检索结果-南通市图书馆

作者：李培群广西医科大学

学位级别：硕士

目的和意义:近年来,肿瘤治疗中新兴的生物治疗对患者毒副作用低,减毒增效作用显著,可望达到延长患者生存期甚至治愈的目的,因此备受关注。在生物治疗中,作为溶瘤病毒（Oncolytic viruses,OVs）家族重要成员的新城疫病毒（Newcastle dise... 详细信息

目的和意义:近年来,肿瘤治疗中新兴的生物治疗对患者毒副作用低,减毒增效作用显著,可望达到延长患者生存期甚至治愈的目的,因此备受关注。在生物治疗中,作为溶瘤病毒（Oncolytic viruses,OVs）家族重要成员的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）展现出了显著的肿瘤细胞清除效应。NDV可以直接杀伤肿瘤细胞,还可以引发免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）并释放损伤相关分子模式（Damage-associated molecular pattern,DAMP）分子,激活肿瘤微环境的抗肿瘤免疫应答。在抗肿瘤免疫的早期应答中,自然杀伤细胞（Natural killer cells,NK）发挥重要作用。我们前期的研究表明,NDV通过KAR途径直接活化NK细胞发挥抗肿瘤效应。然而,在溶瘤病毒治疗的肿瘤微环境中,“肿瘤细胞—免疫细胞—NDV”三者的相互关系比较复杂,NDV清除肿瘤细胞的机制仍有待阐明。结合相关研究成果,即DAMP分子中的高迁移率族蛋白B1（High-mobility group protein B1,HMGB1）是肿瘤微环境中调控NK细胞迁移及抗瘤效应的关键蛋白。我们推测,NDV诱发肿瘤细胞HMGB1的释放,可能是基于NK细胞的NDV抗瘤活化机制之一。本文我们应用NDV体外作用于肿瘤细胞为模型,验证NDV感染致肿瘤细胞发生ICD以及检测HMGB1释放情况;随后检测NDV与肿瘤细胞作用上清液释放因子对NK细胞的趋化作用,进一步检测上清液释放因子对NK细胞抗瘤效应因子表达的影响,探讨HMGB1途径是否为NDV在肿瘤微环境中招募NK细胞浸润的活化途径。最后利用NDV诱发ICD的干扰实验来揭示NDV促使HMGB1释放的ICD主要方式。本实验有助于我们对NDV的抗瘤活化机制进一步认识,也为从DAMP分子角度出发为基于“NDV-NK细胞”的生物治疗提供思路及依据。方法:1.NDV感染肿瘤细胞后对NK细胞迁移情况及抗瘤因子表达影响的测定:将NDV和紫外灭活的NDV均分别感染A549、U87MG细胞,培养12 h、24 h和48 h,显微镜下观察各时间点的细胞病变情况。利用Transwell细胞迁移法观察NDV感染A549细胞对NK细胞迁移情况的影响:Transwell的上室均加入NK细胞,Transwell的下室具体分组如下:A549组（A549细胞培养上清液）、NDV组（含25 HU NDV的F12K培养基）、A549+NDV组（NDV感染A549细胞后的培养上清液）、A549+UV-NDV组（灭活NDV感染A549细胞的培养上清液）、UV-（A549+NDV）组（NDV感染A549细胞的上清液,该上清液加入下室前经过紫外线照射）、MOCK组（仅为F12K培养基）。利用Transwell细胞迁移法观察NDV感染U87MG细胞对NK细胞迁移情况的影响,具体分组与感染A549细胞的分组相同。ELISA检测NDV感染肿瘤细胞后上清液对NK细胞杀瘤效应因子Gzms-B分泌的影响。流式细胞术检测NDV感染肿瘤细胞后上清液对Fas LNK细胞数量的影响。2.NDV感染肿瘤细胞后DAMP分子释放的检测及HMGB1的阻断对NK细胞迁移的影响:血凝效价为25 HU NDV病毒分别感染A549、U87MG细胞12 h、24 h、48 h,ELISA检测病毒感染肿瘤细胞后上清液中HMGB1、HSP70的含量,WB检测病毒感染肿瘤细胞后上清液中HMGB1、HSP70的含量以及细胞膜上CRT的含量。根据NK细胞迁移结果,选取NDV感染细胞48 h时间进行HMGB1单抗阻断迁移实验。3.干扰ICD途径后NDV感染的肿瘤细胞DAMP分子释放的检测:利用CCK8法检测细胞自噬抑制剂（Chloroquine,CQ）、内质网应激抑制剂（GSK）、坏死抑制剂（Necrostain-1,Nec-1）、凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）对细胞存活的影响。各抑制剂预处理A549细胞后,再加入血凝效价为25HU NDV病毒感染12 h、24 h、48 h,分别利用ELISA和WB法检测病毒感染肿瘤细胞后上清液中HMGB1、HSP70的含量。结果:1.NDV感染肿瘤细胞后对NK细胞迁移及抗瘤因子表达的影响:NDV感染后的肿瘤细胞均出现明显的细胞病变,在NDV感染的24 h时,A549和U87MG细胞均出现细胞病变,在感染的48 h时均出现明显的细胞病变。NK细胞迁移实验中,与MOCK组相比,A549+NDV组以及UV-（A549+NDV）组NK细胞迁移的数量均显著增加,差异具有统计学意义（P<0.01）;U87MG+NDV组以及UV-（U87MG+NDV）组NK细胞迁移的数量也均显著增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。A549+NDV组以及UV-（A549+NDV）组NK细胞迁移数量在各个时段均显著高

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鸭源性H6N6亚型禽流感病毒感染小鼠及在人肺组织复制的研究

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作者：李程颐广西医科大学

学位级别：硕士

目的:H6N6亚型禽流感病毒在野生鸟类和禽类动物中广泛流行,病毒持续进化演变,其宿主范围逐渐由禽类动物扩大至哺乳动物,部分病毒甚至具有识别和结合人型SAα-2,6Gal受体的能力。令人担忧的是,一些暴露人群的血清中H6亚型禽流感病毒特异... 详细信息

