检索结果-南通市图书馆

作者：李荣耀汕头大学

学位级别：硕士

研究背景与研究目的:食管癌是全球第七大常见癌症,传统的食管癌治疗方法包括手术、放疗、化疗和综合治疗。基于顺铂的化疗方案被广泛应用于晚期食管癌的一线治疗。然而,由于顺铂耐药和缺乏可靠的预测患者顺铂敏感性的生物标志物,食管癌... 详细信息

研究背景与研究目的:食管癌是全球第七大常见癌症,传统的食管癌治疗方法包括手术、放疗、化疗和综合治疗。基于顺铂的化疗方案被广泛应用于晚期食管癌的一线治疗。然而,由于顺铂耐药和缺乏可靠的预测患者顺铂敏感性的生物标志物,食管癌患者的生存和预后仍不理想。因此,寻找食管癌中顺铂敏感性的潜在生物标志物至关重要。有研究发现顺铂通过caspase-3/GSDME信号轴诱导肿瘤细胞焦亡（Pyroptosis）,从而增强肿瘤的顺铂敏感性。然而,顺铂诱导细胞焦亡的具体分子机制尚不清楚。本研究基于大样本的食管癌蛋白质组学数据,寻找影响食管癌细胞焦亡的关键分子,并探讨其参与顺铂诱导食管癌细胞焦亡的分子机制,为临床预测食管癌顺铂敏感性和预后提供理论依据。材料与方法:1)应用生物信息学综合分析124对食管癌与癌旁组织的蛋白质组学数据,分析细胞焦亡相关蛋白对食管癌患者预后的预测效能,从而筛选出关键蛋白进行验证。2)通过构建Cox比例风险回归模型,单因素和多因素独立预后分析,风险热图分析,ROC曲线分析,进一步评价候选分子CAPN1（calpain-1）和CAPN2（calpain-2）的预后价值。3)采用免疫组织化学的方法检测并分析108例食管癌患者接受同步放化疗治疗前的肿瘤活检组织中CAPN1和CAPN2的表达特征和临床意义。4)在细胞层面,应用钙蛋白酶抑制剂PD150606或Calpeptin处理,以及CRISPR-Cas9基因敲除CAPN1或CAPN2的食管癌细胞模型,通过钙蛋白酶活性检测,蛋白免疫印迹、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放检测和细胞活力检测,确定CAPN1和CAPN2是否参与顺铂诱导的食管癌细胞焦亡。5)通过CRISPR-Cas9基因敲除模型和蛋白免疫印迹实验探索CAPN1和CAPN2促进顺铂诱导食管癌细胞焦亡的分子机制。研究结果:1)蛋白质组学和生物信息学分析结果表明CAPN1和CAPN2是重要的食管癌细胞焦亡相关蛋白。与配对癌旁相比,细胞焦亡相关蛋白CAPN1的蛋白表达水平在124例食管癌组织中显著下调;CAPN1与CAPN2在食管癌组织中的蛋白表达量呈显著正相关;CAPN1和CAPN2的高表达与食管癌患者良好的总生存和无瘤生存相关。2)CAPN1和CAPN2联合病理分期的综合风险模型的患者预后预测效能比单独CAPN1、CAPN2或者p TNM分期的预测效能更高。3)在接受处理前的食管肿瘤活检样本中,CAPN1和CAPN2的高表达与食管癌患者同步放化疗的完全缓解和良好预后有关。4)细胞水平上,顺铂诱导食管癌细胞焦亡,联用钙蛋白酶抑制剂或者CAPN1/CAPN2的基因敲除均减少了顺铂处理后caspase-3和GSDME的剪切以及LDH的释放,细胞活力增加。这些结果表明,CAPN1和CAPN2在顺铂诱导细胞焦亡和顺铂敏感性中发挥重要作用。5)分子机制上,免疫印迹实验结果表明,顺铂处理后钙蛋白酶激活BAX和BAK,进而导致caspase-9和caspase-3的剪切,引发GSDME依赖的食管癌细胞焦亡。研究结论:CAPN1和CAPN2通过激活BAK/BAX-caspase-9-caspase-3-GSDME信号轴促进了顺铂诱导的食管癌细胞焦亡,增强了食管癌细胞的顺铂敏感性。CAPN1和CAPN2有望成为预测食管癌患者顺铂敏感性和良好预后的潜在生物标志物,为指导食管癌个性化治疗提供了新的思路。

