检索结果-南通市图书馆

作者：尤佳甘肃农业大学

学位级别：硕士

科罗拉多马铃薯甲虫(Coloradopotatobeetle，CPB)简称科罗拉多甲虫，或马铃薯叶甲，是国际公认的毁灭性检疫害虫，也是我国对外重大检疫对象和重要外来入侵物种之一。截至现在，马铃薯甲虫分布扩展我国新疆北部26万平方千米的区域，我... 详细信息

科罗拉多马铃薯甲虫(Coloradopotatobeetle，CPB)简称科罗拉多甲虫，或马铃薯叶甲，是国际公认的毁灭性检疫害虫，也是我国对外重大检疫对象和重要外来入侵物种之一。截至现在，马铃薯甲虫分布扩展我国新疆北部26万平方千米的区域，我国是马铃薯生产大国，有效控制马铃薯甲虫危害，延缓和阻止其传播，对于确保我国马铃薯生产安全和持续发展具有重大意义。利用基因工程手段培育抗虫品种为害虫防治开辟了新路径。目前，转Bt基因抗虫植物在生产上已经展现出了良好的应用前景，但昆虫对转Bt杀虫晶体蛋白产生抗性的问题日趋严峻。本研究构建了组成型启动子CaMV35S和马铃薯茎叶特异表达启动子ST-LS1驱动的CryIIIA基因植物表达载体，转化马铃薯栽培品种获得了转基因植株，为培育抗甲虫转基因马铃薯新品系奠定了基础。取得的主要研究结果如下：1.利用In-Fusion技术将酶切位点不匹配、目的基因内部含载体酶切位点的CryⅢA基因和植物表达载体pBI121相连接，分别构建了组成型启动子CaMV35S和马铃薯茎叶特异表达启动子ST-LS1驱动的CryⅢA基因植物表达载体。2.利用冻融法将两个重组质粒转入根癌农杆菌LBA4404，转化马铃薯栽培品种陇薯3号和甘农薯2号获得了转化植株，经卡那霉素筛选和PCR检测初步证明CryⅢA基因已成功整合到马铃薯基因组中。3.实时荧光定量PCR检测表明，分别有5株转基因马铃薯植株有典型的荧光扩增曲线;且其Ct值都小于40，而非转基因植株和空白对照其荧光扩增曲线都呈现平直，且都位于阈值线之下。CryⅢA基因在CaMV35S驱动的CryⅢA转基因植株的根、茎、叶中均有表达，且在叶中表达量较高，茎和根次之;在马铃薯茎叶特异表达启动子ST-LS1驱动的CryⅢA转基因植株中，在根中未见表达，仅在茎、叶中表达，且在叶中表达量较高，实现了对目的基因的表达调控。

关键词： In-Fusion CryⅢA基因表达载体马铃薯遗传转化

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甘肃省当归资源的RAPD分析

甘肃省当归资源的RAPD分析

作者：盛丽甘肃农业大学

学位级别：硕士

采用RAPD 分子标记技术对甘肃省不同产区所栽培的20 份当归材料进行了多态性分析和聚类比较,从而为我省当归资源的分析收集、起源演化、分类研究、多样性保护、遗传图谱构建、基因定位,进而为药用植物资源的育种工作提供技术保障及分子... 详细信息

