检索结果-南通市图书馆

作者：王丹南方医科大学

学位级别：硕士

背景随着诊疗技术的进展,胆囊结石合并胆总管结石的手术方法由最初的开腹手术,已发展为各种微创术式的多样化优化组合。例如同期或分阶段行腹腔镜胆囊切除术加内镜下逆行胰胆管造影术联合十二指肠乳头切开术或球囊扩张术,配合碎石或取... 详细信息

背景随着诊疗技术的进展,胆囊结石合并胆总管结石的手术方法由最初的开腹手术,已发展为各种微创术式的多样化优化组合。例如同期或分阶段行腹腔镜胆囊切除术加内镜下逆行胰胆管造影术联合十二指肠乳头切开术或球囊扩张术,配合碎石或取石器械的使用,对胆总管结石有较高的清除率,使得其在胆总管结石治疗中一度发挥重要作用而受到青睐。但由于内镜下治疗有可能破坏奥狄氏括约肌的正常结构,损伤后远期并发症问题越来越多地引起人们关注。腹腔镜下不同方式的胆总管探查取石术由于未破坏奥狄氏括约肌的功能,且可同期行胆囊切除术治疗胆囊结石,避免了内镜下“分阶段”手术对病人造成的负担,是目前肝胆外科治疗胆囊结石合并胆总管结石的主要微创外科治疗方法。根据病人的不同情况,又有不同的手术组合方式,各种不同术式的手术指证如何掌握及治疗效果和临床价值值得进一步探索。目的通过对胆囊结石合并胆总管结石病人4组不同手术治疗方式不同临床指标的对比分析,探索各种术式治疗的适应证及其科学性、合理性,期望能为患者选择适宜的个体化手术方式提供临床依据。方法本课题连续收集2016年1月至2017年12月入住武汉总医院普通外科的胆囊结石合并胆总管结石患者的临床资料,符合纳入标准的患者有103例,均经影像学检查确认患有胆囊结石合并胆总管结石。根据不同手术方式分为4组,A组:腹腔镜胆囊切除+胆总管探查T管引流(Laparoscopic cholecystectomy + common bile duct exploration+ T tube drainage,LCBDE);B 组:开腹胆囊切除+胆总管探查 T 管引流(Open cholecystectomy + common bile duct exploration,OCBDE);C组:腹腔镜胆囊切除(Laparoscopic cholecystectomy,LC)联合胆道镜及十二指肠镜胆道探查+鼻胆管引流(Endoscopic nasobiliary drainage,ENBD);D 组:腹腔镜胆囊切除+经胆囊管胆道探查(Laparoscopic cholecystectomy + transcystic common bile duct exploration,LTCBDE)。临床观察指标包括:①一般情况:年龄、性别;②生化指标:术前及出院前总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、白细胞计数(WBC);③手术相关指标:手术时间(h)及术中出血量(ml);④临床结局相关指标:术后胃肠道功能恢复时间(d)、进食时间(d)、引流管拔除时间(d)、术后住院时间(d)、总住院时间(d)、切口感染发生率(%)。所得数据应用SPSS22.0统计软件分析。计量数据以均数±标准差(X±s)表示,采用方差分析;计数资料用率表示,采用卡方检验。P0.05),资料具有可比性。2.生化指标:4组术前及出院前总胆红素、直接胆红素,白细胞计数无显著性差异(P>0.05)。3.手术相关指标:3.1手术时间 4组的手术时间分别为:148.79±43.55min、157.07±55.93min、198.50±50.59min、182.90±30.72min,4 组间比较 F=5.949,有显著性差异(P0.05)。B组手术时间与C组相比,无显著性差异(P>0.05)。C组与D组手术时间相比,无显著性差异(P>0.05)。3.2术中出血量 4组的术中出血量分别为:64.84±41.76ml、157.07±116.26ml、59.00±19.44ml、59.52±26.74ml,4 组间比较 F=18.056,有统计学差异(P0.05)。B组明显多于其他组,有显著性差异(P0.05)。4.临床结局相关指标4.1术后胃肠道功能恢复时间 4组的术后胃肠道功能恢复时间分别为:1.82±0.39d、3.14±0.915d、2.45±0.60d、2.29±0.46d,4 组间比较 F=22.738,有显著性差异(P0.05)。4.2术后进食时间 4组的术后进食时间分别为:2.64±0.48d、4.24±0.73d、3.00±0.72d、2.81