目的:H6N6亚型禽流感病毒在野生鸟类和禽类动物中广泛流行,病毒持续进化演变,其宿主范围逐渐由禽类动物扩大至哺乳动物,部分病毒甚至具有识别和结合人型SAα-2,6Gal受体的能力。令人担忧的是,一些暴露人群的血清中H6亚型禽流感病毒特异性抗体检测呈阳性。因此,H6N6亚型禽流感病毒具有跨种属屏障感染哺乳动物甚至感染人的潜能。研究证实,陆禽动物鹌鹑、鸡等是禽流感病毒跨种属传播至人的中间宿主,水禽家鸭有助于禽流感病毒传播至陆禽动物,但鸭源性的H6N6亚型禽流感病毒是否能跨种属屏障直接传播至哺乳动物和人还尚未清楚。本研究应用分离自水禽鸭源性的H6N6亚型禽流感病毒,应用基因测序和进化分析,明确H6N6亚型禽流感病毒起源和各基因片段主要关键氨基酸位点的变化;然后应用病毒接种小鼠、人呼吸道组织,观察病毒对小鼠的致病性及在人呼吸道组织的复制能力,初步探索来自水禽鸭源性的H6N6亚型禽流感病毒是否具有感染哺乳动物小鼠及人的潜能,为进一步探究H6N6亚型禽流感病毒的跨种属传播奠定基础。方法:1.禽流感病毒的扩增及HA效价、EID、TCID测定:将3株水禽鸭源性H6N6亚型禽流感病毒A/DK/KM/1135/2019(简称KM1135)、A/DK/GY/1774/2019(简称GY1774)、A/DK/GY/6952/2019(简称GY6952)在鸡胚中进行扩增,收获鸡胚尿囊液,对尿囊液进行HA效价、EID、TCID测定,以扩增本研究所需要的病毒量、明确接种小鼠和人呼吸道组织所使用的病毒浓度。2.基因测序和进化分析:提取病毒的RNA进行逆转录,PCR扩增c DNA后纯化扩增产物,采用Illumina公司的Solexa系统上机检测病毒全基因序列,Mega 7.0和Bioedit 7.0.9进行序列比较,分析H6N6亚型禽流感病毒各基因片段的变化。3.禽流感病毒体内感染BALB/c小鼠:通过滴鼻、滴眼的方式对小鼠进行病毒接种感染,感染后每天记录小鼠体重、体温、精神状态等。感染后3 d、5 d、7 d、14 d分别采集各组小鼠的咽拭子和血液。感染后3 d、5 d、7 d分别麻醉处死3只小鼠,处死后采集鼻甲、气管、肺组织,一半研磨匀浆后进行病毒的分离培养;另一半放入10%福尔马林中固定,用于HE染色及免疫组化染色。4.禽流感病毒在人肺组织的复制:收集病人的呼吸道手术切除标本,将标本切成小组织块后体外接种病毒。接种后12 h、24 h、36 h、48 h、72h分别收集组织培养液和2块组织块,一块组织块磨匀浆后进行病毒的分离培养;另一块放入10%福尔马林中固定,用于HE染色及免疫组化染色。结果:1.禽流感病毒扩增后的HA效价及EID、TCID检测结果:3株病毒扩增后,KM1135病毒株的HA效价、EID值、TCID值最高,病毒的感染能力和致病性最强;GY6952病毒株的HA效价、EID值、TCID值最低,病毒的感染能力和致病性最弱。2.基因测序和进化分析结果:3株病毒HA裂解位点序列均为PQIETR/GL,为单个碱性氨基酸裂解位点,符合低致病性禽流感病毒特征。3株病毒的HA除发生H156K突变以外,其余224、226、228、190、137等关键氨基酸位点均未发生突变,仍具有与禽型SAα-2,3Gal受体结合的特性。病毒NA、PB1、PB2、PA的多个关键氨基酸位点也未发生突变,病毒仍属于禽流感病毒的基因特点。3.禽流感病毒感染BALB/c小鼠实验结果:在小鼠体内感染实验中,3株病毒感染后小鼠未出现明显的症状,感染过程未出现小鼠死亡情况。KM1135和GY1774病毒株接种小鼠后,小鼠咽拭子标本、鼻甲、气管、肺组织研磨液标本病毒分离培养阳性,组织病理学检查显示小鼠鼻甲、气管、肺组织出现炎症反应,组织内流感病毒NP抗原检测阳性,以KM1135最为典型。GY6952病毒株接种小鼠后,肺组织研磨液病毒分离培养阳性,而咽拭子标本、鼻甲、气管组织研磨液标本病毒分离培养为阴性,组织病理学检查显示小鼠肺组织出现炎症反应而鼻甲、气管组织未见明显病理改变,在鼻甲、气管、肺组织内均未检测出流感病毒NP抗原。3株病毒感染后,小鼠血清标本中流感病毒特异性抗体为阳性,且抗体HI滴度随着感染后天数而增高。4.禽流感病毒在人肺组织的复制实验结果:在人呼吸道组织体外感染实验中,KM1135病毒株感染后的人支气管、肺组织培养液、研磨液标本病毒分离培养阳性,组织病理学检查显示人支气管、肺组织均出现炎症反应,肺泡组织内流感病毒NP抗原检测阳性,而支气管组织内流感病毒NP抗原检测阴性。GY1774病毒株感染后的人支气管、肺组织培养液、研磨液标本病毒分离培养阳性,组织病理学检查显示人支气管、肺组织出现炎症反应,支气管和肺泡组织内流感病毒NP抗原检测阳性。GY6952病毒株感染后的人支气管、肺组织培养液、研磨液标本病毒分离培养阳性;组织病理学检查显示人支气管、肺组织出现炎症反应,肺泡组织内流

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人体EV71病毒受体分布特点及EV71感染重症婴幼儿的病理变化

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作者：梁珍丽广西医科大学

学位级别：硕士

1.研究背景及目的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71,EV71)感染可引发婴幼儿手足口病(hand-foot and mouth disease:HFMD),严重者伴有中枢神经系统疾病、心肺衰竭,甚至死亡,成为继脊髓灰质炎病毒后最重要的中枢神经毒性病原体之一。EV71感... 详细信息

