检索结果-南通市图书馆

作者：王铮东北农业大学

学位级别：硕士

禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是一种高度传染性呼吸道疾病,在世界范围内广泛分布,严重危害养禽业的发展。传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）最早于20世纪30年代在美国被报道。IBV容易发生变异和... 详细信息

禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是一种高度传染性呼吸道疾病,在世界范围内广泛分布,严重危害养禽业的发展。传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）最早于20世纪30年代在美国被报道。IBV容易发生变异和重组,从而产生多种血清型。一般来说,现有的商业IBV疫苗在不同血清型IBV感染之间提供的交叉保护较弱,一旦IB爆发将会导致巨大的经济损失。研究表明,鸡巨噬细胞在宿主抵抗IBV感染的先天和获得性免疫反应中发挥重要作用,IBV感染还可以导致Vero、H1299细胞周期和生物学功能发生改变。在本实验中采用巨噬细胞HD11细胞作为感染细胞,对其感染IBV后相应的细胞周期变化及其对病毒复制的影响进行了研究,以期为IBV感染发病机制及其疫苗的研发提供新思路。研究结果表明,IBV感染HD11细胞后,采用流式细胞术方法检测到感染细胞在细胞周期G2/M期的积聚。实时荧光定量PCR方法检测各种细胞周期调节蛋白基因m RNA表达变化,细胞周期蛋白变化的整体趋势与细胞周期趋势相同,尤其细胞周期蛋白B1（CCNB1）的表达量在感染后18 h开始出现显著增加。同时细胞周期变化也对病毒复制产生影响,与对照组细胞相比,感染IBV的G2/M期同步细胞时病毒滴度明显增加。综上结果表明,IBV诱导感染细胞发生G2/M期阻滞,并为病毒复制提供有利的条件。同时,IBV还增强了巨噬细胞中参与多种宿主生物过程的大部分相关蛋白的基因表达。其中实时荧光定量PCR方法检测MDA5、TLR3、IFN-α、IFN-β、IL1-β在IBV感染细胞中的表达显著增高。将细胞周期同步化与免疫因子结合起来研究时发现,免疫因子在S期同步化时基因转录水平表达量整体明显增高,而在G2/M期同步化时基因转录水平明显降低,与病毒复制呈现负相关。综上所述,IBV感染HD11细胞后细胞周期阻滞在G2/M期,并且同步化在G2/M期时有利于病毒复制,同时降低免疫因子的整体表达量。本研究对于进一步探索IBV感染后细胞周期、免疫因子及其与病毒复制之间关系提供了新的理论依据和实验基础。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 HD11细胞细胞周期病毒复制

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鹅星状病毒的分离鉴定及其对雏鹅致病性研究

鹅星状病毒的分离鉴定及其对雏鹅致病性研究

作者：邹蒙蒙东北农业大学

学位级别：硕士

禽类痛风(Gout)是由星状病毒(Astrovirus,Ast V)引起的一种以肾脏、肝脏等实质器官尿酸盐沉积和关节肿大为临床症状的疾病。Ast V是一种无囊膜、单股正链RNA病毒,因其感染宿主的多样性,不同物种感染后其主要临床症状不尽相同。到目前为... 详细信息

