检索结果-南通市图书馆

作者：姚金萍第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景糖尿病已经成为全球的公共健康问题，在中国，有9200多万人患有糖尿病，其中2型糖尿病占90%以上。目前已知的2型糖尿病的发病机制一方面是β细胞难以补偿胰岛素抵抗效应，另外一方面是β细胞数量减少，β细胞数量减少和功能受... 详细信息

研究背景糖尿病已经成为全球的公共健康问题，在中国，有9200多万人患有糖尿病，其中2型糖尿病占90%以上。目前已知的2型糖尿病的发病机制一方面是β细胞难以补偿胰岛素抵抗效应，另外一方面是β细胞数量减少，β细胞数量减少和功能受损导致血糖难以控制及糖尿病并发症的发生。寻找一种能够减弱β细胞功能衰竭和/或提高分泌胰岛素细胞的数量的方法很有必要。恢复胰岛功能是医学界所期待和研究的方向。干细胞具有中、外胚层多向组织分化的能力，对于临床应用来说，骨髓干细胞很容易获取，因为它含有很多干细胞类型，尤其是间充质干细胞，它对改善β细胞生存和再生很有帮助。目前有大量的基础实验表明骨髓间充质干细胞对糖尿病有很好治疗效果。目前利用自体骨髓干细胞对2型糖尿病的治疗进入了临床应用前的研究阶段，采用自体骨髓干细胞移植的方法，将自体骨髓来源干细胞经血管介导注入体内以分化成新的胰岛样细胞，有望控制病情变化甚至治愈糖尿病。基于以上认识，我们开展了本项目研究，我们对自体骨髓间充质干细胞进行体外培养、扩增及鉴定，观察细胞的生长情况及形态;把分离的骨髓间充质干细胞不经任何诱导处理经血管介入定向移植到胰腺，观察移植后患者的血糖控制情况、胰岛功能及糖化血红蛋白的变化，以及观察是否存在不良反应。从临床角度上研究骨髓间充质干细胞对T2DM胰岛功能修复的能力，改善血糖控制的效果以及可能的不良反应。第一部分：成人骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性鉴定目的：建立成人骨髓间充质干细胞体外分离、培养、扩增及鉴定的方法，并分析其生物特性，为进一步深入研究提供理论依据。方法：采取拟行骨髓间充质干细胞移植的2型糖尿病患者的骨髓200ml,经人类骨髓干细胞体外分离纯化试剂盒分离提取骨髓中的单个核细胞，在含10%FBS的DMEM-LG培养基中培养，结合间充质干细胞具有贴壁生长的特点，经过不断更换细胞培养液从而不断纯化分离BM-MSCs,并行体外扩增与培养。在倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞的一般形态结构及生长情况。描绘细胞生长曲线了解其生长特性。流式细胞仪检测CD34、CD44、CD45以及CD90的表面分子标记的表达情况。台盼蓝染色鉴定其活性。结果：骨髓间充质干细胞的原代细胞及传代细胞均呈梭形外观，细胞间成平行、漩涡状排列。原代细胞接种1-2天内观察出现贴壁细胞，5-9天细胞增殖速度增快，第10-12天时细胞融合成单层;传代细胞在3-6天增殖速度最快，第7-10天达到平台期。细胞表面标志物CD44、CD90表达阳性，CD34、CD45表达阴性。台盼蓝染色活性鉴定大于95%。第二部分：自体骨髓间充质干细胞对2型糖尿病的安全性及疗效评价目的：研究自体骨髓间充质干细胞治疗2型糖尿病的临床应用价值，评价对2型糖尿病的治疗效果，初步探讨自体骨髓间充质干细胞治疗2型糖尿病的机制。方法：选取第三军医大学附属新桥医院内分泌科住院符合纳入标准及排除标准的共18例患者，获得知情同意书后接受自体骨髓间充质干细胞移植治疗。①粒细胞集落刺激因子动员骨髓;②患者俯卧位腰麻，双侧髂后上棘多点穿刺，抽取骨髓血200ml，将采集的骨髓血进行干细胞分离;③经腹股沟动脉插管将干细胞注入胰背动脉和/或胰横动脉;④观察患者移植前及移植后FPG(空腹血糖)、2h-PG小时(餐后2小时血糖)、F-CP(空腹C肽)、2h-CP(餐后2小时C肽)、AUCC(C肽曲线下面积)、HbAlc(糖化血红蛋白)、BMI(体重指数)等指标的变化，并用统计学方法分析。同时观察有无并发症及不良反应。结果：18例患者(12男6女)，其中8例患者进行3月随访，5例患者进行6月随访，5例患者进行12月随访。①自体骨髓干细胞移植过程中及术后随访均未观察到不良反应，移植前后肿瘤标志物及血淀粉酶均正常;②术后随访3月、6月、12月随访糖化血红蛋白(HbA1c)较移植前不同程度下降，其中3月、6月统计学有显着差异;3月、6月、12月空腹C肽(FC-P)及餐后2小时C肽(2hC-P)较移植前不同程度上升。空腹C肽升高达到统计学意义。在3月、6月、12月随访时与治疗前相比AUCC升高(5.93±5.85vs7.26±5.73,3.8±1.6vs5.8±2.38,4.73±5.32vs7.64±4.68)。有1例患者在术后第一日出现低颅压综合征，平卧休息后临床症状缓解，无特殊不适。结论 1.人类骨髓干细胞体外分离纯化试剂盒分离的人骨髓间充质干细胞，获得的细胞纯度高，扩增能力强。 2.流式细胞仪检测分离培养的BM-MSCs高度表达CD44、CD90，但不表达CD34、CD45。 3.自体骨髓来源干细胞移植治疗糖尿病的安全性较高，对2型糖尿病患者的胰岛功能可不同程度地改善。