关键词： CAPN1 CAPN2 顺铂敏感性细胞焦亡食管癌

食管癌重要功能基因SDC2真核表达载体的构建与鉴定

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食管癌重要功能基因SDC2真核表达载体的构建与鉴定

作者：蒋奶贵汕头大学

学位级别：硕士

黏结蛋白聚糖2（syndecan-2, SDC2）,又名纤维蛋白聚糖（Fibroglycan）,最早在肺成纤维细胞表面发现,是细胞表面硫酸肝素蛋白多糖家族成员之一硫酸肝素蛋白多糖家族同时还包括SDC1、SDC3和SDC4等,均为单跨膜蛋白多糖。已有的研究表... 详细信息

黏结蛋白聚糖2（syndecan-2, SDC2）,又名纤维蛋白聚糖（Fibroglycan）,最早在肺成纤维细胞表面发现,是细胞表面硫酸肝素蛋白多糖家族成员之一硫酸肝素蛋白多糖家族同时还包括SDC1、SDC3和SDC4等,均为单跨膜蛋白多糖。已有的研究表明SDC2参与了多种生物学过程。早期的研究侧重于侧重于揭示SDC2在细胞粘附和信号转导中的功能。在斑马鱼胚胎期的血管发育中发挥重要作用,对于海马神经元的分化过程中也是必需的。近年来,有关其与肿瘤的相关性越来越引起人们的兴趣,成为研究热点。根据文献报道来看,目前主流观点认为SDC2在多种肿瘤中上调表达,是一个促癌因子,如食管癌、结肠癌、前列腺癌、纤维肉瘤等;也有文献报道SDC2可能是一个抑癌因子,如骨肉瘤等。本课题组以往的研究证明,SDC2在食管癌组织中显著过表达,与瘤块的大小及淋巴结转移相关,提示在食管癌中可能发挥着重要功能。基于此,在系统综述SDC2与肿瘤最新研究进展的基础上,本论文成功构建了三种SDC2的真核表达载体,为进一步揭示SDC2在食管癌发生发展中的生物学功能奠定了实验材料基础。

关键词：硫酸肝素蛋白多糖食管癌真核表达载体构建

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食管癌细胞差异表达核基质蛋白的分离与鉴定

食管癌细胞差异表达核基质蛋白的分离与鉴定

作者：熊兴东汕头大学

学位级别：硕士

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，其发病机制至今不甚明了。有研究发现与正常的食管上皮组织相比食管癌中的核基质蛋白（NMPs）有明显改变，提示某些核基质蛋白可能参与了食管癌的发生与发展，但究竟是哪些核基质蛋白有变化尚不清楚。为此... 详细信息

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，其发病机制至今不甚明了。有研究发现与正常的食管上皮组织相比食管癌中的核基质蛋白（NMPs）有明显改变，提示某些核基质蛋白可能参与了食管癌的发生与发展，但究竟是哪些核基质蛋白有变化尚不清楚。为此，本研究联合运用双向电泳、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、RT-PCR、cDNA克隆测序和生物信息学分析等技术手段对食管癌细胞差异表达核基质蛋白进行了研究，以期为进一步研究食管癌的发病机制提供新线索。主要研究内容与方法： 1．应用硫酸铵沉淀法提取SHEE和SHEEC细胞的NMPs，通过Western blotting对SHEE和SHEEC细胞的NMPs进行检测分析。两种细胞的NMPs经双向凝胶电泳—银染后，利用PDQuest6.2软件分析SHEE和SHEEC细胞NMPs的双向电泳结果，并对其中三个差异表达NMPs进行MALDI-TOF-MS分析。 2．通过RT-PCR、cDNA克隆和测序等技术进一步验证食管癌差异表达NMPs—STRBP8：分别提取SHEE和SHEEC细胞的总RNA，运用RT-PCR扩增STRBP8 cDNA片段，插入pGEM-T easy载体，转化TOP10F’大肠杆菌感受态细胞，在Amp下筛选阳性克隆，DNA序列测定后进行BLAST比对。 3．利用生物信息学手段对STRBP8的结构和功能进行初步预测。主要研究结果： 1．Western blotting分析结果显示在所提取的NMPs中组蛋白等非NMPs组分已被基本去除，而DNA拓扑异构酶Ⅱα和PCNA等主要NMPs组分被保留下来，表明NMPs的质量是可靠的，利用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术初步鉴定出了3个食管癌差异表达NMPs—Cytoskeletal tropomyosin，FKBP6和STRBP8。 2．利用RT-PCR成功扩增出STRBP8 cDNA。将其cDNA序列插入pGEM-T easy载体后，转化TOP10F’大肠杆菌感受态细胞，经筛选获得含STRBP8的阳性克隆。测序结果显示，克隆得到的STRBP8的cDNA片段与Genebank数据库上的序列是完全一致的。 3．利用生物信息学对STRBP8的结构和功能进行了初步的预测，发现STRBP8存在多个糖基化和磷酸化位点，其二级结构以无规线团为主并有部分α-螺旋和β-折叠结构。结论与意义: 1.在我们实验室建立了双向凝胶电泳一银染技术并优化了部分实验条件;利用PDQuest6.2软件建立了一套成熟的双向电泳凝胶图像分析方法。 2.通过双向凝胶电泳和MALDI一TOF一MS等技术对SHEE和SHEEC之间的 NMPs的差异性进行研究，初步鉴定出3个差异表达NMPs，提示可能与食管癌相关。 3.利用RT一PCR、cDNA克隆与测序分析发现STRBPS mRNA只出现在食管癌细胞SHEEC中，进一步验证了质谱分析结果。 4.利用生物信息学手段对STRBPS的结构与功能所进行初步预测，为深入研究STRBPS在食管癌中的功能提供了理论依据。