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SHH、E-cadherin和IL-6在慢性结石性胆囊炎组织中的表达及其意义

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作者：孙世波南方医科大学

学位级别：硕士

背景和目的： Sonic Hedgehog(SHH)分泌信号分子家族在早期胚胎发育、器官分化过程中发挥重要的调控作用,通路的异常激活还与人类肿瘤的发生与演进密切相关。SHH蛋白是由SHH基因编码的一种高度保守的分泌型糖蛋白。上皮型钙粘蛋白(E-cad... 详细信息

背景和目的： Sonic Hedgehog(SHH)分泌信号分子家族在早期胚胎发育、器官分化过程中发挥重要的调控作用,通路的异常激活还与人类肿瘤的发生与演进密切相关。SHH蛋白是由SHH基因编码的一种高度保守的分泌型糖蛋白。上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)是一类广泛分布于胚胎和成熟组织上皮组织介导细胞间同质粘附的钙依赖性单次跨膜糖蛋白,是在生理条件下维持组织结构形态的完整性和细胞极性的重要成分。白细胞介素-6(interleukin-6)是细胞因子网络中重要成分之一,亦是一种多功能的细胞因子,通过复杂的细胞信号传导途径,对细胞生长、分化、凋亡、转化及免疫反应等过程都具有重要的调节作用。最近越来越多的研究显示,SHH信号通路的异常激活和过度表达、E-cadherin表达减弱或缺失及IL-6的失调控参与多种肿瘤的发生过程,但SHH信号通路、E-cadherin和IL-6在炎症疾病尤其是结石性胆囊炎组织中的作用在国内尚无报道。本课题拟通过对慢性结石性胆囊炎、胆囊癌组织标本中SHH、E-cadherin和IL-6表达水平的同步观察,探讨慢性结石性胆囊炎向胆囊癌发展转化机制,目的旨在寻找胆囊癌特异性分子标志物,以利早期诊断及特异性靶向治疗。材料和方法： 1.胆囊炎标本的收集：选取广州军区武汉总医院2005年1月至2010年12月间经病理确诊、且术后病理蜡块保存完好的慢性结石性胆囊炎患者术后的组织标本120例,其中男性48例,女性72例,平均年龄51.8岁。其中轻度慢性结石性胆囊炎45例,中度慢性结石性胆囊炎45例,重度慢性结石性胆囊炎30例。对照组为囊腺癌患者术后组织标本(36例),男性20例,女性16例,平均年龄61.4岁,手术前均未放疗或化疗。 2.常规HE染色判断胆囊炎分级：60℃烤片30min,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水;磷酸盐缓冲液(PBS)洗5min,共3次;苏木素染色液染色5min;自来水冲洗去多余的染色液,约10min,蒸馏水洗涤;盐酸酒精分化30s;自来水冲洗,浸泡15min;伊红染色液染色30s-2min(根据染色结果和要求调整时间);梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。慢性结石性胆囊炎分级标准：轻度：病程5年;B超检查提示有胆囊体积的萎缩或增大,有胆囊壁弥漫性或局限性(结节状)增厚,多伴有息肉样病变;病理检查显示黏膜上皮部分或大部分脱失,未脱失的腺上皮细胞形成代偿性区域性增生集中,增生的腺体有不规则的扩张,腺上皮细胞增生活跃。增厚的胆囊壁组织内形成单个腺管及多个腺管的异型增生灶,炎细胞浸润程度重,淋巴滤泡形成,纤维结缔组织增生,多有罗-阿氏窦下延,黏液腺分泌增强。 3.免疫组化法检测组织标本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白表达：60℃烤片30mmin,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水后,对组织抗原进行高温热修复;室温下冷却至常温;磷酸盐缓冲液(PBS)洗5min,共3次,加3%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶活性;磷酸盐缓冲液(PBS)洗2mmin,共3次;滴加非免疫性动物血清阻断非特异性结合,20min后甩去封闭液加一抗4℃保湿,过夜;PBS洗5min,共3次,滴加二抗,室温孵育30min;PBS洗2min,共3次;DAB显色,自来水终止反应并冲洗5min;苏木素复染,清水冲洗;梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 4.病理图像分析定量检测组织标本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白含量：切片经免疫组化染色完成后,每张切片随机选取5个不同高倍视野(×400)进行拍照。免疫组织化学染色图像分析检测：在光镜下观察指标：免疫复合物沉积部位及免疫反应强度的观察。阳性判断标准：当细胞膜和(或)胞浆出现棕黄色阳性物质作为阳性细胞。观察参数：慢性结石性胆囊炎和胆囊癌组织中E-cadherin和IL-6表达的阳性颗粒的参数值——平均灰度、阳性单位。图像分析及数据统计分析：在400倍视野下,每张玻片选取5个视野,采用武汉千屏公司HMIAS-2000高清晰度彩色病理图片报告分析系统测定阳性颗粒的平均灰度和阳性单位值。 5.统计学分析：运用SPSS13.0软件进行统计学分析。胆囊炎、胆囊癌组织SHH、IL-6、E-cad蛋白表达的阳性单位、平均灰度值以x±s表示,采用单因素方差分析进行了完全随机设计的方差分析(方差齐时采用Fisher法,其中两两比较采用LSD法;方差不齐时采用Welch法,其中两两比较采用Dunnett T3法)及Pearson相关分析,以F为统计量,以双侧a=0.05作

