NGAL相互作用蛋白的筛选与鉴定

作     者：麦瑞琴 

作者单位：汕头大学 

学位级别：硕士

导师姓名：许丽艳;李恩民

授予年度：2005年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：NGAL 蛋白-蛋白相互作用 酵母双杂交 哺乳细胞双杂交 免疫共沉淀 

摘      要：Lipocalins是一个细胞外蛋白家族,常作为疏水小分子转运的载体,能与细胞表面的受 体相互作用。NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)是lipocalins家族成员之一。 以往的研究表明,NGAL可能参与多种生命活动过程,包括胚胎发育、细胞分化、炎症免 疫反应、细胞凋亡、信号转导、脂质代谢、肿瘤的发生发展等。我们课题组曾研究发现, NGAL在人永生化食管上皮细胞恶变过程中过表达,具有促进癌细胞侵袭功能,同时还可 能参与癌细胞的不良分化。目前,NGAL在细胞内的具体生化作用机制还不明了。本文的 目的是从人类骨髓预转化cDNA文库中寻找与NGAL相互作用的蛋白,构建蛋白-蛋白相 互作用图谱,为揭示NGAL的生化作用机制提供一条新途径。 主要研究内容和方法: 一、利用酵母双杂交技术,筛选出与NGAL相互作用的目标蛋白,并给予验证。 二、用免疫共沉淀方法,在体外和哺乳动物细胞内验证目标蛋白与NGAL的相互作用。 三、用荧光素酶双报告系统进一步验证目标蛋白与NGAL的相互作用。 主要研究结果: 一、酵母体内一对一验证66个文库质粒基因表达蛋白与NGAL的相互作用,得到40个阳 性克隆,测序,并在NCBI公共数据库进行BLAST分析。最终获得31个基因,11个 未知,20个已知。 二、构建17对用于免疫共沉淀的质粒,这些外源基因包括大T抗原和p53、NGAL及文库 质粒上的基因片段X等,分别插入到pCMV-HA和pCMV-Myc载体。在哺乳动物细 胞内成功建立了免疫共沉淀技术平台。 三、利用protein-A-agarose纯化免疫兔血清,分离得到NGAL抗体。证明该抗体可以用于 免疫检测或免疫共沉淀NGAL。 四、免疫共沉淀结果表明,NGAL和Galeetin-1之间可能存在弱相互作用。 五、运用哺乳动物细胞双杂交系统研究发现, 在哺乳动物细胞中NGAL可能以某种特殊 方式与Galectin-1相互作用。 结论:1获得了31个可能与NGAL具有相互作用关系的候选蛋白。2验证候选蛋白之一 galectin-1与NGAL之间的相互作用,提示初步阳性结果,但还需进一步证明。