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KCTD15调控小鼠3T3-L1前体脂肪细胞分化的功能与作用机制

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作者：张鹏第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景与目的肥胖症是一种在遗传和环境因素共同作用下，导致体内脂肪堆积过多和(或)分布异常，体重增加的慢性代谢性疾病。在人群中进行的全基因组关联分析和动物模型水平上的研究，证实KCTD15(potassium channel tetramerisation d... 详细信息

研究背景与目的肥胖症是一种在遗传和环境因素共同作用下，导致体内脂肪堆积过多和(或)分布异常，体重增加的慢性代谢性疾病。在人群中进行的全基因组关联分析和动物模型水平上的研究，证实KCTD15(potassium channel tetramerisation domain containing15)基因的变异与肥胖发生具有紧密相关性。以小鼠3T3-L1前体脂肪细胞为细胞模型的最新研究结果显示KCTD15基因在脂肪细胞分化的前期具有重要作用，KCTD15基因敲低能够抑制3T3-L1前体脂肪细胞分化。但KCTD15调控肥胖发生和脂肪细胞分化的潜在作用机制尚不清楚。本课题前期临床研究显示KCTD15基因的mRNA水平表达在超重、肥胖患者白色脂肪组织中较正常体重患者的白色脂肪组织中明显降低。因此，本研究以小鼠3T3-L1前体脂肪细胞为细胞模型，综合运用RNA干扰技术、表达谱芯片技术和生物信息学分析方法，筛查并鉴定KCTD15基因敲低前后表达水平受显著扰动基因。鉴定的潜在靶基因为进一步阐明KCTD15基因的功能，探讨其肥胖相关性的作用机制，寻找新的肥胖症治疗的靶点提供理论依据。实验方法 1.运用细胞培养技术，培养小鼠3T3-L1前体脂肪细胞。 2.运用RNA干扰技术，在小鼠3T3-L1前体脂肪细胞中特异性敲低KCTD15基因。 3.运用半定量RT-PCR和Western-Blot技术检测敲低前后KCTD15基因表达水平。 4.运用表达谱芯片技术筛查差异表达基因。 5.运用生物信息学方法对筛查的差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。 6．运用半定量RT-PCR技术验证差异表达基因的mRNA表达水平。结果 1.运用细胞培养技术，成功的培养了小鼠3T3-L1前体脂肪细胞。 2.半定量RT-PCR和Western-Blot实验结果表明，RNA干扰技术成功抑制了KCTD15基因的mRNA水平和总体蛋白水平表达。 3.运用表达谱芯片技术，共筛查到386个下调基因和453个上调基因。除去芯片误差，总共筛查到的差异表达基因有833个。 4.差异表达基因的生物信息学分析结果：(1)按生物学过程GO分析结果显示：差异表达基因的功能主要富集在生物膜组装、细胞骨架组装、染色体组装、细胞黏附、脂肪细胞分化、蛋白质代谢以及免疫过程上;(2)按照差异基因编码蛋白的细胞定位GO分析结果显示：绝大多数差异表达基因编码的蛋白位于细胞骨架和生物膜上;(3)按照差异表达基因的分子功能GO分析结果显示：差异表达基因主要富集到细胞骨架的结合、调节核苷三磷酸酶的活性和酶抑制剂上;(4) KEGG通路分析结果显示：差异表达基因主要可以富集到二羧酸代谢和半乳糖代谢2条通路中。 5.半定量RT-PCR验证结果显示：CUX1基因和ABCA7基因的表达量升高，MTHFD1基因、MDH1基因和VPS4B基因的表达量降低，与表达谱芯片测试结果一致。结论 1、KCTD15基因的功能不完全依赖于已知的经典脂肪细胞分化机制。 2、KCTD15基因功能与细胞骨架和生物膜有关并且影响细胞能量代谢过程。 3、KCTD15基因可能通过影响脂质的合成与运输、DNA甲基化、DNA合成以及转录因子等抑制脂肪细胞的分化。

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含钾离子通道四聚化结构域KCTD15调控脂肪前体细胞分化的分子机制研究

含钾离子通道四聚化结构域KCTD15调控脂肪前体细胞分化的分子机制...

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作者：徐景第三军医大学

学位级别：硕士

遗传、环境和生活方式相互作用导致肥胖的发生。遗传因素在肥胖发生中扮演着重要角色。直至目前为止，超过600个基因位点和候选基因被发现与肥胖以及肥胖表型有关。全基因组关联研究在大量的人群调查中证实遗传因素与脂肪形成及肥胖的... 详细信息

遗传、环境和生活方式相互作用导致肥胖的发生。遗传因素在肥胖发生中扮演着重要角色。直至目前为止，超过600个基因位点和候选基因被发现与肥胖以及肥胖表型有关。全基因组关联研究在大量的人群调查中证实遗传因素与脂肪形成及肥胖的发生紧密相关，但肥胖相关基因在人体组织中的表达谱还未完全阐明。遵照赫尔辛基宣言要求，我们收集了23例超重、肥胖患者和16例正常体重人群的白色脂肪组织，提取这些样本中的总RNA，通过半定量逆转录PCR方法检测FTO、TMEM18、SH2B1、KCTD15、GNPDA2、NEGR1、MTCH2和MC4R肥胖相关基因在人体白色脂肪组织中mRNA的表达并进一步检测了KCTD15基因对脂肪前体细胞分化的影响。结果如下：在所检测的8个与肥胖密切相关的基因中，比起正常体重的人群，SH2B1, TMEM18,FTO和KCTD15mRNA水平在超重和肥胖患者中明显下降;NEGR1水平在超重和肥胖患者中的表达升高;而MTCH2、GNPDA2、MC4R mRNA水平无明显变化。通过分析这些基因的表达与体重指数（BMI）的相关性，我们发现在超重、肥胖人群白色脂肪组织的标本中，KCTD15基因的表达与BMI负相关，这与在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中KCTD15基因低表达相一致。在3T3-L1脂肪前体细胞增殖分化过程中，通过RNA干扰技术敲低KCTD15基因，结果发现该基因的敲低能显著抑制脂肪前体细胞分化和脂质积累;敲低KCTD15基因后，成脂关键转录因子如PPARγ，C/EBPα，C/EBPβ和C/EBPδ均无明显变化。以上结果显示，我们的研究首次阐明了8个肥胖相关基因在中国超重、肥胖人群和正常体重人群白色脂肪组织中的表达。KCTD15基因在超重、肥胖人群中白色脂肪组织中表达的下调可能是调控脂肪前体细胞分化的结果。因此，KCTD15基因在脂肪前体细胞分化早期阶段的调控作用有待进一步研究。