采用RAPD 分子标记技术对甘肃省不同产区所栽培的20 份当归材料进行了多态性分析和聚类比较,从而为我省当归资源的分析收集、起源演化、分类研究、多样性保护、遗传图谱构建、基因定位,进而为药用植物资源的育种工作提供技术保障及分子生物学依据。主要研究结果如下: 1.实验对反应体系中5 个重要因子进行了正交试验,筛选出最优的反应体系,并在此最优体系的基础上,分别对退火温度、扩增循环数进行了单因素试验,得到了RAPD反应合理的热力学参数,确定了一套优化的当归RAPD反应体系和PCR 扩增条件,即模板DNA 0.5 ng/μl,随机引物0.8 μmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,MgCl2 2.5 mmol/L,Taq 酶0.8 U。其热循环参数为:94 ℃预变性3 min,之后进行40 个循环(94 ℃30s,36 ℃60s,72 ℃90s),最后72℃延伸5 min后在4 ℃终止反应。2.从40 条随机引物中筛选出了7 条具有多态性且重复性好的引物对甘肃省20 个不同产区的当归试样进行RAPD标记研究,共扩增出82 个条带,其中多态性条带58 个,占总扩增条带数的70.7%,每个引物可扩增出5～11 条多态性带,平均8.3 条。Jaccard 相似系数矩阵测度值为0.375～1.000,其数值越大表示遗传距离越近。聚类分析结果中,供试品种被聚为5 类,渭源县会川镇、渭源县上湾乡、渭源县会川镇小寨村和岷县麻子川乡当归聚为第一类;陇南宕昌产当归、临夏康乐县当归与岷县寺沟乡、岷县十里镇当归聚为第二类;第三类为漳县当归;第四类仅为渭源县会川镇本庙村当归;岷县城郊乡当归也独自聚为第五类。从树状图中可以直观地看出绝大多数地理分布距离越近的样品,在聚类树状图上的距离较近,说明它们之间的遗传背景差异越小,反之越大。但生态条件特别是小生境对当归遗传差异的影响亦不可忽视。当归RAPD多态性的聚类分析结果与甘肃省当归主要产区的地理分布比较吻合,同一地理分布范围内,产地生态环境条件不同,当归的遗传背景也存在不同程度的差异。

关键词：当归 RAPD 遗传多样性相似系数矩阵聚类分析

马铃薯ACO和ACS基因过表达与RNAi载体的构建及遗传转化

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马铃薯ACO和ACS基因过表达与RNAi载体的构建及遗传转化

作者：刘英甘肃农业大学

学位级别：硕士

ACC合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxlic acid synthase，1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶，ACS）在乙烯合成过程中催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adometsynthetase，SAMS）合成ACC，是乙烯合成过程中的限速酶。ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxlic acid oxidase，1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，ACO）催化ACC形成乙烯，因此又称为乙烯形成酶（ethylene-forming enzyme,EFE），两种酶在乙烯形成中都起关键作用。本论文以马铃薯栽培品种“甘农薯2号”试管苗作为材料，根据已报道的基因序列信息设计特异引物，利用RT-PCR克隆出马铃薯ACS和ACO基因序列，并进行了生物信息学分析。分别构建了过表达载体pBI121-ACO和pBI121-ACS，以及干扰表达载体pHellsgate8-ACO和pHellsgate8-ACO。利用农杆菌介导法，转化马铃薯栽培品种“甘农薯2号”，获得转基因植株，为研究ACO、ACS基因在马铃薯生长发育和逆境响应过程中的作用奠定基础。取得的结果如下：1.根据ACC合成酶(ACS)及ACC氧化酶(ACO)基因序列（http://***/，序列号分别为PGSC0003DMT400005971和PGSC0003DMT400014932）设计特异性引物，利用RT-PCR技术以马铃薯“甘农薯2号”试管苗克隆得到其基因特异性片段。将ACO、ACS基因全长序列连接到pMD18-T载体上，干扰片段经BP反应连接到pDONRTM201载体上，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞，进行测序。测序结果表明，ACS mRNA全长1832bp其中CDS区长1461bp，与茄科中的番茄同源性最高，达97%。ACO mRNA全长1614bp，CDS区906bp，与茄科中的番茄同源性最高，达96%。2.对马铃薯ACO、ACS基因进行生物信息学分析，结果表明，ACO共有301个氨基酸残基，分子量约34kDa，PI5.96。ACS共有486氨基酸残基，分子量约为55kDa，PI6.76。ACO具有9个alpha螺旋区域，11个beta片层区，13个转角和15个自由卷曲区。ACS具有12个alpha螺旋区域，22个beta片层区，32个转角和23个自由卷曲区。ACO有26个疏水区和26个亲水区。ACS具有39个疏水区和41个亲水区。马铃薯ACO、ACS基因编码的蛋白质和茄科中番茄同源蛋白在进化上属于同一个分支，分子进化最近，关系最为密切。3.将目的基因ACO与过表达载体pBI121定向克隆，得到过表达载体pBI121-ACO;利用Infusion技术将ACS基因与表达载体pBI121定向连接得到pBI121-ACS;通过LR反应，将ACO、ACS基因干扰片段与载体pHellsgate8定向连接，构建得到干扰表达载体pHellsgate8-ACO和pHellsgate8-ACS。4.将过表达载体pBI121-ACO和pBI121-ACS以及干扰表达载体pHellsgate8-ACO和pHellsgate8-ACS分别进行转入农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株LBA4404中，制备农杆菌工程菌;利用农杆菌介导法，将载体分别转入马铃薯栽培品种“甘农薯2号”中，经过抗性筛选及PCR检测，分别获得4株（pBI121-ACO）和3株（pBI121-ACS）以及4株（pHellsgate8-ACO）和5株（pHellsgate8-ACS）转基因植株。