禽类痛风(Gout)是由星状病毒(Astrovirus,Ast V)引起的一种以肾脏、肝脏等实质器官尿酸盐沉积和关节肿大为临床症状的疾病。Ast V是一种无囊膜、单股正链RNA病毒,因其感染宿主的多样性,不同物种感染后其主要临床症状不尽相同。到目前为止,全世界已经有许多Ast V毒株先后从不同动物中分离出来,Ast V对全球人类以及动物养殖行业均可造成极大危害。其中鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAst V)是近些年危害国内养鹅业发展的病原,但目前国内对该病原缺乏系统的研究,而且没有有效的药物和疫苗能够对其进行防治,因此对GAst V野毒株进行分离鉴定并对其全基因组测序分析可以为其流行病学的遗传进化分析和研制预防疫苗提供一定的理论依据。在本研究中,我们从黑龙江省哈尔滨市某鹅养殖场获得疑似感染GAst V死亡雏鹅病料,对其进行处理后,在LMH细胞上以及10日龄鹅胚上进行分离培养,该毒株并不能使LMH细胞出现细胞病变,经PCR鉴定后有病毒存在。鹅胚接种病毒后,初期传代不稳定,传至5代发生胚死亡并出现明显病变,主要表现为尿囊膜增厚且泛白、胚体小且通体发红,肝脏颜色淡、发黄并且呈斑驳花纹状、股部肌肉出血。经RT-PCR鉴定表明成功分离出一株GAst V,并将其命名为GAst V HLJ株。根据NCBI Gen Bank已经上传的GAst V毒株全基因组信息,设计6对交叉重叠的特异性引物对GAst V HLJ分离株内部基因组进行扩增;同时按照5’RACE以及3’RACE试剂盒说明书扩增进而得到5’UTR和3’UTR末端序列。将获得的产物纯化回收连接到p MD18-T载体上,鉴定成功后进行测序并拼接病毒全基因组序列。GAst V HLJ株基因组全长7252 bp,基因组的结构与典型GAst V基因组结构相同,包括5’UTR-ORF1a-ORF1b-ORF2-3’UTR-poly(A)尾。基因组的两端为非编码区,内部基因包括3个开放阅读框分别为ORF1a、ORF1b、ORF2。1-245位的5’端非编码区和7028-7252位的3’端非编码区。基因组内部编码3个不同基因,246-3350位的ORF1a由3105个核苷酸组成,主要编码非结构蛋白;3341-4891位的ORF1b由1551个核苷酸组成编码Rd Rp;4910-7024位的ORF2由2119个核苷酸组成负责编码核衣壳蛋白。GAst V HLJ株ORF1a与ORF1b之间有碱基重复序列即AAAAAACTAG,ORF1b与ORF2之间有一段18 bp的不连续序列。病毒主要抗原蛋白ORF2的分子抗原性分析表明,GAst V HLJ株ORF2蛋白突变集中在3’端,其中227位、325位以及376位是其特有的突变,229位的Q突变为P、325位的A突变为T、376位的T突变为A。这可能是病毒适应新的地区及环境与气候而导致ORF2的突变。DNAStar软件分析其亲疏水性及抗原性,并利用在线软件预测发现28个抗原表位,且其抗原表位多密集分布于3’端。为了更加深入了解GAst V HLJ株的致病性,利用10日龄鹅胚繁殖的病毒对1日龄雏鹅进行颈部皮下注射感染,随后观察感染雏鹅的临床症状和病理变化。感染雏鹅在整个实验过程中临床症状表现为精神萎靡,体型瘦小,但无死亡现象。剖检时肉眼可见不同器官在不同感染日龄呈现其特有的病理变化。感染3 d后感染组胰腺较对照组发红、肿大且有疑似白色尿酸盐沉着现象;感染7 d后肝脏表面有白色物质附着;感染13 d后雏鹅脾脏呈斑驳状花纹;法氏囊在感染10 d剖检发现感染组较对照组出现表面不光滑、有白色物质附着现象。病理组织学检查表明感染后第10-13 d肾脏大部分区域肾小管上皮细胞变性坏死;肝脏可见肝细胞坏变性坏死严重并形成大的坏死灶,其内存在嗜酸性的红色颗粒,中央静脉及汇管区有大量炎性细胞浸润。实时荧光定量PCR方法对病毒在各组织脏器中的病毒进行绝对定量检测,表明在感染后的21 d内,各个器官都可以检测到病毒的存在,而且感染后期的病毒载量明显高于感染初期,其中病毒载量高峰主要集中于感染后10-13 d。肾脏的病毒载量最高,说明肾脏为星状病毒感染的主要靶器官;而肝脏病毒载量稍显减少,这可能与其发生明显的变质性变化有关。综上表明GAst V感染1日龄雏鹅动物模型建立成功,为以后对该病的防控以及疫苗的研究提供一定的理论及物质基础。