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Mibefradil对INS-1细胞糖毒性保护作用的初步研究

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作者：游成姗第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景2型糖尿病是胰岛β细胞的功能障碍和外周组织的胰岛素抵抗为主要特征的一类代谢性疾病。长期高血糖对胰岛细胞的胰岛素合成、分泌以及存活等均产生不利的影响,其中涉及多种机制,包括体内钙离子平衡的破坏[1]。钙离子平衡的紊乱... 详细信息

研究背景2型糖尿病是胰岛β细胞的功能障碍和外周组织的胰岛素抵抗为主要特征的一类代谢性疾病。长期高血糖对胰岛细胞的胰岛素合成、分泌以及存活等均产生不利的影响,其中涉及多种机制,包括体内钙离子平衡的破坏[1]。钙离子平衡的紊乱对胰岛β细胞生长/功能和胰岛素分泌信号通路均会产生抑制作用[2]。Mibefradil作为选择性T型钙通道拮抗剂,对T型钙离子通道的阻滞效应约为其对L型钙离子通道阻滞效应的30-100倍,最早作为抗心绞痛、降压药物应用于临床,目前该药物广泛用于肿瘤、疼痛、癫痫等方面的研究,在糖尿病方面研究尚不深入。T型钙通道是低电压激活钙离子通道,该通道仅需一个较低的电压(约-70mv)即可被激活,因此是唯一一类允许钙离子在膜静息电位内流的通道[3]。本课题组既往研究发现T型钙通道在db/db小鼠(2型糖尿病模型小鼠,瘦素受体自发突变导致极度肥胖、多食、消渴、多尿等)肝脏、脑组织中表达明显高于野生型小鼠,Mibefradil可明显降低db/db小鼠的血糖及血脂水平,但对正常小鼠则无明显作用[4]。迄今为止,T型钙通道特别是Mibefradil在胰岛β细胞中的作用仍不清楚。因此本研究拟将高糖培养大鼠胰岛素瘤细胞株(INS-1)作为研究对象,高糖培养细胞构建细胞高糖模型,Mibefradil干预INS-1细胞,采用NNC 55-0396(NNC,仅拮抗T型钙离子通道)、尼卡地平(Nic,仅拮抗L型钙离子通道)作为对照药物,观察药物对INS-1细胞凋亡、胰岛素分泌的作用,在此基础上进一步观察其对INS-1细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达的作用,以期初步探讨Mibefradil对INS-1细胞功能的作用及其可能的机制。方法:本课题将INS-1细胞作为研究对象,利用CCK-8法检测细胞增殖确定最佳高糖及药物(Mibefradil、NNC 55-0396、尼卡地平)作用浓度及时间后,高浓度葡萄糖(33.3mmol/L)处理细胞构建细胞高糖模型。将细胞分为正常培养组、高糖组、药物组、高糖+药物组,流式细胞技术检测细胞凋亡、放射免疫法检测细胞胰岛素分泌,以观察药物对INS-1细胞凋亡及胰岛素分泌的作用,RT-PCR、Western-Blot检测T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达观察药物对其表达的作用。主要结果:1.较正常培养组,33.3mmol/L葡萄糖孵育细胞72h时,显著抑制细胞增殖(P0.05),在此基础上增加药物浓度或延长作用时间均可显著抑制细胞增殖(P0.05)。3.较正常培养组,药物组细胞基础胰岛素分泌(3.3mmol/L葡萄糖刺激)及葡萄糖刺激胰岛素分泌(16.7mmol/L葡萄糖刺激)均无显著差异(P>0.05)。较高糖组,只有高糖+Mibefradil组显著降低细胞胰岛素分泌(基础分泌以及葡萄糖刺激胰岛素分泌)(P0.05);而与高糖培养组相比,高糖+Mibefrail组显著降低T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基的基因及蛋白表达(P<0.05)。主要结论:1.本实验中Mibefradil、NNC 55-0396、尼卡地平对高糖诱导的INS-1细胞凋亡无明显保护作用。***可显著抑制高糖作用下INS-1细胞胰岛素分泌,同时对正常培养的INS-1细胞无此作用;3.高糖可增加INS-1细胞中T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达;***可显著抑制高糖培养下INS-1细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基的基因及蛋白表达,而对正常培养的INS-1细胞无明显作用。上述结果提示Mibefradil对正常培养下INS-1细胞胰岛素分泌以及cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达均无明显作用,仅降低高糖培养下INS-1细胞胰岛素分泌、T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达,提示Mibefraidl可能通过拮抗T型钙通道抑制高糖作用下INS-1细胞胰岛素分泌,为深入研究T型钙通道及Mibefra

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Mibefradil对db/db鼠的降糖作用及其机制初步研究