关键词：马铃薯 ACC合成酶 ACC氧化酶生物信息学分析 RNAi 遗传转化

马铃薯StProDH1基因克隆及其功能研究

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马铃薯StProDH1基因克隆及其功能研究

作者：李世贵甘肃农业大学

学位级别：硕士

脯氨酸在植物不同的组织器官中应对各种环境胁迫造成的细胞内代谢紊乱,脯氨酸都作为一种胁迫调节分子,在植物响应胁迫方面起着非常重要的生物学功能。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和脯氨酸脱氢酶(ProDH)分别是植物脯氨酸合成途径和分... 详细信息

脯氨酸在植物不同的组织器官中应对各种环境胁迫造成的细胞内代谢紊乱,脯氨酸都作为一种胁迫调节分子,在植物响应胁迫方面起着非常重要的生物学功能。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和脯氨酸脱氢酶(ProDH)分别是植物脯氨酸合成途径和分解途径的限速酶,在一定程度上决定着脯氨酸的代谢。为了研究马铃薯脯氨酸脱氢酶(ProDH1)在脯氨酸代谢中的作用,本研究从马铃薯中克隆了StProDH1基因,设计并构建了沉默StProDH1基因表达的人工microRNA干扰载体pCPB121-amiR-ProDH1,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。用qRT-PCR技术检测了脯氨酸代谢相关基因的表达水平以及测定了马铃薯不同组织的脯氨酸含量。主要取得了以下研究结果:1.以马铃薯栽培品种Favorita的cDNA为模板克隆得到了StProDH1基因,测序表明其ORF长度为1503 bp,编码500个氨基酸。通过对其启动子的分析,有ACTCAT等顺式作用元件。不同植物的ProDH氨基酸序列中,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基相对保守。2.通过巢式PCR技术克隆得到了amiR-ProDH1前体,并构建了CaMV 35S强启动子驱动的amiR-ProDH1的干扰表达载体pCPB121-amiR-ProDH1,通过农杆菌介导的微型薯转化的方法得到了马铃薯转基因植株。***-PCR分析表明,StProDH1基因和StP5CS基因在马铃薯中存在组织特异性表达。StProDH1基因在根、茎和叶中的表达水平为叶>根>茎,StP5CS基因的表达水平为叶>根>茎。脯氨酸含量测定表明,转基因植株根、茎和叶中的脯氨酸含量均高于非转基因植株中的含量。4.在PEG胁迫下,StProDH1基因的表达随着胁迫时间的延长表达量下降,胁迫消除阶段,其表达上调。这种趋势在转基因植株和非转基因植株中是一致的,但转基因植株StProDH1基因的表达量相对非转基因植株较低。同一条件下,StP5CS基因表达量上升,胁迫消除后,其表达量下降。这种趋势在转基因植株和非转基因植株中是一致的,但转基因植株StP5CS基因的表达量相对非转基因较低。5.在低剂量的外源脯氨酸处理下,StProDH1基因上调表达,在转基因植株中的表达量高于非转基因植株。