关键词：鹅星状病毒分离鉴定基因组生物信息学分析致病性

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2抗体制备与重组分析

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2抗体制备与重组分析

作者：李沛然东北农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的急性传染病。该病毒分为欧洲型和美洲型两种基因型。2006年,我国爆发高致病性PRRS,给养猪产业带来极大的冲击。NSP2是PRRSV中分子量最大、变异最大的蛋白,常作为PRRSV监控的靶点,同时其在PRRSV的复制、免疫、引发宿主细胞自噬和凋亡中发挥着重要功能。本研究分离鉴定了1株2012年黑龙江省的美洲型HP-PRRSV,并命名为HH12株。应用RT-PCR技术成功克隆HH12株和实验室已鉴定的2株HP-PRRSV（Jilin TN1株和Jilin TN2株）的NSP2全长基因,测序结果3个分离株NSP2全长均为2850 bp。将所克隆序列与美洲经典型PRRSV NSP2比对,发现3个分离株的NSP2基因均存在HP-PRRSV特征性的30个氨基酸缺失。遗传进化分析表明,3个分离株与HP-PRRSV代表株JXA1 NSP2基因序列相似性为98.5%8.7%,且在遗传进化树中属于JXA1株为代表的亚群,并与HB0701株处于同一分支。以Jilin TN1株为研究对象,设计并合成能够扩增删除了部分疏水区的NSP2片段的特异性引物,应用RT-PCR对其进行亚克隆,构建p GEX 6p-NSP2重组质粒,转化至*** Rostta感受态细胞中通过原核表达重组NSP2蛋白,SDS-PAGE分析其大小约131.5 ku,经Western-blot鉴定纯化复性后的重组蛋白能够与PRRSV阳性血清反应。以该蛋白为免疫原,免疫新西兰兔制备抗血清,4免后检测其效价达1:215,且与HP-PRRSV及经典型PRRSV反应效价可达1:211。western-blot结果表明所获抗血清特异性较高。IFA结果显示该多抗能够检测到Marc-145细胞上繁殖的HP-PRRSV和经典型PRRSV,且能够与p VAX-NSP2转染BHK-21细胞瞬时表达的NSP2蛋白反应。Real-time PCR结果显示该抗体对HP-PRRSV和经典型PRRSV具有较好的抑制效果,对两者的最高抑制率分别为76.0%和58.6%。以上结果说明所制备的多抗生物学活性良好,为NSP2的深入研究提供很重要的基础。以Gen Bank数据库中包括本研究克隆的624条美洲型PRRSV NSP2序列为研究对象,应用RDP4.2软件对NSP2重组事件进行检测,同时应用SIMPLOT软件和MEGA5.2软件从遗传相似性和遗传进化两个角度对重组事件进行验证和分析。检测结果发现11个重组事件,共包含37个重组毒株,占总分析毒株的5.9%（37/624）,而本研究3个分离株的NSP2基因未发现重组。美洲变异型、传统型和经典型毒株均发现了重组:其中传统型有3株,经典型有7株,变异型有27株。这些重组事件中不仅存在7个型内重组,还发现了4个型间重组,检测到的型间重组毒株主要由美洲变异型与传统型或经典型通过重组产生。遗传进化分析表明,发生型间重组的毒株具有独特的进化地位。以上结果提示,在美洲型PRRSV的进化过程中NSP2基因片段有重组发生,变异型毒株的出现加快了PRRSV的进化速度并且使其变异情况更加复杂。同时,基因重组可能是PRRSV发生型间转换、甚至产生新基因型的进化基础,这可能会造成新型PRRSV的爆发,这一结果提示需针对PRRSV的变异提出新的防控措施。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP2 原核表达多抗血清重组分析

产气荚膜梭菌NetB毒素阻断ELISA方法的建立与应用

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产气荚膜梭菌NetB毒素阻断ELISA方法的建立与应用

作者：聂思静东北农业大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌(CP)是一种重要的人兽共患病病原体,广泛分布于自然界,可导致多种动物发生坏死性肠炎、肠毒血症以及人类的气性坏疽和食物中毒。迄今为止,已研究发现该菌能产生15种外毒素。NetB毒素是首次在坏死性肠炎(NE)病鸡体内分离的A... 详细信息