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作者：路玉洁第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景: 糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组因长期慢性高血糖导致机体外周组织胰岛素敏感性降低，伴或不伴胰岛β细胞合成胰岛素能力缺陷的内分泌性疾病。现有许多研究证实糖尿病患者存在细胞内钙离子调节紊乱，新近研究表明，... 详细信息

研究背景: 糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组因长期慢性高血糖导致机体外周组织胰岛素敏感性降低，伴或不伴胰岛β细胞合成胰岛素能力缺陷的内分泌性疾病。现有许多研究证实糖尿病患者存在细胞内钙离子调节紊乱，新近研究表明，胰岛β细胞属电兴奋性细胞，β细胞膜ATP依赖的钙通道及钾通道是影响胰岛素分泌的重要离子通道，在人类和啮齿类动物中钙离子通道影响葡萄糖诱导胰岛素分泌水平。钙离子通道阻滞剂是一种通过阻断细胞膜钙离子通道，抑制胞外的钙离子内流，使胞内钙离子水平降低，继而调节靶器官功能的药物。目前，已有少数关于L型钙离子通道阻滞剂对糖尿病影响的报道，但尚未有将T型钙离子通道阻滞剂应用于糖尿病模型，对其降糖作用的研究报道。本研究拟利用T型钙离子通道阻滞剂Mibefardil、NNC55-0396以及L型钙离子通道阻滞剂nicardipine分别干预db/db鼠，观察对比其降糖效果，并深入了解Mibefardil对糖代谢相关指标及T型钙离子通道特异性亚基Cav3.1及Cav3.2的表达，并对其作用机制进行初步探讨。方法: 取8W鼠龄雄性野生型小鼠及db/db鼠各24只，分别按随机法分为4组（共8组）：野生安慰剂组、野生Mibefradil干预组、野生NNC干预组、野生nicardipine干预组、db/db安慰剂组、db/db Mibefradil干预组、db/db NNC干预组及db/db nicardipine干预组（n=6）。Mibefradil与NNC组予30mg/(kg d)剂量，nicardipine组予25mg/(kg d)剂量，安慰剂组予等体积生理盐水，均腹腔注射，分早晚两次给药，干预1周;比较实验动物药物干预前后血糖、体质量、平均血压、心率及ITT的变化。重点观察Mibefradil干预后胰岛素、糖化血红蛋白及总胆固醇的变化水平，并用免疫组织化学法及Western-Blot检测T型钙通道特异性亚基Cav3.1及Cav3.2表达水平。结果: （1）与db/db安慰剂组相比，药物干预后，db/db Mibefradil组及db/db NNC干预组空腹血糖水平显著下降（P0.05）;而野生安慰剂组和野生药物干预各组之间均无明显差异（均P>0.05）;（2）与db/db安慰剂组相比，药物干预后，db/db Mibefradil组及db/db NNC干预组均体质量明显下降（P0.05）;而野生安慰剂组和野生药物干预各组之间均无明显差异（均P>0.05）;（3）与db/db安慰剂组比较，药物干预后，db/db Mibefradil组24h摄食量、基础胰岛素、糖化血红蛋白、胆固醇水平均明显下降（均P0.05）;（4）db/db鼠在肝脏及脑组织中发现Cav3.1及Cav3.2较野生安慰剂组蛋白高表达（均P0.05）。结论: Mibefradil具有降低2型糖尿病高血糖的作用，其降血糖作用不同于传统糖代谢途径，是通过调节电压依赖性的钙通道发挥作用的。

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蒙花苷对2型糖尿病肝损伤炎症反应和氧化应激的保护作用及其机制的初步研究

蒙花苷对2型糖尿病肝损伤炎症反应和氧化应激的保护作用及其机制...

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作者：王桐中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是由于人体胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗所引起的以血葡萄糖水平升高为主要特征的慢性代谢性疾病,其患病率逐年增高,严重威胁人类健康。其中2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)约占DM患者总... 详细信息