1.研究背景及目的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71,EV71)感染可引发婴幼儿手足口病(hand-foot and mouth disease:HFMD),严重者伴有中枢神经系统疾病、心肺衰竭,甚至死亡,成为继脊髓灰质炎病毒后最重要的中枢神经毒性病原体之一。EV71感染已成为全球公共健康的新威胁。因而,深入研究EV71为何引发中枢神经等多器官感染以及引起肺损伤、产生肺病变的机制具有重要意义。本研究首先检测人体EV71病毒受体,探讨人各组织器官EV71受体的分布特点,为EV71病毒直接感染人提供分子学依据;同时,观察和检测EV71感染死亡患儿尸解标本的病理变化和病毒抗原,探究感染EV71重症婴幼儿的病理特点和病毒抗原的分布情况,进而阐明EV71感染多组织器官特别是感染的靶细胞以及EV71引起肺损伤、产生肺病变的可能机制。2.方法2.1应用免疫组化法检测人体各组织器官中EV71病毒受体PSGL-1、 SCARB2的分布情况。2.2采用常规HE染色及普通光学显微镜观察法,对11例EV71感染死亡患儿的组织标本进行病理学观察。2.3应用免疫组织化学法检测和观察EV71感染死亡患儿全身各组织器官病毒抗原的分布。3.结果3.1 EV71病毒受体分布情况中枢神经、呼吸道、消化道均表达PSGL-1、SCARB2受体。PSGL-1在人体中枢神经尤其是脑干组织中呈高密度分布,在呼吸道中主要分布于喉部、气管、支气管、细支气管和肺泡上皮细胞(p<0.05),消化系统中肠道组织的粘膜上皮细胞和腺体细胞也有分布。SCARB2受体也主要分布于中枢神经、呼吸道以及肠道组织中。3.2儿童感染EV71病毒致重症手足口病后各组织器官病理特点中枢神经系统出现以脑干为主的多部位脑炎,表现为脑组织神经元变性、坏死和软化灶形成、噬神经现象、血管套、脑实质内单核巨噬细胞/小胶质细胞弥漫或结节状增生。呼吸系统表现为喉、气管、支气管和细支气管炎症,肺泡间隔增宽伴炎性细胞浸润,肺淤血、肺水肿及肺出血。肠道组织病理学的变化,包括肠壁变薄,肠粘膜充血、糜烂、炎性细胞浸润和粘膜下淋巴滤泡增生。3.3患者各组织器官EV71病毒抗原分布情况中枢神经系统显示神经细胞和胶质细胞阳性,以脑干为甚,其次为大脑和小脑,提示神经细胞和小胶质细胞是其攻击的主要靶细胞。呼吸系统中喉、气管、支气管和细支气管粘膜上皮细胞阳性,部分病例肺泡细胞阳性,提示呼吸道上皮细胞也是EV71攻击的靶细胞。肠道粘膜上皮细胞EV71抗原检测亦呈阳性。4.结论4.1中枢神经、呼吸道和消化道均表达EV71病毒受体PSGL-1和SCARB2,提示中枢神经系统、呼吸系统、消化系统是EV71病毒感染的靶器官。4.2感染EV71重症病例属全身病毒感染性疾病,其主要累及中枢神经系统、呼吸系统和消化系统等。4.3结合EV71病毒受体分布特点、EV71感染死亡患儿的病理变化以及病毒抗原分布特点,感染EV71重症病例属全身病毒感染性疾病,其主要累及中枢神经系统和呼吸系统等,脑干和呼吸道是其攻击的主要靶器官。4.4 EV71引起的肺损伤,除神经源性外,病毒也可从上呼吸道蔓延至肺泡组织或病毒直接感染肺泡细胞所致。

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鸭H6N1亚型禽流感病毒在小鼠、体外猪肺和人肺组织复制能力的研究

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作者：孙增辉广西医科大学

学位级别：硕士

背景和目的:近二十年来,高致病禽流感病毒H5N1、H7N9等频繁从禽类跨物种间屏障直接感染人,对人类健康和公共卫生安全构成巨大威胁。令人担忧的是,2013年5月,我国台湾出现全球首例人类感染H6N1亚型流感病毒。虽然H6N1亚型属低致病性病毒... 详细信息

背景和目的:近二十年来,高致病禽流感病毒H5N1、H7N9等频繁从禽类跨物种间屏障直接感染人,对人类健康和公共卫生安全构成巨大威胁。令人担忧的是,2013年5月,我国台湾出现全球首例人类感染H6N1亚型流感病毒。虽然H6N1亚型属低致病性病毒,但在禽类普遍存在,有演变成新型流感病毒的风险,也可能成为引发新一轮全球流感的元凶,科研工作者除了提防高致病禽流感病毒H5N1、H7N9,也不能忽视低致病禽流感病毒H6N1的潜在威胁。本文在前期研究基础上,探索水禽源性鸭H6N1亚型禽流感病毒是否具有感染哺乳动物及人类的潜能,进一步筛选优势病毒株,为后期研究其在跨种属传播过程中基因特征提供实验基础。实验方法:1.禽流感病毒的扩增及EID5o实验检测对于前期从市场中分离得到的鸭H6N1亚型及已筛选得到的H9N2亚型共5株禽流感病毒进行鸡胚接种法扩增,扩增后的鸡胚尿囊液离心浓缩成病毒液-80℃低温保存待用。将病毒液梯度稀释做EID50(鸡胚半数感染剂量)实验检测,在动物感染实验前确定病毒接种稀释倍数。2.禽流感病毒感染BABL/c小鼠实验用冻存已确定稀释倍数的5株禽流感病毒模拟病毒传播途径,采用滴鼻、滴眼、滴咽途径接种感染6-8周龄的雌性BABL/c小鼠,定期监测其攻毒后一周内体重变化及排毒情况,并剖杀游离脾脏、肺脏、肾脏、脑、鼻甲等组织,每种组织标本分2份,一份研磨取上清液扩增、HA检测,另一份组织固定,HE染色观察组织病理学变化,免疫组化方法定位检测病毒NP蛋白抗原。3.禽流感病毒体外感染猪肺组织实验快速游离猪肺组织,无菌裁剪为小组织块于6孔培养板中,用梯度稀释的病毒液体外感染猪肺组织,定期采样监测培养上清液及组织研磨液中禽流感病毒HA效价,HE染色观察组织病理学变化,免疫组化方法定位检测病毒NP蛋白抗原。4.禽流感病毒体外感染人肺组织实验收集临床手术中获取的新鲜游离人肺组织,用稀释后的禽流感病毒液进行体外感染,定期采样监测培养上清液及组织研磨液中禽流感病毒HA效价,HE染色观察组织病理学变化,免疫组化方法定位检测病毒NP蛋白抗原。实验结果:1.鸭H6N1亚型禽流感病毒感染小鼠情况:攻毒后小鼠活动度差、进食减少、1.周内体重减轻,组织研磨上清液扩增、HA检测阳性,禽流感病毒抗体阳性,HE染色显示攻毒后小鼠肺组织充血、细胞坏死及炎症反应,免疫组化检测细胞内病毒NP抗原阳性。2.鸭H6N1亚型禽流感病毒体外感染猪肺组织情况:组织研磨上清液扩增、HA检测阳性,HE染色显示病毒感染后肺组织出现局部细胞坏死,免疫组化检测细胞内病毒NP抗原阳性。3.鸭H6N1亚型禽流感病毒体外感染人肺组织情况:组织研磨上清液扩增、HA检测阳性,HE染色显示病毒感染后肺组织出现局部细胞坏死,免疫组化检测细胞内病毒NP抗原阳性。研究结论:1.鸭H6N1亚型禽流感病毒具有跨种属间屏障从水禽直接感染哺乳动物BABL/c小鼠、猪及人肺组织的能力,丰富了流感病毒进化演变及跨种属传播的理论。2.DK/GX/767/2010(H6N1)禽流感病毒株较其他4株禽流感病毒感染致病能力较强,可作为研究鸭H6N1亚型禽流感病毒跨种属传播到人的优势病毒株。