产气荚膜梭菌(CP)是一种重要的人兽共患病病原体,广泛分布于自然界,可导致多种动物发生坏死性肠炎、肠毒血症以及人类的气性坏疽和食物中毒。迄今为止,已研究发现该菌能产生15种外毒素。NetB毒素是首次在坏死性肠炎(NE)病鸡体内分离的A型CP中发现的,NetB毒素在禽类NE的发病机制中是一种关键的致病因子。因此,研究该毒素蛋白的生物学功能及检测方法对CP的诊断和防治有重要的意义。本文将CP NetB毒素蛋白表达产物经切胶纯化和复性后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blot方法对所制备的抗体进行检测。结果显示多抗血清效价达到1:32768,且重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的反应原性。将实验室保存的4株抗NetB毒素杂交瘤细胞株复苏并进行生物学活性分析,选择反应性好的单克隆抗体(McAb)F9G3株腹腔接种BALB/c小鼠成功进行了腹水的制备。以纯化的CP重组NetB蛋白、兔抗CP NetB蛋白多抗和F9G3 McAb经三因素优化建立了检测CP抗体的阻断ELISA方法。优化后结果显示抗原最佳包被浓度为0.5μg/100μL,包被时间为4℃过夜;最佳封闭液为1%BSA,时间为37℃作用2 h;待检血清的作用时间为1.5 h;单克隆抗体的最佳工作浓度为0.0625μg/100μL,时间为37℃作用1 h;酶标抗体最佳稀释度为1:5 000,时间为37℃孵育1 h;最佳显色液作用时间为10 min。通过对90份CP阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥31.88%时为阳性,PI≤22.08%时为阴性,22.08%

关键词：产气荚膜梭菌 NetB毒素多克隆抗体阻断ELISA 应用

J亚群禽白血病病毒分离鉴定及间接ELISA方法建立和初步应用

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J亚群禽白血病病毒分离鉴定及间接ELISA方法建立和初步应用

作者：杨婷东北农业大学

学位级别：硕士

禽白血病(Avian leukosis, AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian sarcoma virus, RSV)所引起的禽类肿瘤性疾病的统称。病毒所致肿瘤类型较多，大多为传染性的良性及恶性肿瘤。其中，J亚群禽白血病（Sub... 详细信息

禽白血病(Avian leukosis, AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian sarcoma virus, RSV)所引起的禽类肿瘤性疾病的统称。病毒所致肿瘤类型较多，大多为传染性的良性及恶性肿瘤。其中，J亚群禽白血病（Subgroup J avian leukosis）是由反转录病毒科的J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus of subgroup J, ALV-J)所引起的一种以侵害肉鸡为主的肿瘤性疾病。本实验对临床疑似感染鸡进行临床检查，剖检发现肝脏肿大表面有白色结节，被膜下有血块，肾脏肿大明显，表面有肿瘤结节。病理组织学检查肝脏有弥漫性髓细胞样瘤细胞浸润，肾脏分布局灶性髓细胞样瘤细胞。间接免疫荧光鉴定病毒感染DF-1细胞出现阳性特异性荧光，ALV-J gp85基因PCR鉴定正确，表明成功分离鉴定1株ALV-J。根据NCBI发表的禽白血病基因序列，针对gp85基因设计引物，从疑似感染鸡病料中提取前病毒DNA，PCR扩增出924bp的目的条带，利用原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒pET-gp85，经酶切和测序鉴定正确后转化入E. coli Rosetta感受态细胞中进行IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析，表达的蛋白以包涵体形式存在，重组蛋白大小为40kDa。经Western blot检测分析，结果表明该pET-gp85蛋白具有良好的反应原性。将pET-gp85蛋白经镍柱纯化复性后作为包被抗原，建立检测ALV-J-gp85抗体的间接ELISA方法，并对间接ELISA方法工作条件进行优化。结果表明，封闭液浓度为1%BSA;抗原包被量为1μg/mL;血清稀释度为1:400;血清作用时间为1h;二抗稀释度为1:4000;二抗作用时间为1h;底物显色时间为10min。经重复性试验、特异性试验和临界值确定结果显示，建立的检测方法有良好的重复性，与马立克病毒、传染性支气管炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等阳性抗体均无交叉反应，表明该方法具有良好的重复性、特异性、敏感性，通过对临床大量样品的检测，得到较为科学的阳性率，可以为临床检测ALV-J提供依据。