研究背景糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是由于人体胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗所引起的以血葡萄糖水平升高为主要特征的慢性代谢性疾病,其患病率逐年增高,严重威胁人类健康。其中2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)约占DM患者总数的90%。T2DM患者长期处于高血糖状态并伴有靶器官的胰岛素抵抗可导致多种组织器官出现病理性损伤,包括肝脏。以往研究表明,糖尿病肝损伤(Diabetic Liver Injury,DLI)的发病机制可能与胰岛素抵抗、氧化应激、炎症、脂肪代谢紊乱等因素有关。醛酮还原酶家族1成员B1(Aldo-keto Reductase Family 1 Member B1,AKR1B1),也称醛糖还原酶(Aldose Reductase,AR),是多元醇途径(体内葡萄糖代谢的一种途径)的关键酶,广泛参与人体细胞代谢、免疫应答、炎症反应和氧化应激等生命活动,与多种糖尿病并发症的发生发展密切相关。最近有研究发现AKR1B1可能是非酒精性脂肪性肝病的潜在治疗靶点,而对于其是否参与DLI进展知之甚少。目前,临床上针对DLI的治疗依然以降糖与保肝治疗为主,缺乏针对性药物。因此,进一步探明DLI的发病机制,寻找DLI的药物治疗靶点具有重要意义。蒙花苷(Linarin,LN)是野菊花的有效成分,其具有抗炎、抗氧化应激、抗高血压、抗肿瘤、抗骨质疏松和神经保护等药理作用,但关于其在DLI中的作用未见报道。因此本课题将从动物与细胞水平,通过检测炎症与氧化应激指标评价LN对DLI的作用,并通过质粒转染过表达AKR1B1,进一步探讨LN可能的作用机制。目的与方法第一部分实验:构建大鼠T2DM模型与观察LN对T2DM大鼠肝脏损伤的保护作用。雄性SD大鼠在适应性饲养1 w后,按体重大小随机分为正常对照组与T2DM造模组,并分别给予常规饲料和高脂饲料喂养5 w。然后,对所有T2DM造模组的大鼠腹腔注射链脲佐菌素,剂量为30 mg/kg,以构建T2DM大鼠模型,注射后分别于24 h、72 h、7 d时检测随机血糖水平,若三次均大于16.7 mmol/L即视为造模成功。将成模大鼠随机分成:T2DM组、LN 15 mg/kg组、LN 30 mg/kg组和LN 60 mg/kg组,各治疗组分别给予相应剂量的LN灌胃处理,正常对照组和T2DM组大鼠给予等量溶剂对照溶液灌胃,干预时间为4 w。期间观察大鼠基本状况,每周通过使用代谢笼监测每只大鼠24 h进食量、饮水量与尿量,记录大鼠体重与空腹血糖。干预工作完成后,从心尖取血,并收集肝组织;检测血清中转氨酶水平(ALT和AST)、血脂指标(TC、TG、HDL-C和LDL-C);试剂盒检测血清胰岛素水平、肝组织匀浆液中炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)水平和氧化应激指标(SOD、GSH-Px和MDA);肝组织切片后分别进行H&E染色与油红O染色,观察其病理结构改变与脂质蓄积情况。第二部分实验:观察LN对高糖高脂诱导的人肝星状细胞LX-2炎症反应与氧化应激的影响。用33.3 mmol/L葡萄糖和0.1 mmol/L棕榈酸共处理LX-2细胞24 h,建立DLI的体外模型。实验分为对照组(Control)、模型组(Model)和干预组(LN 20μmol/L),试剂盒检测各组LX-2细胞内及细胞上清液中氧化应激指标(SOD、GSH-Px和MDA)和炎症因子水平(TNF-α、IL-1β和IL-6);流式细胞仪检测各组LX-2细胞的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)与凋亡水平。第三部分实验:阐明LN通过抑制AKR1B1调节炎症反应与氧化应激改善DLI。通过免疫印迹试验检测动物实验中各组大鼠肝组织AKR1B1蛋白表达水平。实时荧光定量PCR检测10μmol/L、20μmol/L和50μmol/L LN对DLI细胞模型中AKR1B1表达水平的影响。然后构建AKR1B1过表达质粒并转染LX-2细胞,设立对照组(Control)、模型组(Model)、干预组(LN 20μmol/L)、转染空质粒组(LN 20μmol/L+oe-NC)和转染AKR1B1过表达质粒组(LN 20μmol/L+oe-AKR1B1),再次检测过表达AKR1B1后各组LX-2细胞及细胞上清液中氧化应激指标(SOD、GSH-Px和MDA)与炎症因子水平(TNF-α、IL-1β和IL-6);流式细胞仪检测各组LX-2细胞的ROS与凋亡水平。结果***干预4 w后,与正常对照组相比,T2DM组大鼠24 h进食量、饮水量、尿量和空腹血糖显著增加,体重显著下降;此外,T2DM组大鼠血清胰岛素水平显著下降(P<0.01),HOMA-IR显著升高(P<0.01),血清TC、TG和LD

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巴马汀对db/db小鼠主动脉的保护作用及分子机制研究

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作者：李端芳第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景糖尿病大血管病变是糖尿病重要的并发症之一,已成为糖尿病致死致残的首要原因。因此,改善和治疗糖尿病大血管病变的干预和治疗手段显得尤为迫切。糖尿病患者长期处于高血糖环境下,而高血糖造成糖尿病患者凝血功能和血液粘度大... 详细信息