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丹参对肝脏缺血再灌注不同时限胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）表达的影响

丹参对肝脏缺血再灌注不同时限胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）表...

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作者：王直南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景在肝外伤、肝切除、肝移植以及多器官功能衰竭救治领域中,肝脏缺血再灌注损伤是造成肝功能损害的重要因素,其损伤机理及脏器保护研究始终是肝脏外科、创伤外科,移植外科的重要方向。缺血再灌注损伤是一个受多因素调节和影响的... 详细信息

研究背景在肝外伤、肝切除、肝移植以及多器官功能衰竭救治领域中,肝脏缺血再灌注损伤是造成肝功能损害的重要因素,其损伤机理及脏器保护研究始终是肝脏外科、创伤外科,移植外科的重要方向。缺血再灌注损伤是一个受多因素调节和影响的过程。复氧过程中活性氧的产生,Kupffer细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的活化,引起一系列损害性的细胞反应,继而导致炎性反应和细胞凋亡。同时,由于肝窦内皮细胞的损害,产生微循环障碍,进一步加重了肝脏的局部缺血。在缺血再灌注过程中,许多细胞因子和激素的表达水平都发生了改变,并在其中发挥不同的作用,如一氧化氮(NO)、热休克蛋白(HSP)、内皮素(ET)、缺氧诱导因子-Ⅰ(HIF-Ⅰ)、胰岛素样生长因子-Ⅰ等。其中,胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)的作用得到了越来越多的重视。IGF是一类既有胰岛素样合成代谢作用,又有促生长作用的多肽,它们在机体组织细胞的增殖、分化和转化及抑制细胞凋亡中起重要作用,是许多组织生长和分化的重要调节因子,它还对不同的代谢产物、糖和氨基酸转运过程起胰岛素样作用。近年来,IGF-Ⅰ在肝外伤、肝脏手术以及多器官功能衰竭中的异常表达开始引起人们的关注,而关于IGF-Ⅰ与肝脏缺血再灌注损伤的关系,它在肝脏缺血再灌注期表达的时空分布特点及其作用意义,尚未能最后阐明。丹参为我国传统活血祛瘀中药,已有诸多研究表明丹参对重要脏器组织缺血再灌注损伤有较好的保护作用,这一原理主要为两方面,其一是改善微循环灌注不足及抗氧自由基作用,其二是可以降低肝细胞内的游离钙离子浓度,减轻由于钙超载引起的细胞损伤。而丹参的这些对肝脏的保护作用与IGF-Ⅰ是否有一定内在联系,还无人知晓。本课题在以往前期研究工作基础上进一步进行肝缺血再灌注期IGF-Ⅰ表达的研究,整体实验工作分为两部分:第一部分通过建立大鼠肝脏缺血再灌注模型,观察肝缺血再灌注不同时限中IGF-Ⅰ及Caspase-3的表达特点,了解肝脏缺血再灌注IGF-Ⅰ与肝脏功能及细胞凋亡的关系,探讨其时空表达特点及作用意义。第二部分通过对比分析丹参预处理组与未处理组IGF-Ⅰ、Caspase-3表达的不同特点,研究丹参对肝脏缺血再灌注损伤不同时限胰岛素样生长因子-Ⅰ表达的影响及意义。