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H6N1亚型禽流感病毒在猪和人呼吸道组织复制的研究

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作者：朱银川广西医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:H6N1亚型禽流感病毒在水禽和陆禽中广泛流行并反复传播到哺乳动物,其宿主范围进一步扩大,增加了适应性突变和基因重配的机率,并可能进化演变成感染人并在人群中传播的的新型流感病毒突变株,从而具有引发新一轮流感大爆... 详细信息

研究背景和目的:H6N1亚型禽流感病毒在水禽和陆禽中广泛流行并反复传播到哺乳动物,其宿主范围进一步扩大,增加了适应性突变和基因重配的机率,并可能进化演变成感染人并在人群中传播的的新型流感病毒突变株,从而具有引发新一轮流感大爆发的潜能。更值得注意的是,该病毒的一些关键氨基酸已替换,这可能会增加人型SAα-2,6Gal受体的亲和力并有利于病毒在人复制。因此,我们除了预防高致病禽流感病毒H5N1、H7N9、H5N6之外,也不能忽视低致病性禽流感病毒H6N1亚型的潜在威胁。本文在前期研究的基础上,进一步探索H6N1亚型禽流感病毒是否具有在猪和人呼吸道组织复制的潜能并筛选出其有效复制的基因特点。实验方法:1.禽流感病毒的筛选及扩增将2株水禽鸭源性和3株陆禽鹌鹑源性的H6N1亚型禽流感病毒及课题组前期已筛选得到的1株H9N2亚型禽流感病毒(作阳性对照)进行鸡胚扩增,测定HA滴度,并将收获的尿囊液离心后分装在冻存管中,保存于-80℃超低温冰箱中待用。2.EID和TCID实验检测禽流感病毒将病毒液进行10倍系列等比稀释应用EID(鸡胚半数感染剂量)和TCID(组织细胞半数感染量)实验,在体外感染实验前确定病毒感染接种的稀释度。3.病毒体外感染猪呼吸道组织实验以安乐法处死巴马香猪后,迅速解剖、分离猪呼吸道组织(气管、支气管、肺组织)并切成小组织块,置于6孔细胞培养板中,将稀释的病毒液体外感染猪呼吸道组织,并在感染后各时间点收集组织培养液及组织块。鸡胚和MDCK细胞分离培养上清液及组织研磨液,HA检测鉴定,HE染色观察组织病理学变化以及免疫组化法检测病毒抗原的分布。4.病毒体外感染人呼吸道组织实验收集我校直属医院临床相关手术中切除的新鲜人呼吸道组织(细支气管、肺组织)并切成小组织块,置于6孔细胞培养板中,将稀释的病毒液体外感染人呼吸道组织,并在感染后各时间点收集组织培养液及组织块。鸡胚和MDCK细胞分离培养上清液及组织研磨液,HA检测鉴定,HE染色观察组织病理学变化以及免疫组化法检测病毒抗原的分布。5.病毒基因测序和筛选关键基因标记分别提取5株禽流感病毒的RNA,逆转录合成cDNA,PCR反应扩增,测序反应。用GCG 10.2编辑和处理基因序列,Mega 7.0和Bioedit 7.0.9上进行序列比较和同源性分析。综合猪和人呼吸道体外感染试验和基因测序的实验结果,分析具有在猪和人呼吸道组织复制的病毒各基因片段的变化,最终筛选出病毒在猪和人呼吸道组织复制的基因特点,特别是关键分子标记。实验结果:1.EID和TCID实验检测禽流感病毒情况:应用EID检测5株H6N1亚型禽流感病毒,发现病毒Qa/ST/22124/2005(简称ST22124)的EID值最高,毒力最强;病毒Qa/ST/238/2000(简称ST238)和DK/JX/35634/2016(简称JX35634)的EID值最低,毒力最弱。同时,应用TCID实验检测5株H6N1亚型禽流感病毒,发现病毒ST22124的TCID值最高,毒力最强;病毒JX35634的TCID值最低,毒力最弱。2.禽流感病毒H6N1在体外猪呼吸道组织的复制:鸡胚分离培养组织培养液和组织研磨上清液中病毒,培养液中HA滴度均大于256,且感染前后会出现滴度变化,其中以Qa/ST/3329/2001(简称ST3329)和ST22124两株病毒感染后产生的HA滴度较高。而在MDCK细胞分离培养中,HA滴度小于128或阴性。HE染色显示病毒感染气管和肺组织后均出现不同程度的组织结构破坏,气管黏膜上皮脱落坏死,肺泡细胞坏死。免疫组化检测显示肺组织部分和肺巨噬细胞内病毒NP抗原阳性,而气管和支气管仅出现个别细胞内病毒NP抗原阳性。其中ST3329和ST22124病毒株感染肺组织后,病毒NP抗原在细胞表达较多。3.禽流感病毒H6N1在体外人呼吸道组织的复制:鸡胚分离培养组织培养液和组织研磨上清液中病毒,培养液中HA滴度均大于256,且感染前后也出现滴度变化,其中以ST22124和ST3329两株病毒感染后产生的HA滴度较高。而在MDCK细胞分离培养中,HA滴度小于128或阴性。HE染色显示病毒感染支气管和肺组织后均出现不同程度的组织结构破坏、肺泡上皮细胞坏死和少量炎性细胞浸润。免疫组化检测显示肺组织部分肺泡细胞和巨噬细胞内病毒NP抗原阳性,而在细支气管中,病毒NP抗原仅出现少量阳性。其中ST22124和ST3329两株病毒感染肺组织后,其病毒NP抗原在细胞表达较多。4.禽流感病毒H6N1在猪和人复制的基因特点:HA基因氨基酸序列分析结果,5株H6N1病毒的HA裂解位点序列均为PQIETG/GL,仅有单个碱性氨基酸,表现为低致病性禽流感病毒的分子特征。陆禽鹌鹑Qa/ST/3329/2001(简称ST3329)和ST22124的HA出现P186S、S158T,而ST238仅出现S158T,JX35634仅出现S158T,结合ST

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鸭源H9N2亚型禽流感病毒对小鼠致病性以及在人呼吸道组织复制的研究

鸭源H9N2亚型禽流感病毒对小鼠致病性以及在人呼吸道组织复制的研...