研究背景糖尿病大血管病变是糖尿病重要的并发症之一,已成为糖尿病致死致残的首要原因。因此,改善和治疗糖尿病大血管病变的干预和治疗手段显得尤为迫切。糖尿病患者长期处于高血糖环境下,而高血糖造成糖尿病患者凝血功能和血液粘度大大提高,促进血小板聚集,诱发动脉粥样硬化,而动脉粥样硬化是糖尿病血管病变的基础。同时,高血糖诱发严重的氧化应激,导致组织细胞氧化应激损伤和慢性炎症反应,引发糖尿病大血管病变。而Nrf2是机体氧化应激的感受器,在细胞抗氧化应激中发挥重要作用。在氧化应激状态下,活化的Nrf2与ARE的特异识别位点相结合,上调下游靶分子SOD、HO-1、γ-GCS等抗氧化酶的表达,增强细胞抗氧化能力,抑制氧化应激反应。因此,激活Nrf2通路有利于抑制氧化应激损伤。综上所述,有效抑制糖尿病患者的高血糖同时阻断氧化应激对于缓解和治疗糖尿病大血管病变具有重要的意义。巴马汀(palmatine)是从黄连中提取的一种季胺盐异喹啉类生物碱,又名黄藤素(hindarinine),是中国自行研制的纯天然植物药,化学名为5,6-二氢-2,3,9,10-四甲氧基二苯并[a,g]喹嗪内鎓(5,6-dihydro-2,3,9,10-tetramethoxy-dibenzo[a,g]quinolizinium)。于1977年首次收载于《中华人民共和国药典》,用于治疗妇科炎症、外科感染、菌痢、肠炎、呼吸道及泌尿道感染、眼结膜炎等(国家药典委员会,1977)。多项研究表明,巴马汀具有抗糖尿病和抗氧化活性等多种药学功效。目前,关于巴马汀是否能够减轻糖尿病大血管病变,国内外尚未见报道。本研究利用db/db小鼠主动脉病变模型,以核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor2,Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)/血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)信号通路为靶点,探讨巴马汀对糖尿病损伤主动脉的保护作用及其可能机制。研究目的通过不同剂量的巴马汀对糖尿病小鼠的干预,检测各组小鼠血糖血脂水平的变化,重点观察糖尿病小鼠主动脉内膜增生的程度,同时检测相关氧化应激指标及观察Nrf2和HO-1蛋白的表达,进一步探讨巴马汀对糖尿病损伤主动脉的保护作用可能的分子机制。研究方法将8周龄db/db小鼠32只随机分为糖尿病模型组(D组)、巴马汀低剂量组[75 mg/(kg·d)](D+LP组)、中剂量组[150 mg/(kg·d)](D+MP组)、高剂量组[300 mg/(kg·d)](D+HP组),每组8只db/db小鼠,并以8只db/m小鼠作为对照组(con组)。各组小鼠经灌胃给药16周,糖尿病模型组和对照组小鼠给予等量的生理盐水。通过HE染色观察各组小鼠主动脉组织病理变化情况;通过透射电镜检测各组小鼠主动脉超微结构变化;检测各组小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和血脂(总胆固醇和甘油三脂);并检测各组小鼠血清中总抗氧化力(total antioxidant capacity,T-AOC)、丙二(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的水平;通过Western blot检测各组小鼠主动脉组织中血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)和核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)的表达。研究结果1.巴马汀对db/db小鼠血糖和血脂的作用:(1)与con组小鼠相比,D组小鼠空腹血糖明显升高(P<0.01)。各实验组小鼠相比,D+LP组、D+MP组和D+HP组小鼠空腹血糖浓度随着给药时间的增加而逐渐降低,并且给药剂量越高血糖浓度下降越明显。(2)与con组相比,D组小鼠血清中TG和TC的含量明显升高(P<0.01;P<0.01);而与D组小鼠相比,经过巴马汀治疗后D+MP组和D+HP组小鼠血清TG和TC的含量显著降低;并且给药剂量越高血清中TG和TC的含量下降越明显。(3)与con组相比,D组小鼠HbA1c的含量明显升高(P<0.01);与D组小鼠相比,经过巴马汀治疗后的D+MP组和D+HP组小鼠HbA1c含量明显降低(P<0.01,P<0.01);并且给药剂量越高HbA1c含量下降越明显。2.巴马汀对db/db小鼠主动脉内膜增生的作用:(1)HE染色结果表明中剂量和高剂量的巴马汀能够明显减轻小鼠主动脉内膜增生,使小鼠主动脉组织病变程度明显降低;(2)透射电镜结果表明中剂量和高剂量的巴马汀能够明显减低小鼠主动脉内皮细胞中空泡堆积。3

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二甲双胍上调血清可溶性瘦素受体水平及其机制的初步探讨

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作者：李婧雯第三军医大学

学位级别：硕士

背景和目的：可溶性瘦素受体(soluble leptin receptor，sOB-R)是人体血液循环中最主要的瘦素结合蛋白，它们从细胞表面的瘦素受体胞外区域水解脱落而产生，调节血浆中的游离型/结合型瘦素之比，进而调节体内瘦素的生理功能及其生物利... 详细信息