关键词：马铃薯脯氨酸 StProDH1 StP5CS 巢式PCR技术

棉花离层相关基因GhBOP1的分离及功能鉴定

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棉花离层相关基因GhBOP1的分离及功能鉴定

作者：常璟甘肃农业大学

学位级别：硕士

棉花结铃性是决定棉花产量最重要因素之一,因此防止棉铃脱落提高结铃性是当前高产育种的主要目标之一。本研究从陆地棉中分离出一个参与离层分化调控的相关基因Gh BOP1,通过生物信息学、分子遗传学、生物化学和细胞学对Gh BOP1基因及其... 详细信息

棉花结铃性是决定棉花产量最重要因素之一,因此防止棉铃脱落提高结铃性是当前高产育种的主要目标之一。本研究从陆地棉中分离出一个参与离层分化调控的相关基因Gh BOP1,通过生物信息学、分子遗传学、生物化学和细胞学对Gh BOP1基因及其编码的蛋白进行表达和功能分析。主要研究结果如下:1.利用电子克隆方法从陆地棉中分离出一个参与离层分化调控的相关基因GhBOP1,通过生物信息学分析表明其编码的蛋白序列含有保守性强的BTB和ANK结构域;进化树分析显示该蛋白氨基酸序列与许多植物的同源蛋白相似程度很高,说明该类蛋白进化比较保守。2.选取Gh BOP1基因cDNA序列中的341bp长短的片段,利用DNAMAN设计出上下游引物,进行PCR扩增,从陆地棉品种中棉所35 cDNA中得到目的产物片段,将其插入到病毒载体pYL-156中,经过克隆测序后,将该载体质粒电击导入根癌农杆菌GV3101中。利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术获得Gh BOP1基因表达沉默的植株,对这些沉默植株进行低盐胁迫处理,结果表明对照植株叶片出现大量地脱落,而Gh BOP1基因沉默植株叶片没有脱落,生长正常。取Gh BOP1基因沉默植株叶柄和茎连接处,进行植物组织石蜡切片,结果显示离层细胞的发育和排列与对照存在着明显的差异。3.利用PCR扩增得到的全长Gh BOP1编码序列与GFP基因进行融合,获得pGhBOP1-GFP融合序列的载体,将其注射烟草叶片进行亚细胞定位观察,发现融合的GhBOP1-GFP蛋白在细胞核和细胞质中都有表达。4.将克隆载体pGEM-T-GhBOP1中片段插入到植物表达载体pBin438中,构建了植物表达载体pBin438-GhBOP1,用电击法将其导入农杆菌LBA4404中,通过叶盘转化法转化烟草,获得转基因烟草植株,利用PCR和RT-PCR进行鉴定。总之GhBOP1基因在离层中优势表达,并对离层的形成具有调控功能。

关键词：棉花离层 GhBOP1基因病毒诱导基因沉默亚细胞定位

马铃薯两种病毒的RT-PCR和ELISA检测技术的研究

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马铃薯两种病毒的RT-PCR和ELISA检测技术的研究

作者：吴丽萍甘肃农业大学

学位级别：硕士

马铃薯是全世界最重要的高产作物,我国马铃薯的种植面积居世界第二位。目前在马铃薯作物上已发现的病毒、类病毒多达20余种,是影响马铃薯产量和质量的主要病害,引起的常年马铃薯产量损失达15～20%。因此马铃薯病毒检测及其如何利用基因... 详细信息