研究工作的目的旨在了解肝脏缺血再灌注期IGF-Ⅰ表达的时空特点及作用意义,以及国药丹参对肝脏缺血再灌注时IGF-Ⅰ表达的影响,从而为肝缺血再灌注损伤的防治探索新的方向。第一章胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在大鼠肝缺血再灌注不同时限的表达及意义目的建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,观察肝缺血再灌注不同时限中IGF-Ⅰ及Caspase-3的表达特点并了解IGF-Ⅰ在肝缺血再灌注损伤时的时空分布特点及作用意义。方法1.健康纯系SD大鼠75只随机分为3组,正常组(n=25只),假手术组(n=25只)及缺血再灌注组(n=25只),各组内又根据再灌注后不同时间(0h、3h、12h、24h、72h)分为5个亚组,每组5只。2.术前禁食12h,自由饮水。腹腔麻醉生效后,常规备皮、消毒,正常组进腹后直接切取肝组织待测,假手术组仅解剖肝门;缺血再灌注组在肝十二指肠韧带远心端安置无损伤动脉钳钳夹肝蒂45min,于不同复流时间(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝组织制备免疫组化及光镜、电镜观察标本,肝上下腔静脉取血测定生化指标。***—Ⅰ及Caspase-3免疫组化检测依说明书进行。胞浆呈胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性反应。每张切片在400倍光学显微镜下随机选取5个视野,每个视野统计100个细胞中的阳性细胞数。血清ALT和AST采用全自动生化分析仪检测。用光学显微镜和电子显微镜观察肝组织细胞及细胞器病理形态学变化。4.用SPSS13.0进行分析。采用重复测量方差分析,组间比较用单因素方差分析,多重比较用LSD法。P＜0.05认为差异有显著性。结果正常组及假手术组各时限点IGF-Ⅰ表达无显著性差异(P＞0.05)。损伤组再灌注0h时IGF-Ⅰ表达下降,3h下降较明显,其在小叶中央静脉及汇管区的表达明显较肝实质内致密,阳性表达至12h时达到最低点,24h时开始回升。Caspase-3在正常组及假手术组各时限点无显著性差异(P＞0.05),而在损伤组缺血后再灌注0h表达即开始增强,在再灌注24h组表达水平达峰值,至72h后回复到基线水平(P＞0.05)。肝缺血再灌注后外周血清ALT、AST浓度升高,再灌注0h、3h、12h、24h损伤组较同期正常组及假手术组高(P＜0.01),24h时浓度开始下降,至72h时恢复正常。光镜下损伤组再灌注0h时细胞

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大鼠肝脏缺血再灌注不同时限缺氧诱导因子1的表达变化及意义探讨

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作者：于超南方医科大学

学位级别：硕士

随着现代临床外科的进步,肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia andreperfusion injury,HIRI)在肝脏外科及肝脏移植中的作用越来越受到重视,对其损伤机制的研究也较多。肝脏血流减少及随后的再灌注期的微循环紊乱等均导致细胞内的缺氧环... 详细信息