关键词： J亚群禽白血病 gp85基因分离鉴定原核表达间接ELISA

堆型艾美耳球虫免疫增强型核酸疫苗免疫保护机制病理学研究

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堆型艾美耳球虫免疫增强型核酸疫苗免疫保护机制病理学研究

作者：蔡皓璠东北农业大学

学位级别：硕士

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害极其严重的寄生虫病。以往控制和治疗鸡球虫病的方法是利用化学药物,但药物耐药性的产生往往造成药效降低,鸡球虫病仍然时常发生,严重影响鸡的生长及其生产性能发挥。近年来使用疫苗... 详细信息

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害极其严重的寄生虫病。以往控制和治疗鸡球虫病的方法是利用化学药物,但药物耐药性的产生往往造成药效降低,鸡球虫病仍然时常发生,严重影响鸡的生长及其生产性能发挥。近年来使用疫苗已成为养鸡业对球虫病的主要防控手段,而利用基因工程技术开发球虫疫苗更是成为热点。本实验利用常规病理学及超微病理学技术对鸡E. acervulina免疫增强型核酸疫苗对雏鸡的免疫反应及其保护作用进行研究,具体实验内容与结果如下:1.利用常规病理组织学方法,对E. acervulina感染后虫体的发育及小肠的病理变化规律进行观察。实验结果表明,感染E. acervulina雏鸡,精神沉郁,食欲饮欲下降,排白色黏液样便,小肠充血,肠壁变薄,苍白色,绒毛上皮细胞变性、坏死脱落。不同时期,细胞内含有发育不同阶段的多量虫体。2.利用免疫组化方法,对E. acervulina侵入肠道的途径及部位进行研究。实验结果表明,E. acervulina从小肠绒毛上皮细胞侵入,然后经绒毛内毛细血管进入肠腺,并在肠腺基底部开始继续发育,之后向肠腺开口处移行,而后移行至肠绒毛上皮细胞内,并从绒毛基底部开始,逐渐发展至绒毛上部,最后侵入整个绒毛。3.利用常规病理学和超微病理学方法,对构建的不同免疫增强型核酸疫苗的免疫保护作用病理学机制进行了研究。将纯化的四种真核表达质粒以及空载体质粒分别于14日龄经腿部肌肉注射免疫SPF雏鸡,并将实验鸡共分为7组,21日龄各组鸡加强免疫一次,28日龄各组感染5×10～4个E. acervulina孢子化卵囊,对四种真核表达质粒免疫雏鸡后不同日龄及感染球虫后鸡的病理学变化进行了观察。实验结果表明,红对照组脾脏、胸腺淋巴细胞排列疏松,淋巴细胞数量减少;小肠损伤严重,肠绒毛断裂,绒毛上皮细胞变性、坏死脱落,出血严重,绒毛上皮细胞内感染大量虫体。3-1E-ChIL-15组(S组)、3-1E+cChIL-15组(C组)、3-1E+NChIL-15组(N组)、3-1E组(E组)四组脾脏、胸腺淋巴细胞密集程度明显增高,十二指肠及空肠的病理变化轻微,肠绒毛轻度损伤,虫体感染量减少。四组均有明显的免疫保护效果。

关键词：鸡堆型艾美耳球虫病理学变化核酸疫苗免疫保护

鸡堆型艾美尔球虫乳酸脱氢酶增强型核酸疫苗构建和免疫保护研究

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鸡堆型艾美尔球虫乳酸脱氢酶增强型核酸疫苗构建和免疫保护研究

作者：丛培君东北农业大学

学位级别：硕士

本试验根据GeneBank上发表的堆型艾美尔球虫(Eimeria acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)基因序列设计引物,成功克隆上海株堆型艾美尔球虫的部分LDH基因,大小为993bp。构建LDH的原核表达质粒,表达为42kDa的LDH重组蛋白,切胶纯化后免疫新西兰白... 详细信息