背景和目的：可溶性瘦素受体(soluble leptin receptor，sOB-R)是人体血液循环中最主要的瘦素结合蛋白，它们从细胞表面的瘦素受体胞外区域水解脱落而产生，调节血浆中的游离型/结合型瘦素之比，进而调节体内瘦素的生理功能及其生物利用度[1]。越来越多的流行病学研究发现，血浆sOB-R的水平与肥胖、2型糖尿病(T2DM)及结直肠癌等疾病的发生发展呈负相关性[2]。其中在一项针对健康人群的前瞻性研究中发现，sOB-R的水平与血压、空腹血糖、低密度脂蛋白胆固醇等与代谢综合征相关的指标呈负相关性，与高密度脂蛋白呈正相关性[3]。有报道显示，在实施了胃部分切除的病态肥胖患者中，术后sOB-R水平呈显著升高[4]。不单如此，肥胖者体内sOB-R水平降低，经过低热卡饮食成功减肥之后，其血浆sOB-R的水平升高[5]。这些结果提示：血浆sOB-R的水平升高有可能作为改善肥胖、T2DM患者代谢状态的生化指征。尽管控制饮食或行外科手术都能有效改善肥胖T2DM患者的糖代谢状态，但在临床上，绝大多数肥胖T2DM患者仍需要且首选降糖药物治疗。二甲双胍(metformin)是治疗肥胖T2DM的一线主要用药，具有降低体重、抑制肝糖元生成、改善胰岛素抵抗(insulin resistant，IR)等功能，由此达到降血糖的作用[6]。但二甲双胍在改善患者体内葡萄糖代谢的同时是否伴随sOB-R水平的升高，目前国内外尚未见报道。为此，本研究进行了如下的工作： (1)采用长程高脂喂养小鼠，诱导其产生IR、空腹血糖受损(impaired fasting glucose,IFG)及糖耐量受损(impaired glucose tolerance，IGT)以模拟人体糖代谢损伤的疾病模型，经二甲双胍用药后，观察空腹血糖及糖耐量的改善情况，特别是血浆中sOB-R水平的变化。 (2)在临床收集初发T2DM病人血浆，经过二甲双胍用药一个月后，通过随访再次收集其复诊时的血浆。与其用药前血浆作为对照，进而观察二甲双胍治疗对T2DM病人血浆中sOB-R水平的影响。 (3)由于血浆sOB-R主要来源于各组织细胞表面瘦素受体胞外区的裂解脱落，而肝脏是体内瘦素受体表达最丰富的组织器官，因此我们采用实时定量PCR检测了二甲双胍用药前后小鼠肝组织以及体外培养的的人肝细胞(L02)经二甲双胍处理前后的瘦素受体基因表达的水平。材料与方法： 1.按本实验室的研究方法，将购买的C57BL/6小鼠随机分为高脂(HF)饮食组(n=21)与正常(CD)饮食组(n=21)，在分别喂养5个月后，通过检测FPG、体重及糖耐量的变化来评价小鼠糖代谢的功能，从而复制糖代谢损伤的实验动物模型。 2.在成功建立小鼠糖代谢受损模型后，我们启动了二甲双胍(50mg/kg/d、200mg/kg/d)药物干预，经过15天连续灌胃后对小鼠的体重、FPG、空腹血浆胰岛素水平(Fins)、HOMA-IR及血浆sOB-R水平等与糖代谢相关的生化指标进行检测，以观察二甲双胍用药对小鼠的葡萄糖代谢及血浆sOB-R水平的影响。 3.收集临床初发T2DM病人与对照组血浆及其相关临床检查数据，给予病人二甲双胍(1.5g/d)单药治疗一个月后，复诊，再次分别收集病人血浆，实验室检测二甲双胍对2型糖尿病人血浆中的sOB-R及瘦素的影响。 4.为了进一步了解二甲双胍上调血浆sOB-R的机制，我们采用real-time PCR检测了二甲双胍对小鼠肝脏瘦素受体基因表达的影响,同时也在培养的人胎肝细胞株(L02)进行了验证。结果： 1. HF组小鼠的FPG与CD组相比明显升高(9.27±1.36vs6.87±0.15mmol/L)。腹腔内注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)的检测结果显示：HF组小鼠的FPG、腹腔内注射葡萄糖后30、60、120min的血糖水平均高于相同时间点CD组的血糖水平，表明HF组小鼠的糖耐量已受损。提示HF组小鼠经过5个月的长程高脂喂养以后成功建立了糖代谢受损模型。 2.二甲双胍(50mg/kg/d、200mg/kg/d)干预能显著降低HF组小鼠的FPG(9.70±0.75vs5.85±1.33vs5.11±1.04mmol/L)、HOMA-IR(11.46±1.84vs6.40±2.15vs6.01±1.81)、Fins(30.62±5.34vs26.52±9.37vs23.28±8.25mU/L)的水平，增强了机体胰岛素的敏感性，改善了小鼠体内的葡萄糖代谢水平。 3.无论是HF组还是CD组小鼠，血清sOB-R的水平与其对照组相比都显著升高(CD组：13.49±0.00vs27.37±0.01vs54.08±0.04ng/ml;HF组：23.92±0.00vs37.16±0.01vs57.94±0.01ng/ml)

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Mibefradil在高糖诱导的心肌肥大中的作用机制研究

引用

作者：赵灵巩中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)的并发症之一,是排除其他病因,仅以高血糖、胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症引起的,以心肌细胞代谢紊乱为特征的心肌病变,虽然临床和流... 详细信息

研究背景糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)的并发症之一,是排除其他病因,仅以高血糖、胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症引起的,以心肌细胞代谢紊乱为特征的心肌病变,虽然临床和流行病学证据都支持这一概念,但是目前对DCM的治疗依然以对症治疗为主,尚无针对这一疾病的药物问世。因此,对DCM的发病机制的进一步研究,可以深化对DCM的认识,有助于寻找DCM的药物治疗靶点。Mibefradil是一种特异性的T型钙离子通道阻滞剂。T型钙通道是广泛存在于神经、肾脏、平滑肌、血管内皮、心脏等多个器官的一种电压门控钙通道,具有低电压、失活速度快、单通道等特点,是人体内唯一的低电压钙通道。T型钙离子通道主要有Cav3.1(α1G)、CaV3.2(α1H)、Cav3.3(α1I)三种亚型。在胚胎时期,心脏的T型钙通道大量表达,与心脏的生长发育相关。机体成年后,心室的T型钙通道表达几乎消失,而心房中存在少量T型钙通道,参与窦房结4期缓慢去极化。研究表明,在一些病理状态下,如高血压心脏病和心衰,T型钙通道可在心室中大量再表达,而对T型钙通道进行敲除或抑制,可以改善高血压引起的心肌肥大、降低猝死率。离体研究显示,心肌细胞的T型钙通道在25 mM葡萄糖浓度培养基环境下表达水平显著高于5 mM葡萄糖浓度的培养基,这表明高葡萄糖环境会引起心肌细胞T型钙通道的表达上调。这一现象,提示,糖尿病高血糖环境引起DCM,可能是由于T型钙通道表达上调引起下游信号通路活性改变而导致的。目的与方法第一部分实验:探究高糖模型模拟体内高血糖环境的最佳处理时间。首先培养H9c2大鼠心肌细胞,实验分为5组:对照组,高糖处理12 h组,高糖处理24 h组,高糖处理48 h组,高糖处理72 h组,分别用CCK-8法检测细胞生存率;检测心肌肥大水平心肌肥大相关基因表达和心肌细胞表面积的改变。第二部分实验:根据第一部分实验结果确定高糖模型所需高糖处理的最佳时长。采用T型钙离子通道抑制剂mibefradil作为处理药物。实验分为四组:对照组,高糖+溶剂组(高糖组),高糖+mibefradil低剂量组(低剂量组),高糖+mibefradil高剂量组(高剂量组)。在倒置显微镜下观察细胞生长状态;CCK-8检测各组细胞生存率;检测心肌肥大水平(心肌肥大相关基因表达和心肌细胞表面积);检测细胞自噬情况;检测心肌肥大信号通路和自噬信号通路活化水平。第三部分实验:通过药物干预H9c2大鼠心肌细胞在各组的自噬水平,观察mibefradil是否通过PI3K/Akt/m TOR信号通路改变自噬而改善心肌细胞肥大。实验分为5组,对照组,高糖+溶剂组(高糖组),高糖+mibefradil组(mibefradil组),高糖+mibefradil+MK2206预处理组(MK2206组),高糖+mibefradil+rapamycin预处理组(Rapamycin组)。在倒置显微镜下观察细胞生长状态;CCK-8检测各组细胞生存率;检测心肌肥大水平(心肌肥大相关基因表达和心肌细胞表面积);检测细胞自噬情况。通过电镜观察细胞内线粒体肿胀和自噬小体数量情况。检测心肌肥大信号通路和自噬信号通路活化水平。结果1.与对照组相比,高葡萄糖浓度(30 mmol/L)培养基环境处理12 h、24 h后,细胞存活率没有显著改变(P>0.05)。而培养48 h和72 h后,细胞存活率均显著下降(P0.05)。***可显著降低高糖环境下H9c2心肌细胞心肌肥大基因ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达水平(P<0.05);同时,mibefradil以剂量依赖性方式缩小了高糖处理的H9c2心肌细胞表面积。与对照组相比,高糖环境的H9c2心肌细胞p62蛋白水平降低,自噬小体数量增加(P<0.05),而mibefradil显著升高了高糖环境的H9c2心肌细胞的p62蛋白表达量,减少了自噬小体的数量(P<0.05),抑制了自噬。高糖环境下,Calcineurin的蛋白表达量上调,提高了NFAT3在细胞核内的蛋白含量,而mibefradil对其具有显著的抑制作用(P<0.05)。同时高糖环境轻度激活了PI3K/Akt/mTOR信号通路,对比对照组,PI3K、Akt和mTOR的总蛋白含量没有改变,但是磷酸化水平轻度升