随着现代临床外科的进步,肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia andreperfusion injury,HIRI)在肝脏外科及肝脏移植中的作用越来越受到重视,对其损伤机制的研究也较多。肝脏血流减少及随后的再灌注期的微循环紊乱等均导致细胞内的缺氧环境,必然会引起维持机体氧平衡的重要调节蛋白缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的表达变化。目前对肝脏缺血再灌注期HIF-1的时程表达特点及意义尚不清楚,少有文献报道。故本实验旨在研究肝脏缺血再灌注期HIF-1的时空表达特点及作用意义,以及其表达与HIRI过程中细胞损伤及细胞凋亡的关系,为肝脏缺血再灌注损伤的防治探索新的方向。实验一HIF-1α在大鼠肝脏不同缺血时限的表达变化及意义一目的建立大鼠肝脏缺血损伤模型,检测HIF-1α和Caspase-3蛋白在肝脏不同缺血时限的表达变化并探讨其意义。二方法1.健康SD大鼠35只随机分为正常组(5只)、假手术组(15只)、缺血组(15只),假手术组及缺血组又按不同缺血时限分为30min、45min、60min三个亚组,每组5只大鼠,制备大鼠全肝血流阻断模型。2.血液标本由肝上下腔静脉抽取约2ml,检测血清ALT值。3.大鼠肝脏标本取材后经10%福尔马林固定,电镜标本取材后即放入预先配置的3%戊二醛中固定20min后进行修块取材。***染色及免疫组织化学均按试剂盒内操作步骤进行,兔抗大鼠HIF-1α和Caspase-3的工作浓度为1:100,均购于武汉博士德生物工程有限公司。5.光镜及电镜下进行病理组织学观察,免疫组织化学SABC法检测HIF-1α和Caspase-3在肝脏不同缺血时限的表达量,采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统进行定量检测。6.所有计量数据应用SPSS 11.5进行统计学处理,采取析因设计方差分析分析主效应与交互效应后,LSD法检验各组间差别,P＜0.05表示有统计学意义。三结果1.正常组与假手术组的HIF-1α表达比较,其差别均不具有统计学意义(P＞0.05)。各时限缺血组与假手术组相比,其结果具有显著的统计学差异(P＜0.01)。自缺血30min后HIF-1α蛋白的表达即显著增加,且随缺血时限的延长呈逐渐上升趋势。在区域分布上可见,缺血30min时HIF-1α蛋白主要表达在汇管区门静脉、微血管、微胆管周围的细胞内,部分细胞内呈强阳性表达。缺血45min时,表达区域逐渐向小叶间中央静脉区蔓延,缺血60min时,中央静脉内皮细胞及其周围肝细胞中都可见到HIF-1α蛋白阳性表达。2.正常组与假手术组中Caspase-3蛋白阳性表达量较少,相比较无统计学差异(P＞0.05)。各时限点的缺血组与假手术组相比,均具有显著的统计学差异(P＜0.01)。随着缺血时限的延长,各缺血组Caspase-3的表达量在统计学上无差异(P＞0.05)。阳性细胞主要出现在肝窦状内皮细胞中。3.缺血组血清ALT水平均高于正常组及假手术组,随着缺血时限的增加,ALT逐渐上升,组织病理学损伤亦呈加重趋势。四讨论本实验研究结果表明,单纯的手术损伤未影响到肝脏的血供时,不会引起肝脏组织及细胞的损伤,故血清ALT值处于正常水平,作为机体缺氧调控因子的HIF-1α蛋白的表达量极低,凋亡执行蛋白Caspase-3的表达量也处于基线水平。一旦肝脏遭受缺血性损伤,即有HIF-1α蛋白应激性的显著表达上调,HIF-1α蛋白的积聚量与肝功能变化及细胞形态学损伤的程度呈一定的相关性,因此急性缺血期HIF-1α的表达强度可以作为反映机体缺氧损伤程度的一个敏感指标。大鼠遭受突发30min的肝缺血,即可使Caspase-3显著性表达上调,活化凋亡程序。因此,如何阻止肝窦内皮细胞中Caspase-3蛋白的表达上调与激活,可以作为减轻肝脏缺血损伤的防治方向之一。实验二HIF-1α在大鼠肝脏缺血45min再灌注不同时限表达变化及意义探讨一目的建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,用免疫组织化学SABC法检测HIF-1α和Caspase-3蛋白在肝脏缺血45min再灌注不同时限的表达变化并探讨其意义,并观察丹参预处理对它们表达的影响。二方法1.健康SD大鼠80只随机分为正常组(5只)、假手术组(25只)、缺血再灌注组(25只),丹参处理组(25只),假手术组、缺血再灌注组及丹参处理组又按不同再灌注时限(0h、3h、12h、24h、72h)分为五个亚组,每组5只大鼠。2.模型制备、取材方法、HE染色及免疫组织化学染色步骤、观察方法及统计学处理等,同