马铃薯是全世界最重要的高产作物,我国马铃薯的种植面积居世界第二位。目前在马铃薯作物上已发现的病毒、类病毒多达20余种,是影响马铃薯产量和质量的主要病害,引起的常年马铃薯产量损失达15～20%。因此马铃薯病毒检测及其如何利用基因工程手段进行防治引起了各国的极大重视。开发快速、灵敏、规范化的检测体系是病毒检测发展的必然方向。马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)和马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)是其中两种严重危害我国马铃薯生产的病毒。本实验以感染马铃薯A病毒和马铃薯S病毒的叶片为实验材料,比较了提取植物总RNA的两种方法。根据马铃薯A病毒和马铃薯S病毒的外壳蛋白基因序列,分别设计合成了两对寡核苷酸引物,以提取的病毒RNA为模板进行cDNA合成并运用PCR技术进行体外扩增,得到两条长度分别约678 bp和642 bp的特异PCR扩增产物,与设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速、灵敏、有效的PVA和PVS的RT-PCR检测技术,为PVA和PVS的检测提供了有效手段。用DAS-ELISA检测方法对PVA和PVS进行了检测,并将检测结果与RT-PCR检测结果进行了对比分析,发现RT-PCR检测的灵敏度和特异性均高于DAS-ELISA检测,但ELISA检测更适合于大量样品的检测。

关键词：马铃薯A病毒马铃薯S病毒逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 酶联免疫吸附测定(ELISA) 病毒检测

马铃薯块茎休眠与发芽抑制差减cDNA文库构建及相关功能基因克隆

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马铃薯块茎休眠与发芽抑制差减cDNA文库构建及相关功能基因克隆

作者：刘柏林甘肃农业大学

学位级别：硕士

马铃薯在我国乃至世界都是第四大粮食作物。马铃薯块茎的休眠与发芽对于马铃薯的种植栽培以及生产加工极为重要。关于马铃薯块茎休眠与发芽的研究大都集中在储藏生理、遗传及细胞生物学方面。生产实践中主要通过低温或者化学抑制剂来控... 详细信息

马铃薯在我国乃至世界都是第四大粮食作物。马铃薯块茎的休眠与发芽对于马铃薯的种植栽培以及生产加工极为重要。关于马铃薯块茎休眠与发芽的研究大都集中在储藏生理、遗传及细胞生物学方面。生产实践中主要通过低温或者化学抑制剂来控制储存块茎的发芽。然而,低温储存会产生低温糖化影响马铃薯的加工品质,使用化学药剂抑制发芽不断增加人们对环境和经济的担忧。由于目前对块茎休眠和发芽机理了解欠缺,人工调控技术发展缓慢,制约了马铃薯种薯的生产和块茎作为工业加工原料的充分利用。研究块茎休眠和发芽的分子机理及调控,对于马铃薯栽培、贮藏保鲜和产业的发展等具有十分重要的意义。本研究旨在通过分离和克隆马铃薯块茎休眠与发芽相关基因,初步揭示参与块茎休眠与发芽的基因的种类和数量,为进一步研究休眠与发芽的分子机制提供理论基础和技术支持。取得的主要研究结果如下:1.利用抑制差减杂交技术(SSH)构建了一个马铃薯块茎休眠与发芽相关基因片段的差减文库。经初步筛选和测序获得310个有效EST片段,BLASTn和BLASTx比对分析发现34条EST为未知功能序列,其余EST均可推测出其同源基因或者蛋白功能。2.初步分析发现所获得EST序列涉及糖类代谢、蛋白质代谢、能量代谢、核酸转录与翻译、信号传导、膜转运、细胞结构以及细胞的分裂与生长等一系列生物学过程。利用GO分类标准对EST从细胞组分,生物过程和分子功能进行了2级水平分类。随机选取的13个差异表达基因用Real-time PCR检测分析,证明其在块茎休眠与发芽过程中上调表达或者下调表达。3.从块茎发芽与休眠相关SSH cDNA文库中筛选了一个与ARF基因同源的EST阳性克隆片段,经过电子克隆获得了ARF基因的cDNA全序列,分析属于马铃薯的ARF1基因。Real time-PCR组织特异性分析表明,ARF基因在马铃薯块茎中优势表达。4.分别对20℃和4℃储存的收获后1周、收获后4周、芽眼萌动、芽长2 mm、芽长5 mm和芽长大于10 mm的马铃薯块茎中ARF基因的相对表达量分析表明,在马铃薯块茎的休眠解除过程中,ARF基因的表达量呈下降上升下降变化趋势,突破芽眼和芽长超过1 cm为两个转折点。对成熟收获、室温储存45天芽眼萌动和室温储存90天芽长2～5mm的试管薯中ARF基因的相对表达量分析表明也呈下降上升的趋势,突破芽眼为马铃薯块茎解除休眠的一个重要时期。ARF基因在块茎中的优势表达和表达量的变化说明其可能参与调控马铃薯块茎的休眠与发芽生理。