本试验根据GeneBank上发表的堆型艾美尔球虫(Eimeria acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)基因序列设计引物,成功克隆上海株堆型艾美尔球虫的部分LDH基因,大小为993bp。构建LDH的原核表达质粒,表达为42kDa的LDH重组蛋白,切胶纯化后免疫新西兰白兔,制备兔抗LDH多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光试验证明制备的多克隆抗体具有良好的反应性。利用一段编码(G4S)3多肽的碱基linker序列将LDH与ChIL-18基因进行连接,成功构建了一个融合基因真核表达载体质粒,即PVAX-IL-18-linker-LDH质粒。融合基因质粒的体外瞬时转染试验表明表达的融合蛋白可以被LDH多克隆抗体和ChIL-18多克隆抗体检测出来,证明融合基因表达的蛋白保留了所融合两段基因各自的生物学活性,为后续动物免疫试验提供了理论基础。动物免疫保护试验分5个处理组,即B组(不免疫不攻虫组)、H组(不免疫攻虫组)P组(PVAX免疫组)、L组(PVAX-LDH免疫组)、LK组(PVAX-IL-18-linker-LDH疫苗免疫组)。各组雏鸡在21和28日龄进行相应的处理,35日龄时以5×104孢子化卵囊进行攻虫处理。实验过程中在雏鸡21、28、35、42、49日龄时采取相应病料进行检测。结果表明,从28日龄开始两个免疫组雏鸡T淋巴细胞增殖功能就高于对照组,在42日龄免疫组极显著高于对照组,其中以免疫增强型DNA疫苗组稍好。B淋巴细胞增殖功能和LDH蛋白刺激淋巴细胞增殖功能检测结果与T淋巴细胞结果类似。免疫及攻虫后对各实验组免疫雏鸡的相对增重率、粪便卵囊排出数量、十二指肠病变记分及不同免疫组的免疫保护效率进行了比较。结果显示,各疫苗免疫组平均增重与对照组差异不显著,说明DNA疫苗免疫对增重无不良影响;疫苗攻虫组平均增重显著高于H组和P组,说明两组DNA疫苗对鸡抗球虫感染有很好的保护作用：L组和LK组卵囊排出量分别减少54.11%和60.44%,当有IL-18因子参加联合免疫时,效果更加明显。在抗球虫综合指数方面,疫苗组优于H组和P组,L组的ACI为176,LK组的ACI最高达到了179,表明有细胞因子协同后融合基因的免疫保护效果更明显。综上所述,ChIL-18基因可以提高LDH基因真核表达质粒刺激机体产生细胞免疫应答,进而提高机体抵抗球虫攻击的能力。本试验为进一步研究LDH的生物学活性提供了试验依据,同时为探讨开发研制新型免疫增强型抗球虫核酸疫苗提供了理论基础。

关键词：鸡球虫 LDH基因鸡白细胞介素18 免疫保护

胆固醇对鸡传染性支气管炎病毒感染鸡胚肾细胞的影响

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胆固醇对鸡传染性支气管炎病毒感染鸡胚肾细胞的影响

作者：赵蕾东北农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病,被认为是危害全球养禽业的主要病毒性传染病之一。鸡胚肾(Chicken embryo kidney,CEK)细胞源... 详细信息

