEL为人工合成的突变型受体,其与PTH结合后不能激活PLC/PKC通路。将PTHR1或DSEL质粒与CKAR质粒共转染进HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜观察PTH（1-34）是否可引起CKAR分子发生FRET改变,并与不转染受体质粒的HEK293细胞作对比,以此判断PTHR1和DSEL质粒是否可在细胞内成功表达以及其所表达的蛋白是否具有功能。目前认为,PTH（1-34）具备全段PTH的活性,cAMP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC三个途径均可激活;G1R19（1-34）不激活PLC/PKC通路;G1R19（1-28）可激活cAMP/PKA通路,不激活PL/PKC通路,而对nonPLC/PKC通路的激活存在争议。分别使用这三种不同的甲状旁腺素信号选择性类似肽刺激共转染PTHR1或DSEL质粒和CKAR或PKC-delta质粒的HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜观察FRET的改变,判断甲状旁腺素对PKC的激活情况,并从多个角度出发探索甲状旁腺素的信号通路。结果：扩增各质粒,并用质粒提取试剂盒提取及纯化目的质粒,用紫外分光光度计测量质粒的纯度和浓度,PKC-delta、CKAR、PTHR1和DSEL质粒的A260/A280分别为1.94、1.93、1.93和1.91,浓度分别为431.4、456.3、501.8和522.6ng/μl。经不同限制性内切酶对四种质粒酶切后,凝胶电泳显示质粒片段均在相应的理论值范围。在培养体系中加入终浓度200nmol/L的TPA后,在表达CKAR和PKC-delta报告分子的HEK293细胞,CFP的发射光增强,YFP的发射光减弱,相应的FRET效率下降,青色与黄色荧光强度的比值（C/Y）明显增大。在未转染甲状旁腺素受体质粒（PTHR1或DSEL）的细胞,10μmol/L的PTH（1-34）未能明显改变C/Y的值,而在转染有PTH受体的细胞内,1OOnmol/L的PTH（1-34）即可使C/Y明显增大。在转染CKAR质粒并表达PTHR1或DSEL受体的HEK293细胞,0.1%TFA作为三种肽的溶剂,均未能

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