关键词：马铃薯块茎休眠与发芽抑制差减cDNA文库 ARF基因电子克隆 Real time-PCR

GhWRKY48与GhWRKY33基因调控棉花对大丽轮枝菌的抗性反应

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GhWRKY48与GhWRKY33基因调控棉花对大丽轮枝菌的抗性反应

作者：刘建芬甘肃农业大学

学位级别：硕士

WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物防御反应中发挥着转录调节作用,在此过程中WRKY往往作为正调节或负调节因子参与植物的防卫反应。目前,棉花(Gossypium spp.)抗病相关WRKY转录因子的抗病作用机制的研究相对较少。本... 详细信息

WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物防御反应中发挥着转录调节作用,在此过程中WRKY往往作为正调节或负调节因子参与植物的防卫反应。目前,棉花(Gossypium spp.)抗病相关WRKY转录因子的抗病作用机制的研究相对较少。本论文针对两个作用相反的WRKY基因GhWRKY48和GhWRKY33的抗病功能进行鉴定和分析,初步阐明了它们协调棉花对黄萎病抗性的分子机制,取得的主要研究结果如下:1.从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种“中棉所35”中克隆分离了两个WRKY转录因子基因,分别命名为GhWRKY48和GhWRKY33。GhWRKY48编码序列全长为882 bp,编码293个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为32.68KDa和6.10;GhWRKY33编码序列全长为1533 bp,编码510个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为55.94 KDa和7.15。用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析组织特异性表达,结果表明GhWRKY48和GhWRKY33在根、茎和叶中均有表达,GhWRKY48在茎中为优势表达,GhWRKY33在根中为优势表达;病原菌和激素处理试验结果表明,GhWRKY48和GhWRKY33的表达受到大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染、茉莉酸(Jasmonate acid,JA)和水杨酸(Salicylic acid,SA)处理的诱导。2.通过病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术获得了GhWRKY48沉默植株。对沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析,结果显示沉默植株的病株率和病指均低于对照植株,恢复培养试验表明GhWRKY48沉默植株中菌丝量明显低于对照植株,表明沉默GhWRKY48基因能够提高棉株抗病性。对GhWRKY48沉默植株和对照植株中抗病标志基因表达进行分析,结果表明GhWRKY48沉默植株中病程相关蛋白(Pathogensis-related protein,PR)基因PR1、PR3、PR4、肽脱甲酰基酶(Peptide deformylase,PDF)基因PDF1.2和苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因PAL的表达水平高于对照植株。进一步说明GhWRKY48是一个负调控转录因子,通过SA和JA信号转导途径参与棉花对大丽轮枝菌的响应。3.利用VIGS技术获得GhWRKY33沉默植株,对沉默植株和对照植株接种大丽轮枝菌分析其在抗病中的作用,调查和分析接菌后植株的抗病表型、发病率和病指等,结果表明GhWRKY33沉默植株的叶片黄化和萎蔫程度、落叶数量、病株率和病指等均显著高于对照植株,说明GhWRKY33沉默植株更易感病,暗示其可能是一个正调控棉花抗病的转录因子。4.从“中棉所35”中克隆抗病相关基因PAD3的启动子,构建pBI121-P-GUS报告载体,同时构建pBI121-GhWRKY33表达载体,将它们导入到农杆菌GV3101中。等量混合两种菌液注射烟草叶片进行瞬时表达分析,β-葡萄糖苷酸酶(Beta-glucuronidase,GUS)染色结果表明GhWRKY33能够作用于GhPAD3启动子且激活该基因表达。同时,对GhWRKY33沉默植株和对照植株中GhPAD3的表达进行分析,结果表明GhPAD3在GhWRKY33沉默植株中的表达量明显低于对照植株。这些结果暗示GhWRKY33是一个正调控转录因子,通过激活类GhPAD3启动子进而调控下游抗病基因的表达,参与棉花对大丽轮枝菌的抗性。总之,GhWRKY48作为负调控转录因子,通过JA和SA信号途径参与棉花对黄萎病的抗性;而GhWRKY33作为正调控因子,作用于类PAD3基因启动子并激活下游抗病基因的表达,从而提高棉花的抗病性。本论文的研究结果表明作用相反的两个转录因子GhWRKY48和GhWRKY33可能共同协调棉花抗病基因的表达,从而调控棉花的抗病性。