关键词：食管癌双向电泳基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱核基质蛋白类视网膜母细胞瘤结合蛋白8

新癌基因NGAL的新型TPA反应激活蛋白的分离与初步鉴定

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新癌基因NGAL的新型TPA反应激活蛋白的分离与初步鉴定

作者：缪成贵吉林大学

学位级别：硕士

分别应用寡核苷酸亲和层析法,改进后的寡核苷酸亲和层析法和离心管层析法从TPA诱导后的食管癌细胞EC109中分离调控NGAL诱导表达的TPA反应激活蛋白,通过EMSA、SDS-PAGE结合银染判定这三种方法的优缺点,并应用生物质谱结合生物信息学等手... 详细信息

分别应用寡核苷酸亲和层析法,改进后的寡核苷酸亲和层析法和离心管层析法从TPA诱导后的食管癌细胞EC109中分离调控NGAL诱导表达的TPA反应激活蛋白,通过EMSA、SDS-PAGE结合银染判定这三种方法的优缺点,并应用生物质谱结合生物信息学等手段对这些蛋白进行初步鉴定。寡核苷酸亲和层析法能够分离纯化一定丰度的TPA反应激活蛋白,但存在较多Tween 20的干扰;离心管层析法操作流程简单,快捷,但获得的激活蛋白较少,不利于下一步的质谱鉴定;改进后的寡核苷酸亲和层析法排除了Tween 20的干扰,能够分离纯化低背景、高丰度的激活蛋白。通过生物质谱并结合生物信息学等手段分析,初步筛选出12个调控NGAL诱导表达的TPA反应激活蛋白,这其中大部分为尚未报道的新型TPA反应激活蛋白。通过本实验,建立了稳定的改进后寡核苷酸亲和层析法技术平台,并初步筛选出12个调控NGAL表达的新型TPA反应激活蛋白。