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作者：钟芝兰广西医科大学

学位级别：硕士

背景和目的:H9N2亚型禽流感病毒在欧亚特别我国禽类普遍存在,该病毒虽属低致病性,但可以直接感染人,还可作为“孵化器”,容易与其它甲型流感病毒亚型发生基因重配,形成传播人类的禽流感病毒H5N1、H7N9、H5N6和H10N8。因此,H9N2病毒可能... 详细信息

背景和目的:H9N2亚型禽流感病毒在欧亚特别我国禽类普遍存在,该病毒虽属低致病性,但可以直接感染人,还可作为“孵化器”,容易与其它甲型流感病毒亚型发生基因重配,形成传播人类的禽流感病毒H5N1、H7N9、H5N6和H10N8。因此,H9N2病毒可能成为引发新一轮全球流感的罪魁祸首,研究人员除了提防高致病性禽流感病毒H5N1、H7N9,也要对低致病性禽流感病毒H9N2的潜在巨大威胁引起足够重视。鸭属“半陆禽”动物,其在H9N2病毒从水禽动物传播至陆禽、哺乳动物中起非常重要作用。本项目应用鸭源禽流感病毒H9N2亚型体内感染昆明小鼠,体外感染正常人呼吸道组织,观察病毒是否对小鼠产生致病性以及在人呼吸道组织中有效复制,探索H9N2亚型禽流感病毒跨种属直接从水禽感染人的潜能。研究方法:1.本实验选择了2株水禽鸭源H9N2亚型禽流感病毒DK/GX/527/2012(简称GX527)、DK/GX/4095/2012(简称GX4095)作为实验病毒株,同时选陆禽鹌鹑QA/GX/3139/2012(简称GX3139)作为阳性对照。将病毒接种到10 d鸡胚进行扩增,培养48 h后收集尿囊液测定病毒效价。2.TCID检测:测定病毒TCID值,以明确本次研究中体内实验和体外实验所需要的病毒稀释度。3.H9N2亚型流感病毒感染昆明小鼠:通过鼻腔内、眼睛途径接种KM(Kunming mice,KM小鼠),实验组和阳性对照组每组12只KM小鼠,每只小鼠接种200μl病毒稀释液,空白对照组8只小鼠分别接种接200μl PBS,接种后每天记录小鼠的身体状况,第1、3、5、7 d分别采集所有实验小鼠咽部拭子,第3、5、7 d分别选择了实验组和阳性对照组各3只小鼠、空白对照组2只小鼠,乙醚麻醉后用眼球采血法采血,再用颈椎脱臼法处死。小鼠处死后无菌采集气管和肺组织,每份标本分成两份,一份浸泡于10%福尔马林溶液中进行固定,用于免疫组化检测病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP)抗原以及作苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色观察组织是否发生病理变化,另一份用研磨棒直接研磨后加入采样液,保存于-80℃冰箱以备分离病毒。第14 d剩余小鼠全部采集血样并处死,采集的血液4℃静置12 h后3000 rpm离心10 min,收集血清。4.H9N2亚型流感病毒在体外正常人呼吸道组织的复制:取新鲜手术后人肺部及支气管组织,将病毒稀释液接种人呼吸道组织,分别于接种后12 h,24 h,36 h,48 h和72 h 5个时间点取组织培养液和组织块,每个时间点收取接种病毒后组织2块,其中一块进行研磨后加入病毒保存液,置于-80°C冰箱冻存,使用前离心取上清。另一组织块浸泡于10%福尔马林中,进行固定24 h以上用作后期病毒核蛋白NP抗原的检测和HE染色观察组织是否发生病理变化。5.流感病毒的分离:将小鼠咽拭子、小鼠组织研磨液、组织培养液以及人呼吸道组织研磨液均分为两份,一份接种10 d鸡胚,培养48 h后收集鸡胚尿囊液,采用病毒血凝素试验(HA试验)检测病毒滴度;另一份接种于MDCK细胞,培养72 h后,取细胞培养液离心后作HA试验,检测细胞培养液中病毒滴度。6.红血球凝集抑制试验检测小鼠血清抗体效价:分别于小鼠接种病毒后第3、5、7、14 d,将小鼠用乙醚浅麻醉,摘掉小鼠眼球取全部血样,离心取上层血清,应用红血球凝集抑制试验检测小鼠血清抗体效价。7.免疫组化染色测组织病毒NP抗原:将10%福尔马林固定后的小鼠标本制作组织切片,作免疫组化染色,显微镜下观察病毒NP抗原表达情况。8.HE染色观察感染病毒后组织的病理变化:上述10%福尔马林固定的小鼠呼吸道组织、人呼吸道组织,石蜡包埋、切片,HE染色,在显微镜下观察组织是否发生病理变化。结果:1.昆明小鼠体内感染实验中,GX4095亚型禽流感病毒株可感染昆明小鼠,使小鼠出现食欲减退、体重不增、背毛杂乱等症状。小鼠呼吸道肺和气管标本研磨液接种鸡胚,病毒分离培养呈阳性;免疫组化显示小鼠呼吸道肺组织、支气管及气管上皮细胞内病毒NP抗原阳性;HE染色显示病毒攻毒后小鼠气管出现上皮细胞脱落、管腔内炎症细胞浸润,肺组织和支气管出现白细胞增多等炎症反应。GX527亚型禽流感病毒株感染小鼠后,接种鸡胚和MDCK细胞的样本病毒分离培养结果全部为阴性;免疫组化检测肺组织、支气管和气管上皮细胞内NP抗原均呈阴性;HE染色显示小鼠攻毒后气管和支气管无明显病变,肺组织出现轻度炎症反应改变。HI实验检测攻毒3d、5 d、7 d和14 d的小鼠血样,2株病毒感染的所有昆明小鼠血清样本抗体全部阳性。2.体外正常人呼吸道组织病毒复制实验中,GX527、GX4095亚型病毒株感染后的组织培养液和组织研磨液样本经鸡胚接种后病毒分离检测均呈阳性;免疫组化显示肺组织细胞内病毒NP抗原阳性;HE染色显示2株病毒感染后人肺组织出现局部炎细胞反应

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具有结合人型受体能力的禽流感病毒在人呼吸道复制以及诱导NLRP3炎症小体激活的初步研究

具有结合人型受体能力的禽流感病毒在人呼吸道复制以及诱导NLRP3...

