马铃薯StProDH1基因克隆及其功能研究

作     者：李世贵 

作者单位：甘肃农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：司怀军

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：马铃薯 脯氨酸 StProDH1 StP5CS 巢式PCR技术 

摘      要：脯氨酸在植物不同的组织器官中应对各种环境胁迫造成的细胞内代谢紊乱,脯氨酸都作为一种胁迫调节分子,在植物响应胁迫方面起着非常重要的生物学功能。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和脯氨酸脱氢酶(ProDH)分别是植物脯氨酸合成途径和分解途径的限速酶,在一定程度上决定着脯氨酸的代谢。为了研究马铃薯脯氨酸脱氢酶(ProDH1)在脯氨酸代谢中的作用,本研究从马铃薯中克隆了StProDH1基因,设计并构建了沉默StProDH1基因表达的人工microRNA干扰载体pCPB121-amiR-ProDH1,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。用qRT-PCR技术检测了脯氨酸代谢相关基因的表达水平以及测定了马铃薯不同组织的脯氨酸含量。主要取得了以下研究结果:1.以马铃薯栽培品种Favorita的cDNA为模板克隆得到了StProDH1基因,测序表明其ORF长度为1503 bp,编码500个氨基酸。通过对其启动子的分析,有ACTCAT等顺式作用元件。不同植物的ProDH氨基酸序列中,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基相对保守。2.通过巢式PCR技术克隆得到了amiR-ProDH1前体,并构建了CaMV 35S强启动子驱动的amiR-ProDH1的干扰表达载体pCPB121-amiR-ProDH1,通过农杆菌介导的微型薯转化的方法得到了马铃薯转基因植株。***-PCR分析表明,StProDH1基因和StP5CS基因在马铃薯中存在组织特异性表达。StProDH1基因在根、茎和叶中的表达水平为叶根茎,StP5CS基因的表达水平为叶根茎。脯氨酸含量测定表明,转基因植株根、茎和叶中的脯氨酸含量均高于非转基因植株中的含量。4.在PEG胁迫下,StProDH1基因的表达随着胁迫时间的延长表达量下降,胁迫消除阶段,其表达上调。这种趋势在转基因植株和非转基因植株中是一致的,但转基因植株StProDH1基因的表达量相对非转基因植株较低。同一条件下,StP5CS基因表达量上升,胁迫消除后,其表达量下降。这种趋势在转基因植株和非转基因植株中是一致的,但转基因植株StP5CS基因的表达量相对非转基因较低。5.在低剂量的外源脯氨酸处理下,StProDH1基因上调表达,在转基因植株中的表达量高于非转基因植株。