关键词：寡核苷酸亲和层析 NGAL TPA反应激活蛋白食管癌

胃癌细胞NGAL基因表达调控及其细胞信号转导通路

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胃癌细胞NGAL基因表达调控及其细胞信号转导通路

作者：杜则澎汕头大学

学位级别：硕士

NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin),即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白编码基因,是1993年Kjeldsen等人在研究中性粒细胞明胶酶(gelatinase B,即matrix metalloproteinase-9,MMP-9)时首先被发现的。随着功能研究的深入,发现NGAL基因与炎症、免疫反应、细胞分化、细胞凋亡、组织重构以及多种肿瘤的发生与发展等密切相关。我们课题组以往研究表明,NGAL基因在胃癌组织细胞中呈现显著异常过表达,荧光素酶报告基因分析显示NGAL基因启动子在胃癌细胞BGC823中具有较强的活性,同时表现明显的TPA反应性,报告基因表达活性比基础状态时的上升3～9倍,表明NGAL基因启动子区存在着TPA反应元件(TPA response element,TRE),NGAL基因的表达是TPA诱导性的,与以往我们在食管癌组织细胞中的研究结果相一致。另外,结合突变技术研究发现,NGAL基因启动子核心元件位于转录起始位点上游-110/-79区段。同时本课题组以食管癌细胞EC109为研究对象,联合运用寡核苷酸DNA亲和层析,MALDI-TOF-MS等技术,对NGAL基因启动子-107/-82区段的TRE结合蛋白进行了分离纯化,最后确定了C19、KLF10、KLF15和RXRβ等新核蛋白因子。为此,本文拟在以往研究工作基础上,以胃癌细胞BGC823为对象,联合运用分子克隆、双荧光素酶报告基因活性检测、半定量RT-PCR、蛋白质印迹等实验技术,筛选能够与NGAL基因启动子区TRE结合的转录激活因子,确定NGAL是应答TPA等促癌物的一个新靶基因。结果表明,分别转染C/EBPβ、AP-1、C19、KLF10、KLF15、KIAA1949和RXRβ等基因的表达质粒后,报告基因的活性有不同程度的升高,其中转染C/EBPβ的为最高,可达对照组的8.76倍,说明C/EBPβ等均有可能是应答NGAL基因TPA反应性的核蛋白因子;进一步的特异性激酶抑制剂研究发现,MEK→ERK1/2细胞信号转导通路在TPA激活的NGAL基因转录中发挥主要作用。

关键词： NGAL基因胃癌 TPA反应元件 ERK1/2 AP-1 C/EBPβ

NGAL基因的原核融合表达、抗体制备及其在食管癌组织中的表达模式

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NGAL基因的原核融合表达、抗体制备及其在食管癌组织中的表达模式

作者：王朝阳汕头大学

学位级别：硕士

NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)蛋白首先由Kjeldsen等人于1993年在中性粒细胞内发现，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关。我们在运用基因芯片技术筛选永生化食管... 详细信息

NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)蛋白首先由Kjeldsen等人于1993年在中性粒细胞内发现，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关。我们在运用基因芯片技术筛选永生化食管上皮细胞系SHEE和由SHEE转化而来的食管癌细胞系SHEEC之间的差异表达基因时发现NGAL基因在SHEEC细胞中过表达，进一步研究发现NGAL基因可能与肿瘤的侵袭与转移相关，但确切的功能与机制不清楚。最近我们研究发现NGAL基因还可能参与细胞的分化。越来越多的研究结果提示NGAL可能是一种重要的炎症或肿瘤标志物，对判断与监测病情变化具有重要的意义。但是目前无论是NGAL蛋白本身还是抗NGAL的抗体均未商品化，所以本文通过原核表达的策略首先获得纯的NGAL蛋白、然后制各其抗体，最后通过对各种食管癌组织样品进行检测，探讨NGAL基因在食管癌中的表达模式，这对深入研究NGAL在生理和病理过程中所发挥的功能具有科学意义和应用价值。主要研究内容和方法：一、构建四种NGAL原核融合表达载体并比较分析蛋白表达产物。二、Ni-金属鏊合层析技术纯化NGAL蛋白并制备多克隆抗体。三、研究NGAL基因在食管癌组织及其血浆中的表达模式。主要的研究结果：一、构建了NGAL基因四种原核融合表达载体。二、成功进行了四种NGAL融合蛋白的原核表达，并分析了它们的表达量、可溶性及其细胞定位，最后筛选出了适合大样表达NGAL蛋白的原核融合表达载体pDsbA2.0-NGAL。三、成功进行了NGAL蛋白的纯化与鉴定，获得了较纯的NGAL蛋白。四、成功制备出效价高、特异性较好的NGAL多克隆抗体，适用于IHC、Western blotting及ELISA等。五、运用IHC、Western blotting及ELISA等实验技术，初步探讨了NGAL基因在食管癌组织中的表达模式。汕头大学医学院硕士研究生论文结论及意义: 一、不同的融合伴侣对靶蛋白的表达量、细胞定位以及可溶性会产生不同的影口向。二、NiZ七金属鳌合层析纯化技术是一种高效的纯化蛋白的技术。三、成功建立了检测NGAL表达模式的实验技术:免疫组织化学、western blotting 与EL工SA技术，通过不同层面揭示了NGAI砂在食管癌中的表达模式:IHC实验显示染色阳性细胞定位于细胞胞浆且集中于高分化食管鳞状上皮细胞癌癌巢癌珠部分;Western blotting实验结果显示NGAL蛋白在部分食管癌组织中表达上调，但尚需增加样本量进一步确证;而ELISA实验结果初步显示在正常人群血浆/血清中能够检测到NGAL基因的蛋白表达产物，这为进一步探讨NGAL基因在食管癌中的生物学功能与意义奠定了实验基础。