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作者：林裕贵广西医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:H5、H6、H7、H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在水禽和陆禽中广泛流行和进化,部分病毒株甚至具有了识别和结合人型受体唾液酸(Sialic acid,SA)α-2,6半乳糖苷(Galactose,Gal)的能力,有进化演变成为感染人... 详细信息

研究背景和目的:H5、H6、H7、H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在水禽和陆禽中广泛流行和进化,部分病毒株甚至具有了识别和结合人型受体唾液酸(Sialic acid,SA)α-2,6半乳糖苷(Galactose,Gal)的能力,有进化演变成为感染人的可能。研究表明,禽流感病毒要实现有效感染人类,引起人际传播甚至大流行,病毒首先必须具备有与人型受体识别和结合的能力。炎症小体可以介导炎性细胞因子白细胞介素1β(Interleukin-1,IL-1β)和白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)的分泌,诱导固有免疫和适应性免疫,在机体的免疫炎症反应中具有重要作用。流感病毒感染可以激活多种炎症小体,具有抗病毒作用,同时,炎症小体又是诱发“细胞因子风暴”、引起免疫炎症损伤的重要原因。与其它炎症小体不同,含PYRIN结构域NLR家族蛋白3(NLR family pyrin domain–containing protein 3,NLRP3)炎症小体可被多种刺激所激活,包括病原体感染和内源性危险信号分子,被认为是多种炎症反应的活化中心,但流感病毒感染人呼吸道是否能激活NLRP3炎症小体尚未清楚。因此,本研究首先筛选具有结合人型受体能力的禽流感病毒,然后接种于原代人肺组织和人支气管组织以及人肺上皮细胞来源的传代细胞A549、人支气管上皮细胞来源的传代细胞BEAS-2B,观察该类病毒在人呼吸道的复制能力,最后检测该类病毒与人流感病毒在体外人呼吸道组织诱导的NLRP3炎症小体成分NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)及下游通路蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)、Gasdermin D(GSDMD)、IL-1β和IL-18的表达,初步探讨流感病毒诱导人呼吸道组织NLRP3炎症小体的激活。方法:1.实验毒株的选择和扩增:选择5株禽源流感病毒H9N2亚型禽流感病毒A/CK/GX/1875/2004(GX1875)、A/DK/ST/3208/2012(ST3208),H6N6亚型禽流感病毒A/CK/ZZ/346/2014(ZZ346)、A/CK/ZZ/1923/2015(ZZ1923)、A/CK/JX/20490/2014(JX20490)作为实验毒株。选择前期已证实结合人型受体的人流感病毒临床分离株H3N2亚型A/ST/602/2006(ST602)作为结合SAα-2,6Gal受体和体外感染实验阳性对照毒株,结合禽型受体的禽流感病毒H9N2亚型A/DK/GX/767/2010(GX767)作为结合SAα-2,3Gal受体阳性对照毒株。禽流感病毒在10天的鸡胚培养,人流感病毒在犬肾细胞来源的传代细胞MDCK培养。血凝素(Hemagglutination,HA)试验检测病毒HA滴度,组织细胞半数感染量(50%tissue culture infective dose,TCID)试验、空斑形成单位(Plaque forming units,PFU)试验确定后续感染实验的病毒感染量。2.病毒受体结合特性检测:使用α2,3-Sialidase酶特异性切除火鸡红细胞上的SAα-2,3Gal受体,保留下SAα-2,6Gal受体,通过酶切前后的病毒HA滴度变化筛选出具有结合人型受体能力的禽流感病毒株。3.病毒在A549细胞、BEAS-2B细胞的复制能力检测:选用具有结合人型受体能力的禽流感病毒感染A549细胞、BEAS-2B细胞,通过检测不同时间点的培养上清液HA滴度、细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)评价病毒复制能力。4.病毒在体外人呼吸道组织的复制能力检测:病毒体外接种人肺组织和人支气管组织,TCID试验检测不同时间点组织匀浆的病毒滴度,免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)检测细胞内病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP)抗原的表达。5.呼吸道组织NLRP3炎症小体及下游通路蛋白检测:免疫组化检测病毒感染人肺组织、人支气管组织后NLRP3炎症小体成分NLRP3、ASC以及下游通路蛋白Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的表达,酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测组织匀浆中IL-1β、IL-18含量变化。结果:1.受体结合特性检测结果:实验组毒株GX1875和ZZ346具有同时结合禽型受体SAα-2,3Gal和人型受体SAα-2,6Gal的能力,但以结合SAα-2,3Gal受体为主。而ST3208、ZZ1923、JX20490仅与禽型受体SAα

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鸭H9N2亚型禽流感病毒在鹧鸪和鸡体内复制能力的比较

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作者：张彬广西医科大学

学位级别：硕士

1.研究背景和目的近十余年来,禽流感病毒H5N1、H7N9等频繁从禽类跨越物种间屏障直接感染人,对人类健康和公共卫生安全构成巨大威胁。研究表明,甲型流感病毒均来自水禽类,陆地禽类在流感病毒生态系统中可能起到中间宿主的作用。流感病毒... 详细信息

1.研究背景和目的近十余年来,禽流感病毒H5N1、H7N9等频繁从禽类跨越物种间屏障直接感染人,对人类健康和公共卫生安全构成巨大威胁。研究表明,甲型流感病毒均来自水禽类,陆地禽类在流感病毒生态系统中可能起到中间宿主的作用。流感病毒从水禽传递到陆禽后,在新宿主(陆禽)体内,病毒基因发生适应改变、形成稳定谱系甚至流行。同时,陆禽流感病毒受体分布特点与人的分布特点相似,此时在陆禽宿主已发生适应性进化的禽流感病毒具备了感染人的潜能。H9N2禽流感病毒已经成为中国家禽分布最广泛的禽流感亚型,同时H9N2亚型病毒在新型禽流感病毒的形成过程中扮演了关键角色,其传播路线具有代表性和实际意义。本文在前期研究的基础上比较水源性禽流感病毒H9N2在陆地禽类鹧鸪、鸡体内的复制能力,旨在探索陆地禽类在流感病毒变异演变特别是主要进化和传播方向上所起的作用,以及为进一步筛选新的中间宿主提供实验基础。2.实验方法2.1动物感染实验：采用流感病毒动物接种法,通过滴鼻、滴眼、滴咽等途径接种病毒。2.2流感病毒的分离和鉴定：根据前期预实验结果,选择采集实验动物第三、五、七天的咽拭子和肛拭子标本,接种鸡胚,收取鸡胚尿囊液并利用血凝试验检测尿囊液中病毒含量来确定实验动物排毒情况。2.3 TCID50实验：TCID50实验是一种病毒毒力检测方法。将收集到的实验动物咽拭和肛拭子标本接种细胞,通过镜下观察细胞病变情况和病毒毒力检测,判断标本是否有病毒。2.4感染病毒的病理变化：处死上述感染实验所用的动物,取气管、支气管、肺等组织,加10%福尔马林固定24h。组织脱水、包埋、切片,脱蜡至水,HE染色,显微镜下观察结果。2.5免疫组化实验检测病毒抗原：组织切片中流感病毒NP抗原的检测,需要免疫组化法,将上述组织切片脱蜡至水,抗原修复,血清保护,抗原抗体结合,标记流感病毒抗原,显微镜下观察结果。3结果：3.1水禽鸭H9N2亚型禽流感病毒DK/ST/3208/2012可在陆禽鹧鸪呼吸道复制,但未能在陆禽鸡体内复制。3.2陆禽鹌鹑H9N2亚型禽流感病毒QA/GX/3139/2012可在陆禽鹧鸪呼吸道复制,但未能在陆禽鸡体内复制。3.3鸭H9N2亚型禽流感病毒DK/ST/3208/2012和陆禽鹌鹑H9N2亚型禽流感病毒QA/GX/3139/2012体内接种鹧鸪后可引起气管、支气管和肺部炎症反应等病理变化。4.结论：4.1水禽鸭H9N2亚型禽流感病毒可在陆禽鹧鸪复制并引起明显炎症反应,表明鹧鸪易于感染水禽源性禽流感病毒,提示鹧鸪在流感病毒生态系统中起中间宿主作用。4.2陆禽鹌鹑H9N2亚型禽流感病毒可在鹧鸪复制并引起明显炎症反应,表明鹌鹑H9N2亚型禽流感病毒易于传播到鹧鸪,提示鹧鸪可能有助于病毒进化和变异演变,形成感染哺乳动物和人的潜能。4.3鹧鸪呼吸道是H9N2亚型禽流感病毒复制的主要部位。