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病,被认为是危害全球养禽业的主要病毒性传染病之一。鸡胚肾(Chicken embryo kidney,CEK)细胞源于IBV易感宿主,相较于其他细胞系更贴近于IBV的感染环境,且对IBV具有极高的敏感性,接种后能观察到明显的细胞病变,CEK已成为研究IBV感染细胞致病过程及其机制的适宜宿主细胞模型。脂筏是质膜中富含胆固醇和鞘脂的微结构域,具有介导病毒感染、信号转导、蛋白分选等生物学功能。胆固醇作为脂筏的重要组分,可维持脂筏的稳定结构并参与脂筏功能的发挥。研究表明,胆固醇在某些病毒感染细胞时扮演着非常重要的作用,包括病毒的进入、吸附和释放过程,但胆固醇在IBV感染过程中的作用还并未有报道。本实验分别研究了细胞膜和病毒囊膜胆固醇在IBV M41株感染CEK细胞过程中的作用。首先检测了胆固醇萃取剂甲基-β-环糊精(MβCD)对CEK细胞活性的影响,结果发现,当MβCD浓度小于10 m M时,不会对CEK细胞活性造成明显影响,所以本实验中所用的MβCD最大浓度为10 m M。同时进行胆固醇含量测定,当MβCD浓度为10 m M时,细胞膜胆固醇含量下降至37%,补充外源胆固醇后,胆固醇浓度会得到相应恢复,当充补胆固醇浓度为200μM时,胆固醇含量恢复至接近MβCD处理前。MβCD还能有效去除IBV囊膜胆固醇,用10m M MβCD处理病毒后,病毒囊膜胆固醇含量下降至约66%。本实验利用Real Time PCR、病毒滴度试验和Western Blot方法检测了细胞膜胆固醇在IBV M41株感染CEK细胞不同过程中的作用。结果表明,加入不同浓度MβCD去除细胞膜胆固醇,会以剂量依赖性的方式抑制IBV的进入,病毒感染力和IBV N蛋白的表达量也会梯度下降。为进一步确定该抑制作用是由于去除胆固醇引起的,用10 mM MβCD去除细胞膜胆固醇后再补充外源胆固醇,结果显示,随着补充胆固醇浓度的增加,IBV感染力和蛋白表达水平均得到相应恢复,说明去除胆固醇可抑制IBV进入CEK细胞,且该抑制作用是可逆的。本实验还研究了胆固醇在IBV吸附到CEK细胞和从CEK细胞释放过程中的作用,结果显示,随着MβCD浓度增大,IBV的吸附和释放过程均受到剂量依赖性的抑制。同时,将CEK细胞转染GPI-pEGFP后感染IBV,结果显示IBV与GPI锚定蛋白可共定位在同一个CEK细胞膜上,说明IBV可定位到细胞膜脂筏。病毒囊膜胆固醇在很多病毒进入细胞的过程中也扮演重要的作用。本实验将不同浓度MβCD处理后的IBV M41株感染CEK细胞,结果发现IBV感染力无明显趋势性变化,IBV N蛋白表达量也无显著性变化,证明病毒囊膜胆固醇并不是IBV进入CEK细胞所必须的。综上所述,IBV感染CEK细胞过程中需要细胞膜胆固醇参与,而不需要病毒囊膜胆固醇。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒鸡胚肾细胞脂筏胆固醇甲基-β-环糊精

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鸡痘免疫增强型核酸疫苗构建及免疫评价

鸡痘免疫增强型核酸疫苗构建及免疫评价

作者：洪琴东北农业大学

学位级别：硕士

本实验将疑似“混合型”鸡痘的病料进行病理学检查,发现皮肤、气管和喉头病料的细胞胞浆内嗜酸性染色的A型包涵体。病原分离鉴定表明,病毒能在10日龄鸡胚绒毛尿囊膜上形成典型的痘斑,并在CEF上形成鸡痘病毒典型病变。据GenBank发表的FP... 详细信息

本实验将疑似“混合型”鸡痘的病料进行病理学检查,发现皮肤、气管和喉头病料的细胞胞浆内嗜酸性染色的A型包涵体。病原分离鉴定表明,病毒能在10日龄鸡胚绒毛尿囊膜上形成典型的痘斑,并在CEF上形成鸡痘病毒典型病变。据GenBank发表的FPV美国标准强毒株基因序列,利用Oligo 6.0和Primer 5.0软件设计1对扩增4b core蛋白基因引物,通过PCR扩增测序及动物回归试验证明所分离的病毒是鸡痘病毒(FPV),命名为HH2008。本实验根据Afonso等人已发表的FPV核苷酸全序列(AF198100),针对FPV140上下游设计了1对引物,PCR扩增出FPV140完整的开放阅读框,进行亚克隆构建原核表达质粒pET30a-ENV,表达蛋白大小约为42 ku。制备兔抗ENV多克隆抗体,抗体效价可达到2,Westernblot检测发现多抗血清特异性好,可通过ELISA鉴定鸡痘病毒。本试验将FPV ORF140基因亚克隆至pVAX1真核表达载体中,构建了重组真核表达质粒pVAX-ENV。利用一段编码(GS)多肽的碱基Linker将ChIFN-γ分别与FPV ENV基因进行连接,成功构建pVAX-ENV-IFN融合基因真核表达质粒。通过脂质体转染法将pVAX-ENV和pVAX-ENV-IFN转入BHK21细胞中并检测到目的蛋白表达。重组真核表达质粒免疫雏鸡进行体内表达检测,ENV基因和ENV-IFN融合基因能够在体内进行表达,同时表达后的融合蛋白可以被ChIFN-γ多克隆抗体和FPV ENV多克隆抗体检测出来,进一步证明了融合基因表达的蛋白保留了融合前两段基因各自的生物学活性,为后续动物试验提供了理论基础。动物免疫试验分为5个组,即E组(FPV ENV基因真核表达质粒免疫组)、E-I组(pVAX-ENV-IFN真核表达质粒免疫组)、V组(鸡痘商品化疫苗免疫组)、P组(pVAX1空质粒免疫组)和PBS对照组(B组)。利用淋巴细胞转化试验、酶联免疫吸附试验和流式细胞术对不同处理组雏鸡的各项免疫指标进行了检测,最后应用病毒攻击试验比较不同质粒免疫组间保护率的差异。结果表明,免疫组各日龄雏鸡免疫指标均比pVAX1空载体组和PBS组高,以ENV-IFN融合基因的结果尤为显著。其中T、B淋巴细胞增殖功能、CD4、CD8、T细胞数量和外周血液中抗FPV ENV特异性抗体与pVAX1空载体组和PBS组相比较都有明显的提高,且以融合基因组和疫苗组最为显著。综上所述,ChIFN-γ基因在配合FPV抗原基因免疫过程中,机体免疫应答能力增强,提高了机体抵抗病毒的攻击能力。本试验构建ChIFN-γ与病毒抗原基因融合基因质粒鸡免疫保护试验为进一步研究ChIFN-γ生物学活性提供了试验依据,同时为探讨研制新型免疫增强型抗病毒疫苗提供了理论基础。