关键词：棉花 GhWRKY33基因 GhWRKY48基因大丽轮枝菌病毒诱导基因沉默抗病性

马铃薯遗传转化体系的优化及无机焦磷酸酶基因导入的研究

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马铃薯遗传转化体系的优化及无机焦磷酸酶基因导入的研究

作者：李有忠甘肃农业大学

学位级别：硕士

马铃薯(Solanum tuberosum L.)是重要的粮菜兼用和工业原料作物。马铃薯块茎的休眠和发芽对于马铃薯的栽培、块茎生产和加工工业都极为重要。由于对块茎休眠和发芽机理了解的欠缺,人工调控技术发展缓慢,从而严重制约了马铃薯种薯生产的... 详细信息

马铃薯(Solanum tuberosum L.)是重要的粮菜兼用和工业原料作物。马铃薯块茎的休眠和发芽对于马铃薯的栽培、块茎生产和加工工业都极为重要。由于对块茎休眠和发芽机理了解的欠缺,人工调控技术发展缓慢,从而严重制约了马铃薯种薯生产的发展和块茎作为工业加工原料的充分利用。因此,研究块茎休眠和发芽的分子机理及调控,对于马铃薯栽培、贮藏保鲜和产业发展等具有十分重要的意义。无机焦磷酸酶(pyrophosphatase,PPase)是以无机焦磷酸(pyrophosphate,PPi)为底物的水解酶,PPi也是联系马铃薯块茎细胞质和质体中蔗糖降解、淀粉合成以及淀粉贮藏器官中糖酵解代谢的纽带,蔗糖代谢在两步酶促反应中需要PPi。因此,通过调控细胞质中的PPi可以实现对马铃薯块茎休眠与发芽特性的调控。本研究的主要目的是构建马铃薯无机焦磷酸酶(PPase)基因的植物表达载体,并对农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化体系进行优化,然后将PPase基因导入马铃薯栽培品种中,以期对马铃薯块茎的休眠和发芽特性进行调控。取得的主要研究结果如下:1.将马铃薯PPase基因与原核表达载体pET-28a融合,构建了原核表达载体pET-PPA,然后导入大肠杆菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE分析表明PPase基因在大肠杆菌中能够表达。2.将PPase基因分别与组成型启动子CaMV 35S、块茎特异表达启动子CIPP和低温诱导表达型启动子rd29A融合,构建了植物表达载体pBI-SP、pBIC-SP和pBIr-SP,通过冻融法导入根癌农杆菌LBA4404中,经酶切鉴定和PCR检测证明表达载体已导入农杆菌中。3.以马铃薯栽培品种甘农薯2号和Favorita为试验材料,利用固体培养、固液培养和液体培养法进行了试管薯的诱导,并对其农杆菌介导的遗传转化体系进行了优化研究。结果表明,固体培养、固液培养和液体培养法诱导的甘农薯2号试管薯单瓶平均结薯数分别为4.6、4.4和6.5个,块茎平均直径分别为6.2、5.8和7.7 mm;Favorita单瓶平均结薯数为5. 4、5.8和7.4个,平均直径分别达6.2、5.9和7.3 mm。用浓度为OD600= 0.5的菌液,侵染8 min,共培养2 d能够获得较高的转化频率,其转化频率甘农薯2号和Favorita分别可达42.6%和36.8%。4.以两个马铃薯栽培品种甘农薯2号和Favorita的试管薯为供体材料,分别用组成型启动子CaMV 35S、块茎特异表达启动子CIPP和低温诱导表达型启动子rd29A驱动的PPase基因表达载体pBI-SP、pBIC-SP和pBIr-SP进行遗传转化,获得了部分转基因马铃薯。通过PCR扩增初步表明PPase基因已整合到马铃薯的基因组中。