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H6N2亚型禽流感病毒感染小鼠及在人呼吸道组织复制特征的研究

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作者：庞夏凤广西医科大学

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背景和目的:近年来研究表明,H6亚型禽流感病毒在家禽中广泛流行并传播到哺乳动物,甚至偶尔感染人。研究表明,H6、H5、H9在家禽中共流行时,病毒可能在宿主感染过程中发生基因重配进而使病毒的某些基因特性发生改变。其中关键位点的改变... 详细信息

背景和目的:近年来研究表明,H6亚型禽流感病毒在家禽中广泛流行并传播到哺乳动物,甚至偶尔感染人。研究表明,H6、H5、H9在家禽中共流行时,病毒可能在宿主感染过程中发生基因重配进而使病毒的某些基因特性发生改变。其中关键位点的改变促进病毒感染机制进化,导致病毒进而扩大宿主范围、增加与人型SAα-2,6Gal受体结合的几率。目前,H6N2亚型AIV的进化演变、跨种属传播及其基因特征尚未研究清楚。前期我们课题组已开展H6N1、H6N6亚型AIV体内外感染哺乳动物的研究,为进一步研究探索H6亚型AIV发生变异及跨种属传播的机制,本文将分离自水禽鸭的3株H6N2亚型禽流感病毒体内感染BALB/c小鼠、体外感染人呼吸道组织,评估其对小鼠致病性及在人呼吸道组织的复制能力并综合基因测序结果分析筛选出水禽H6N2亚型禽流感病毒感染哺乳动物小鼠和人的相关基因特征。实验方法:1.实验毒株的筛选和扩增:选择前期在广西分离的三株H6N2鸭源性禽流感病毒A/DK/GX/141/2005、A/DK/GX/3101/2018、A/DK/GX/5220/2018为实验病毒株,1株H9N2病毒A/DK/ST/3208/2010为阳性对照病毒株。4株病毒株在10 d龄鸡胚中扩增48 h,收获尿囊液测定HA值,病毒液分装、冻存于-80℃待用。2.测定病毒EID、TCID值并确定病毒感染量:将待测病毒按要求与对倍稀释后接种于鸡胚测定EID50(鸡胚半数感染剂量)和接种于MDCK测定TCID50(组织细胞半数感染量),根据计算结果评估接种感染小鼠体内和人呼吸道组织体外实验的病毒量。3.H6N2亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠:BALB/c小鼠随机分组,分组包括:实验组、阳性对照组和空白对照组。通过滴鼻和滴眼的途径接种6-8周BALB/c小鼠,每日观察、记录症状体征,第3、5、7 d采集咽拭、每组3只麻醉采血后安乐处死,采集气管及肺组织,各组织分为2份,一份标本研磨冻存,另一份标本置于10%福尔马林固定24 h,第14 d各组最后3只小鼠麻醉采集血液后安乐处死。4.H6N2亚型禽流感病毒在人呼吸道组织复制实验:收集本校附属医院手术切除的人肺组织标本,分离支气管和肺组织,并切成小组织块,放入F-12K培养基中洗净,接种病毒液后12、24、36、48、72 h时间点分别收集组织培养上清液及组织块。5.感染后病毒的分离与血清抗体的检测:组织标本研磨后取上清液和病毒培养液标本分别接种于鸡胚和MDCK,培养48 h,HA测定病毒滴度。BALB/c小鼠血液自然凝集后收集血清,HI实验检测病毒抗体滴度。6.组织切片病理学观察和检测病毒抗原:组织标本脱水后用石蜡包埋制作成石蜡切片,用(Hematoxylin-eosin staining HE)染色观察组织标本病理变化,免疫组化实验检测组织细胞病毒抗原表达。7.病毒基因测序和分析:提取病毒RNA后反转录并进行PCR扩增,测出病毒全基因序列后用GCG 10.2编辑处理基因序列,Mega 7.0和Bioedit 7.0.9上进行序列比较。综合小鼠体内及人呼吸道组织体外感染结果,分析筛选出H6N2亚型流感病毒感染BALB/c小鼠、在人呼吸道组织复制的基因特点。实验结果:1.H6N2毒株EID、TCID值测定结果:3株H6N2病毒接种鸡胚中测定EID50值,测定结果显示GX141毒株能导致半数鸡胚感染对应的稀释度较其它两株病毒高,病毒感染能力较强,而GX3101和GX5220感染能力稍弱。在MDCK细胞中检测TCID50显示,GX141毒株能导致半数MDCK细胞感染对应的稀释度较其它两组高,感染能力最强,GX5220其次,而GX3101半数组织细胞感染能力最低。2.H6N2毒株对BALB/c小鼠致病力:3株病毒接种小鼠后肺组织研磨液在鸡胚中都检测出阳性结果但滴度尚无明显差异,其中GX3101和GX5220滴度为1:1024,GX141滴度为1:512。但在MDCK中培养只有GX141组检测出了阳性,滴度为1:16。气管组织只有GX141组在鸡胚和MDCK细胞中检测阳性。显微镜下观察组织病理变化,GX141和GX3101病毒感染小鼠肺组织均出现炎症细胞浸润、肺泡腔结构完整性破坏;GX141病毒感染小鼠气管组织气管黏膜细胞脱落伴炎症细胞浸润等不同程度的炎症反应。IHC显示GX141和GX3101毒株感染小鼠的肺组织细胞出现病毒NP蛋白阳性表达,GX5220则是阴性。气管组织IHC结果显示,只有GX141组气管粘膜上皮细胞出现病毒NP蛋白阳性表达。3.H6N2毒株在人体外呼吸道组织的复制:3株病毒接种体外培养肺和支气管组织,其研磨液在鸡胚和MDCK细胞中都检测出阳性结果,各组在鸡胚和细胞中培养HA滴度无明显差异。组织病理观察结显示GX141和GX3101组病毒感染小鼠肺组织出现肺泡结构破坏而GX141组支气管黏膜细胞脱落伴炎症细胞浸润等不同程度

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鸡源禽流感病毒H6N6亚型对小鼠致病性以及在猪和人呼吸道组织复制的研究

鸡源禽流感病毒H6N6亚型对小鼠致病性以及在猪和人呼吸道组织复制...