关键词：鸡痘病毒 FPV ENV基因 ChIFN-γ 免疫佐剂

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感染鹅细小病毒雏鹅病理学研究

感染鹅细小病毒雏鹅病理学研究

作者：裴颖东北农业大学

学位级别：硕士

小鹅瘟是雏鹅的一种急性、高度接触性传染病,是危害养鹅业主要疫病之一,随着科学技术和养鹅业的不断发展,各国对小鹅瘟的研究也越来越重视。本项研究应用病理组织学及超微病理学研究手段,从细胞、亚细胞水平对GPV感染14日龄雏鹅各组织... 详细信息

小鹅瘟是雏鹅的一种急性、高度接触性传染病,是危害养鹅业主要疫病之一,随着科学技术和养鹅业的不断发展,各国对小鹅瘟的研究也越来越重视。本项研究应用病理组织学及超微病理学研究手段,从细胞、亚细胞水平对GPV感染14日龄雏鹅各组织器官组织病理学变化进行研究,阐明雏鹅人工感染GPV后器官组织的组织病理学、超微病理学变化,揭示GPV感染雏鹅的病理学变化规律。本研究结果表明,主要病理变化出现时间为1～14d,其中以5～7d病变表现最为严重,耐过雏鹅在感染后21d时损伤组织基本恢复。雏鹅感染GPV后组织器官呈现广泛的病理损伤,其中病变较为严重的为肠道,其次为免疫系统、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脑组织。病理组织学变化主要为:小肠黏膜上皮细胞变性坏死严重、脱落,黏膜固有层有大量炎性细胞浸润,肠腺结构紊乱,呈现肠道的急性卡他性炎症;法氏囊和胸腺主要表现为出血性变质性炎;脾脏为急性脾炎;心肌呈现实质性心肌炎变化;肺脏表现间质性肺炎变化;肾脏呈渗出性肾炎变化;脑组织表现为非化脓性脑炎。肝脏、胰腺、腺胃等其他实质器官主要表现为变质性炎。感染雏鹅十二指肠、空肠、回肠、肝脏、胸腺、脾脏、法氏囊,均发生不同程度的超微病理学改变:实质细胞细胞核肿胀,染色质聚集或溶解;线粒体肿胀,嵴发生断裂、溶解、甚至消失形成空泡。在细胞核中可见髓样小体,粗面内质网扩张,严重者整个细胞发生溶解。结合小肠扫描电镜和光镜观察结果看,认为雏鹅感染GPV后的主要靶器官是小肠绒毛上皮细胞,病毒粒子首先在肠道黏膜层大量复制并维持长时间存在,引起小肠发生广泛的急性卡他性炎,之后病毒通过肠壁血管进入血液循环,经血液循环在各组织器官复制,侵害全身各组织器官,从而引起全身各组织器官的广泛性损伤。

关键词：雏鹅鹅细小病毒病理学超微病理学