关键词：马铃薯 PPase基因原核表达遗传转化

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马铃薯ERF1基因克隆及其功能研究

马铃薯ERF1基因克隆及其功能研究

作者：贺文辉甘肃农业大学

学位级别：硕士

乙烯响应因子（Ethylene responsive factor，ERF）作为AP2/EREBP转录因子亚族，是植物所特有的，通过AP2结构域与下游基因启动子区的GCC-box/DRE/CRT等顺式作用元件结合调控下游基因的表达，进而参与植物细胞生长发育、激素应答、抗生... 详细信息

乙烯响应因子（Ethylene responsive factor，ERF）作为AP2/EREBP转录因子亚族，是植物所特有的，通过AP2结构域与下游基因启动子区的GCC-box/DRE/CRT等顺式作用元件结合调控下游基因的表达，进而参与植物细胞生长发育、激素应答、抗生物和非生物逆境胁迫等。目前，通过导入ERF转录因子激发调控下游多个功能基因发挥作用，已使水稻、小麦、番茄等植物性状获得综合性改良，但对马铃薯中的ERF类基因研究还比较少。本研究通过克隆马铃薯ERF1基因、生物信息学分析、超表达载体的构建、转基因植株抗旱性分析、下游基因表达量分析等，深入研究马铃薯ERF1的结构和功能，取得的研究结果如下：1.利用RT-PCR技术从马铃薯中克隆出了ERF1转录因子基因cDNA序列，该序列与GenBank公布的序列（***125860）同源性达100%，该cDNA长573bp，开放阅读框架573bp，编码191个氨基酸，其中27-85为AP2保守结构域，属于AP2/EREBP转录因子的EREBP亚族ERF类，编码的蛋白不具备信号肽，属于非分泌型疏水蛋白。2.构建了CaMV35S和rd29A启动子驱动的ERF1基因过表达载体，采用农杆菌介导法转化马铃薯分别获得23和21株转基因植株。荧光定量PCR分析表明，ERF1基因在转基因植株的叶、茎、根中均有表达，且在叶中表达量较高，茎和根次之;干旱胁迫下其下游P5CS、CDPK、ZEP、SDR、PR2基因在转基因植株中的表达量明显高于未转基因植株的表达量。3.脯氨酸含量、丙二醛含量等相关抗旱生理指标测定表明，在干旱逆境胁迫下ERF1在马铃薯中的过量表达降低了细胞质膜的受损程度，增强了渗透调节物质的积累，对干旱逆境表现出一定的抗性。干旱胁迫下，ERF1转基因植株在株高、根长、茎粗、鲜重等方面优于未转基因的对照植株。综上所述，过表达ERF1转基因株系对干旱胁迫有一定程度的提高，可能ERF1通过正调控逆境相关基因的表达，参与植物生理调节进而调节马铃薯对非生物胁迫的应答。

关键词：马铃薯 ERF 转基因植株干旱胁迫生理指标