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作者：王熹婧广西医科大学

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背景和目的:H6N6亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在欧亚大陆野生鸟类和家禽广泛流行,其宿主范围逐渐扩大至哺乳动物猪,部分病毒株甚至获得识别与结合人型的能力,有进化演变成为直接感染人的潜能,对人类健康和公共卫生安全构... 详细信息

背景和目的:H6N6亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在欧亚大陆野生鸟类和家禽广泛流行,其宿主范围逐渐扩大至哺乳动物猪,部分病毒株甚至获得识别与结合人型的能力,有进化演变成为直接感染人的潜能,对人类健康和公共卫生安全构成潜在威胁,但到目前为止,H6N6亚型禽流感病毒如何跨种间屏障传播哺乳动物和人仍未清楚。本项目应用鸡源禽流感病毒H6N6亚型体内感染小鼠,体外感染猪和人呼吸道组织,观察病毒对小鼠的致病性、在猪和人呼吸道组织复制及其病理变化,同时应用基因测序法,比较H6N6病毒各基因片段的变化,筛选H6N6病毒感染小鼠、在猪和人复制的基因特征,为揭示H6N6亚型禽流感病毒跨种属感染人的潜能及其有利于病毒在人复制的关键分子标记奠定基础。方法:1.流感病毒的扩增及EIDTCID检测:将选定待用3株陆禽鸡H6N6亚型禽流感病毒:A/CK/ZZ/346/2014(简称ZZ346);A/CK/JX/20490/2014(简称JX20490);A/CK/ZZ/1923/2015(简称ZZ1923),接种鸡胚扩增,培养48h后收获鸡胚尿囊液。测定EID、TCID值以明确BALB/c小鼠体内感染和体外感染猪和人组织所使用的病毒稀释度。2.H6N6病毒体内感染BALB/c小鼠:通过鼻腔内、眼睛途径接种小鼠,接种后每天记录症状和体重,1、3、5、7d分别采集咽拭子,3、5、7d分别安乐处死3只攻毒小鼠,取其肺和气管,一半用于研磨检测病毒滴度,另一半经10%福尔马林固定后,用作HE染色和免疫组化,接种后14d采集其血样,用于检测血清抗体。3.H6N6病毒在体外猪呼吸道组织的复制:取新鲜猪呼吸道组织,将病毒稀释液加入猪呼吸道组织,定时采样取组织培养上清液及组织块用于后期流感病毒的分离与鉴定,另取完整组织块经10%福尔马林固定后,用于HE染色和免疫组化检测病毒抗原。4.H6N6病毒在体外人呼吸道组织的复制:取新鲜人呼吸道组织,将病毒稀释液加入人呼吸道组织,定时采样取培养上清液及组织块用于后期流感病毒的分离与鉴定,另取完整组织块经10%福尔马林固定后,用于HE染色和免疫组化检测病毒抗原。5.流感病毒的分离:将前期实验采集用于分离培养的标本均分两份,一份接种鸡胚,培养48h后收取鸡胚尿囊液,HA试验检测尿囊液中病毒滴度;另一份接种于MDCK细胞,培养72h后收取细胞培养液,HA试验检测细胞液中病毒滴度。6.HI试验检测感染动物血清抗体:小鼠感染后14d,采用眼球采血方法取适量血样,离心取上层血清,应用HI试验检测血清抗体。7.HE染色观察动物、组织感染病毒的病理变化:取上述麻醉安乐处死小鼠的呼吸道组织、体外感染猪和人呼吸道组织,组织固定、切片,常规HE染色,光学显微镜下观察病理变化。8.免疫组化检测病毒抗原:取上述安乐处死小鼠的呼吸道组织、体外感染猪和人呼吸道组织,组织固定、切片,免疫组化染色检测病毒抗原。9.基因测序和筛选关键基因标记:提取病毒RNA,PCR反应扩增,纯化产物,采用Illumina的Solexa系统上机测序病毒全基因,使用全球共享流感数据库(Global initiative on sharing all influenza data,GISAID)准备相关病毒数据,用Bioedit进行序列比较和同源性分析H6N6亚型AIV基因片段的变化,筛选对小鼠致病性以及在猪和人呼吸道组织复制的基因特点。结果:1.小鼠感染实验中,ZZ346病毒株可在小鼠体内有效复制,呼吸道组织研磨液接种鸡胚和MDCK细胞后,病毒分离培养呈阳性;HE染色显示攻毒后小鼠气管中有细胞坏死脱落,肺组织出现炎症反应等现象;免疫组化显示呼吸道气管至肺泡组织细胞内病毒NP抗原阳性。JX20490病毒株感染小鼠后,呼吸道组织研磨液接种鸡胚和MDCK细胞,病毒分离培养结果呈阴性;HE染色显示小鼠攻毒后气上皮细胞坏死脱落,但是肺组织未见明显病理改变;免疫组化显示气管上皮细胞内病毒NP抗原阳性,而肺组织NP抗原阴性。然而,ZZ1923病毒株各项检测均为阴性。攻毒14d的小鼠血样,经HI实验检测,3株病毒的所有小鼠血清样本中均呈抗体阳性。2.流感病毒在猪体外呼吸道复制中,3株鸡H6N6亚型AIV感染后的组织样本,经鸡胚接种后病毒分离检测呈阳性,HE染色显示感染后出现肺局部细胞坏死,免疫组化显示肺泡细胞内病毒NP抗原阳性。3.流感病毒在人体外呼吸道复制中,3株鸡H6N6亚型AIV感染后的组织样本,经鸡胚接种后病毒分离检测呈阳性。ZZ346病毒株感染后的肺组织切片,HE染色显示感染后均出现局部细胞坏死,免疫组化显示细胞内病毒NP抗原阳性,而接种JX20490、ZZ1923病毒株的肺组织切片未出现明显病理改变、未检测出病毒NP抗原。4.基因测序分析,3株鸡H6N6亚型AIV的HA裂解位点模式均为PQIETG/GL,显示单个碱性氨基酸切割位点的特征,属低致病性病

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