关键词： NGAL,食管癌,原核表达,抗体制备,表达模式

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NGAL启动子区的克隆与初步鉴定

NGAL启动子区的克隆与初步鉴定

作者：王子良汕头大学

学位级别：硕士

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin,NAGL)是脂质运载蛋白(lipocallin)家族的一个新的成员,是1993 年在人中性粒细胞中首先被发现的。同源分析发现,NGAL与小鼠癌基因产物24 p3同源性很高;另... 详细信息

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin,NAGL)是脂质运载蛋白(lipocallin)家族的一个新的成员,是1993 年在人中性粒细胞中首先被发现的。同源分析发现,NGAL与小鼠癌基因产物24 p3同源性很高;另外研究发现,在结肠癌和乳腺癌等肿瘤组织、食管癌细胞系和卵巢癌细胞系中NGAL的表达明显增强。这提示NGAL可能是人类的一种新的癌基因。然而迄今,NGAL在肿瘤组织细胞中的过表达调控机制尚不清楚。为此本 ‘ 研究联合运用PCR、DNA重组、嵌套缺失以及双荧光素酶报告基因检测等技术对 NGAL启动子区进行定位,同时利用生物信息学方法预测其反式作用因子,为全面阐明NGAL表达调控机制提供基本数据。内容与方法: 1.提取SHEEC细胞总DNA,作为模板,利用六对引物进行PCR反应,获取NGAL5’ 侧翼区不同长度片段,-1431-+84、-1137-+84、-945-+84、-657-+84、-416-+84 和-152-+84等。将上述片段首先分别插入pGEM-Teasy,然后再亚克隆到 pGl3-Basic,构建荧光素酶报告基因检测系列质粒pB1431、pB1137、pB945、 pB657、pB416和pB152,确定NGAL启动子的大致分布区段。 2.联合运用嵌套缺失和双荧光素酶报告基因检测等技术,进一步确定NGAL启动子的较确切位置。 3.运用生物信息学方法预测NGAL启动子区功能组件及其反式作用因子,探讨基因表达调控机制。结果: 1.与空载体pGL3-Basic相比,pB1431、pB1137、pB945、pB657、pB416和pB152 等的相对荧光素酶活性均明显增强(P<0.01或<0.05),说明NGAL的启动

关键词： NGAL 启动子反式作用因子嵌套缺失双荧光素酶报告基因检测系统

胃癌组织细胞中NGAL基因表达及其调控机制研究

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胃癌组织细胞中NGAL基因表达及其调控机制研究

作者：袁华敏汕头大学

学位级别：硕士

近年来，许多研究表明，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白编码基因NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）是人类的一个重要的肿瘤相关基因，在结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌和食管癌等肿瘤中高表达，然而，在胃... 详细信息