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谷氨酰胺对急性胰腺炎治疗作用的临床研究

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作者：李勇南方医科大学

学位级别：硕士

背景急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是临床常见的急腹症,常伴有明显的全身炎症反应及多器官功能障碍,在诊断、预防、治疗及监护上虽取得许多进展,但其病死率仍可达10%-20%。重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）患... 详细信息

背景急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是临床常见的急腹症,常伴有明显的全身炎症反应及多器官功能障碍,在诊断、预防、治疗及监护上虽取得许多进展,但其病死率仍可达10%-20%。重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）患者死亡有2个高峰,第1个高峰在疾病第1周内,主要原因为过度的全身性炎性反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征（MODS）;第2个高峰出现在病程的2至3周,主要原因为胰腺和胰周感染引起的脓毒症,占SAP病死率的80%以上。肠屏障功能障碍及细菌、毒素移位对机体的“二次打击”及由此所引起的感染性并发症是SAP患者第二个死亡高峰的重要原因。因此,如何在疾病治疗过程中提高机体的免疫功能,抑制过强的炎症反应,阻抑AP从轻症向重症的转化,是降低SAP病死率、提高临床疗效的有效措施,亦是目前国内外关于AP研究的热点问题。作为一种临床急危重症,AP患者处于高分解代谢状态,患者多存在不同程度的营养障碍和免疫功能抑制。长期的完全肠外营养（Total parenteral nutrition, TPN）容易引起肠黏膜萎缩,屏障功能受损,菌群失调及细菌、毒素易位,继而引发全身性的炎症反应。有研究报道,AP并发SIRS患者排泄物中危害菌群的比例较正常者明显升高,此结果与经典的“肠—肺炎症反应轴线”理论充分说明,肠道在AP感染性并发症和组织器官损伤等过程中发挥了重要作用。近年来随着对肠内营养（enternal nutrition, EN）研究的深入,提出经空肠喂养不刺激胰腺,不引起胰液分泌的增加;而且肠内营养能够维持肠道黏膜完整性,减低其通透性,减少肠道内细菌和毒素的移位,从而减少并发症。EN是符合机体生理、较为全面的营养方式。传统观念认为EN治疗AP会加重胰腺分泌负担,引起AP症状复发和病情加重,但目前认为肠道内的保护性菌群会因为疾病过度药物治疗（包括抗生素）、缺乏肠内营养而减少,这就大大增强了条件致病菌对机体的侵害,而下消化道黏膜的生长和功能维持约70%,依赖于肠腔内营养,故肠腔内营养的缺乏会导致肠黏膜尤其是结肠黏膜萎缩,从而为微生物移位和全身性感染创造了条件。EN是与人正常生理需求相一致而又安全方便的方法,有助于维持肠道的机械生物免疫功能,防止细菌移位,减少感染性并发症发生率。近几十年来,临床营养支持的概念发生了重大变化,EN能减少SAP患者肠道黏膜的损伤和肠道细菌的移位,减少继发感染的发生率。EN治疗可提供能量、蛋白质及其他机体必须营养素,满足一般患者对营养的需要,而且加入特殊营养物质的免疫型肠内营养液可对特异性患者的免疫功能和代谢进行调控。研究结果提示接受EN的患者较接受PN的感染率低76%,EN有助于改善肠壁组织营养及血液供应,肠管不仅是消化系统的吸收排泄器官,同时在机体免疫、内分泌等诸多方面发挥着重要作用。因此,可以说EN对机体是一种特殊类型的“抗生素”。EN以其在急性胰腺炎治疗过程中独到的优势而得到了我国2013年急性胰腺炎诊治指南的推荐。近年来,随着药理营养素新概念的出现和作用机制的阐明,在标准营养配方基础上添加某些具有特殊作用的营养素,利用其药理学作用达到治疗和调节机体代谢与免疫功能的目的。营养支持也由传统的单纯提供能量和营养底物,维持机体氮平衡及组织器官结构与功能拓展到通过提供某些特殊营养素来调控应激状态下机体代谢过程、炎性介质的产生和释放,刺激免疫细胞,增强免疫应答能力,维持肠道屏障功能,保护机体重要器官功能,从而改善患者的临床结局,临床营养理念得以拓展和提升,从传统的“营养支持”变为“营养治疗”,深化了营养支持的作用,提高了营养支持疗效。关于免疫增强药理营养素谷氨酰胺（Glutamine, Gln）的研究表明：Gln是机体中含量最丰富的氨基酸,约占总游离氨基酸的50%。是合成氨基酸、蛋白质、核酸和许多其他生物分子的重要前体物质,在肝、肾、小肠和骨骼肌等组织器官代谢中起重要调节作用,是机体内各器官之间转运氨基酸和氮的主要载体,也是所有快速增殖细胞如小肠黏膜细胞、淋巴细胞等生长、修复特需的能源物质,对维护肠道黏膜结构和功能的完整性起着十分重要的作用。补充外源性Gln可通过增加血浆和肌肉组织中Gln浓度来促进蛋白质合成,改善机体创伤或感染等应激状态下的免疫抑制状态,减轻氧化应激损害,调控细胞因子、炎性介质的产生和释放,从而改善患者的临床结局。早年的许多研究证明,创伤、烧伤、感染等严重应激状态下,血浆与骨骼肌内Gln含量明显下降,导致蛋白质合成障碍、肠黏膜萎缩和免疫功能受损,Gln强化的肠外营养有明显的省氮作用,有助于改善骨髓移植患者的氮平衡,降低感染性并发症发生率、缩短住院时间。随后的大量单中心前瞻性研究结果显示,外科危重患者经肠外途径补充药理剂量的Gln可