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Mibefradil通过CaMKⅡ-FoxO1通路改善糖代谢机制的初步研究

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作者：李沛霖中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景:糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）,主要是由于代谢障碍所导致的慢性疾病,目前已从少见病变成一个全球流行的严重性疾病,特别是2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）在所有人群中的流行率都在急剧上升。由于T2DM发病机理... 详细信息

研究背景:糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）,主要是由于代谢障碍所导致的慢性疾病,目前已从少见病变成一个全球流行的严重性疾病,特别是2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）在所有人群中的流行率都在急剧上升。由于T2DM发病机理复杂,治疗手段有限是T2DM的临床治疗的新瓶颈。所以进一步探明T2DM发生发展的具体分子机制,可以为其临床治疗找到新的治疗思路和治疗靶标。胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）是T2DM发生发展的核心环节。研究证实,在T2DM发病过程中会出现持续性的钙离子紊乱,而用钙通道拮抗剂对糖尿病动物模型进行治疗后可以改善胞内调节紊乱作用,并通过调节细胞钙离子异常改善糖代谢,因此,深入探究胰岛素抵抗状态下的钙离子紊乱,能给临床治疗T2DM带来新思路。Mibefradil能高选择性地阻滞T型钙通道,有研究证明Mibefradil能够改善糖尿病小鼠血糖,可能是通过阻滞T型钙通道而达成的。胞内钙离子浓度升高与钙调蛋白结合会磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶2（Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ）,增加肝糖输出,CaMKⅡ的翻译后修饰可以增强与糖尿病发病密切相关的转录因子FoxO1的细胞核定位。生理条件下胰岛素可以激活FoxO1的磷酸化并使得FoxO1向胞浆移动,调控糖异生的关键限速酶:葡萄糖-6-磷酸激酶（Glucose-6-phosphokinase,G6Pase）及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate Carboxykinase,PEPCK）表达下调,糖异生过程减弱,血糖下降。因此本课题将通过研究Mibefradil调节CaMKⅡFoxO1通路在糖尿病糖代谢中的作用及其机制,初步探寻改善钙离子紊乱与调节糖代谢的关系,进一步阐述糖尿病的发病机制,为临床治疗预防糖尿病找寻可能的新方向。方法:1.探究Mibefradil处理后能否改善STZ/HFD小鼠糖代谢并保护糖尿病靶器官。采用STZ联合高脂饲料喂养构建STZ/HFD小鼠模型,腹腔注射Mibefradil治疗一周后,检测其对各组小鼠基础糖代谢指标,糖尿病受累靶器官如心脏、肝脏的病理变化。2.阐明Mibefradil通过CaMKⅡ-FoxO1通路改善糖代谢。采用PA诱导IR模型,检测糖原合成,葡萄糖消耗,CaMKⅡ-FoxO1信号通路相关基因和蛋白表达水平,及其磷酸化水平。结果:***能改善链脲佐菌素/高脂喂养（STZ/HFD）小鼠糖代谢并保护心肌细胞。Mibefradil能够降低STZ/HFD小鼠血糖,增加胰岛素敏感性,增加肝糖原合成,减少肝细胞炎性浸润和脂肪样变,改善高血糖情况下的心肌肥大和心肌纤维化***通过CaMKⅡ-FoxO1通路改善糖代谢。Mibefradil药物治疗后可增加IR细胞糖原合成,增加细胞的葡萄糖消耗,降低糖异生调控转录因子FoxO1及关键酶的基因及蛋白表达水平,能降低胞内钙离子浓度,下调CaMKⅡ的磷酸化水平,同时增加IR细胞的Akt及FoxO1的磷酸化水平,减少FoxO1的核定位从而改善细胞的胰岛素抵抗。结论:Mibefradil具有降低2型糖尿病高血糖的作用,可保护糖尿病状态下肝脏和心脏组织,该效应是通过改善细胞内钙离子紊乱,调节CaMKⅡ/AKT/FoxO1通路实现的。

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