近年来，许多研究表明，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白编码基因NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）是人类的一个重要的肿瘤相关基因，在结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌和食管癌等肿瘤中高表达，然而，在胃癌中NGAL基因的表达情况如何目前尚不清楚。在本文中，我们首先检测了NGAL基因在胃癌组织细胞中的表达情况，其次还研究了胃癌细胞中NGAL基因的表达调控机制。期望为全面认识NGAL基因的肿瘤生物学功能提供更多资料。研究内容和方法： 1．采取免疫组织化学技术对55例胃癌及其相对应的正常胃腺上皮石蜡包埋组织样品中NGAL基因的表达情况进行检测。 2．联合运用蛋白印迹和RT-PCR技术对两种胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中NGAL基因的表达情况进行检测。 3．将NGAL基因5′侧翼调控区不同长度片段分别插入到质粒pGL3-Basic中，构建NGAL基因5′侧翼调控区系列荧光素酶报告基因表达载体。 4．利用双荧光素酶报告基因检测系统研究确定，在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中，NGAL基因启动子核心元件所在区域。 5．结合突变与缺失技术，研究胃癌细胞中NGAL基因启动子区元件的TPA反应性。 6．通过蛋白印迹技术，结合生物信息学预测分析，确定胃癌细胞中NGAL基因的转录激活因子，初步探讨TPA诱导NGAL基因表达的细胞信号转导通路。研究结果： 1．免疫组织化学检测结果表明，NGAL基因在正常胃腺上皮中不表达或表达很弱，而在胃癌组织中表达很强，阳性信号弥散于整个胞浆。 2．两个胃癌细胞系中NGAL基因表达有较大差别，BGC-823中NGAL基因表达水平明显高于SGC-7901。 3．双荧光素酶报告基因检测结果表明，在两个不同的胃癌细胞系中，NGAL基因启动子核心元件所在区域不一样;在BGC-823细胞中，NGAL基因启动子核心元件位于基因5′侧翼区-110～-79;在SGC-7901细胞中，NGAL基因启动子核心元件位于基因5′侧翼区-152～-141。 4．研究发现，在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中，NGAL基因的启动子均有TPA反应性。 5．在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中，NGAL基因启动子的TPA反应元件位于基因5′侧翼区-85～-79。 6．在生物信息学预测基础上，通过蛋白印迹实验确定，在胃癌细胞系BGC-823中，可能由ERK细胞转导信号途径介导了NGAL基因的TPA反应性，AP1可能是其中的转录激活因子。结论： 1．胃癌组织细胞中，NGAL基因高表达。 2．在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中，NGAL基因的表达存在着较大的差别。 3．在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中，NGAL基因启动子的核心元件不同。 4．在胃癌细胞中，NGAL基因的启动子有TPA反应性，其TPA反应元件位于基因5′侧翼区-85～-79。 5．AP1可能是胃癌细胞中NGAL基因的转录激活因子，介导着TPA反应性。 6．ERK的磷酸化激活可能介导了NGAL基因TPA反应性信号的转导。

关键词： NGAL基因胃癌 TPA反应元件 AP1 ERK磷酸化激活

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肺癌细胞中NGAL基因的基础表达调控机制

肺癌细胞中NGAL基因的基础表达调控机制

作者：常静霞汕头大学

学位级别：硕士

NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的蛋白表达产物是1993年是由Kjeldsen等人在中性粒细胞中首先发现的。有关NGAL基因在各种组织中的表达及其生物学功能一度成为人们研究的热点。近来越来越多的研究表明，NGAL基因... 详细信息

NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的蛋白表达产物是1993年是由Kjeldsen等人在中性粒细胞中首先发现的。有关NGAL基因在各种组织中的表达及其生物学功能一度成为人们研究的热点。近来越来越多的研究表明，NGAL基因在肿瘤组织中不仅呈现高表达，而且还参与癌细胞的侵袭与不良分化。但是关于NGAL基因的表达调控机制目前尚不甚明了。针对于此，我们在肺癌细胞系中深入研究了NGAL基因的基础表达调控机制。这将有助于从分子水平上促进肺癌发生发展机制的研究;同时也会对研究NGAL基因在其它肿瘤细胞中的表达调控机制具有指导意义。研究内容和方法： 1．运用免疫组织化学技术对肺腺癌、鳞癌、肺泡癌等23例肺癌组织切片中NGAL基因的表达情况进行检测分析。 2．利用RT-PCR和免疫荧光的方法，分别在RNA和蛋白水平检测NGAL基因在肺癌细胞系95D和A549细胞中的表达情况。 3．运用PCR缺失、突变及定点突变的方法构建一系列NGAL基因的荧光素酶报告基因表达载体，然后进行瞬时转染，检测在关键调控元件缺失或突变之后的相对荧光素酶活力，确定NGAL基因的核心启动子区。 4．应用生物信息学方法预测与NGAL基因核心启动子区相互作用的潜在的转录因子。 5．运用蛋白印迹技术检测NGAL基因的潜在的转录因子在上述两种肺癌细胞系中的表达情况。 6．设计、合成寡核苷酸探针，利用凝胶滞留技术研究确定NGAL基因启动子区调控元件与肺癌细胞核蛋白的结合情况;利用凝胶超滞留技术研究确定肺癌细胞中与NGAL基因启动子区调控元件具有结合能力的转录因子。研究结果： 1．免疫组化检测结果表明，肺癌组织中NGAL阳性着色的比例为82.61％(19／23)。肺腺癌、鳞癌组织细胞中可见NGAL中等强度的阳性着色分布于整个细胞胞浆。提示在肺癌组织中有NGAL基因的显著表达。 2．RT-PCR和免疫荧光检测发现，在肺癌细胞系95D和A549细胞中存在着NGAL基因的表达。 3．构建了一系列的NGAL基因的报告基因表达载体。检测结果表明，NGAL基因在肺癌细胞系中的核心启动子区为-152～-141，而-106～-79区间是NGAL基因的最小功能启动子区。 4．生物信息学预测显示，与NGAL基因-152～-141区段相结合的转录因子可能是C／EBPs(CCAAT／enhancer binding proteins)家族成员;而与NGAL基因-106～-79区段相结合的可能是MRFs(Myogenic Regulatory Factors)家族成员。 5．进一步的蛋白印迹技术检测发现，在肺癌细胞系中仅有上述两个家族中的C／EBPβ和MyoD、Myf5的表达。 6．凝胶滞留实验发现，在肺癌细胞的核蛋白中确实存在着能够与NGAL基因调控序列相结合的成分。进一步的超滞留实验结果表明，与NGAL基因调控序列结合的转录因子分别是C／EBPβ和MyoD。结论：在肺癌细胞中，调控NGAL基因表达的核心启动子区以及最小功能启动子区分别位于其转录起始位点上游-152～-141和-106～-79区间。C／EBPβ和MyoD可能是调控NGAL基因基础表达的关键转录因子。NGAL基因在肺癌细胞中的表达调控特点与其它肿瘤细胞的明显不同，提示NGAL基因的表达调节存在细胞特异性。

关键词： NGAL基因转录因子 C/EBPβ MyoD 启动子肺癌细胞系

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NGAL相互作用蛋白的筛选与鉴定

NGAL相互作用蛋白的筛选与鉴定

作者：麦瑞琴汕头大学

学位级别：硕士

Lipocalins是一个细胞外蛋白家族,常作为疏水小分子转运的载体,能与细胞表面的受体相互作用。NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)是lipocalins家族成员之一。以往的研究表明,NGAL可能参与多种生命活动过程,包括胚胎发... 详细信息

Lipocalins是一个细胞外蛋白家族,常作为疏水小分子转运的载体,能与细胞表面的受体相互作用。NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)是lipocalins家族成员之一。以往的研究表明,NGAL可能参与多种生命活动过程,包括胚胎发育、细胞分化、炎症免疫反应、细胞凋亡、信号转导、脂质代谢、肿瘤的发生发展等。我们课题组曾研究发现, NGAL在人永生化食管上皮细胞恶变过程中过表达,具有促进癌细胞侵袭功能,同时还可能参与癌细胞的不良分化。目前,NGAL在细胞内的具体生化作用机制还不明了。本文的目的是从人类骨髓预转化cDNA文库中寻找与NGAL相互作用的蛋白,构建蛋白-蛋白相互作用图谱,为揭示NGAL的生化作用机制提供一条新途径。主要研究内容和方法: 一、利用酵母双杂交技术,筛选出与NGAL相互作用的目标蛋白,并给予验证。二、用免疫共沉淀方法,在体外和哺乳动物细胞内验证目标蛋白与NGAL的相互作用。三、用荧光素酶双报告系统进一步验证目标蛋白与NGAL的相互作用。主要研究结果: 一、酵母体内一对一验证66个文库质粒基因表达蛋白与NGAL的相互作用,得到40个阳性克隆,测序,并在NCBI公共数据库进行BLAST分析。最终获得31个基因,11个未知,20个已知。二、构建17对用于免疫共沉淀的质粒,这些外源基因包括大T抗原和p53、NGAL及文库质粒上的基因片段X等,分别插入到pCMV-HA和pCMV-Myc载体。在哺乳动物细胞内成功建立了免疫共沉淀技术平台。三、利用protein-A-agarose纯化免疫兔血清,分离得到NGAL抗体。证明该抗体可以用于免疫检测或免疫共沉淀NGAL。四、免疫共沉淀结果表明,NGAL和Galeetin-1之间可能存在弱相互作用。五、运用哺乳动物细胞双杂交系统研究发现, 在哺乳动物细胞中NGAL可能以某种特殊方式与Galectin-1相互作用。结论:1获得了31个可能与NGAL具有相互作用关系的候选蛋白。2验证候选蛋白之一 galectin-1与NGAL之间的相互作用,提示初步阳性结果,但还需进一步证明。

关键词： NGAL 蛋白-蛋白相互作用酵母双杂交哺乳细胞双杂交免疫共沉淀