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人正常肝细胞过氧化损伤时受体及受体后水平胰岛素抵抗现象

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作者：徐建华南方医科大学

学位级别：硕士

背景：胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病、冠心病、高血压等慢性疾病的共同机制及危险因素。有研究发现创伤应激等条件下,机体亦表现出一定程度的胰岛素抵抗并直接影响大手术、创伤的预后。近年来,胰岛素抵抗与缺血再灌... 详细信息

背景：胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病、冠心病、高血压等慢性疾病的共同机制及危险因素。有研究发现创伤应激等条件下,机体亦表现出一定程度的胰岛素抵抗并直接影响大手术、创伤的预后。近年来,胰岛素抵抗与缺血再灌注相关性的研究逐渐成为新点、热点之一,有研究证实肝脏缺血再灌注后存在高血糖现象,其产生机制众说不一：Zanaro NL[3]认为是肝缺血再灌注过程中所产生的炎性细胞因子(如TNF-a等)继发性地诱导内源性儿茶酚胺、皮质醇和胰高血糖素等抗胰岛素激素分泌引起的结果;Choi CS[4]认为是恢复血流前使用大剂量类固醇激素所致;Nowsk G[5]认为是肝脏贮存的肝糖元分解、集中释放所致。胰岛素抵抗包括受体前、受体、受体后三个水平,受体前水平IR主要与在体各种抵抗激素的释放有关,而受体及受体后水平IR主要与胰岛素-胰岛素受体(insulin receptor,IR)-受体底物(IR substrates,IRSs)-PI3-kinase-蛋白激酶B(phospho-Protein Kinase B,PKB/AKT)信号系统有关。有研究显示,此信号系统任何靶蛋白分子表达下降均可以引起胰岛素抵抗。胰岛素受体锚定在细胞膜上,细胞膜流动性及结构的破坏势必会损害细胞膜功能,进而影响胰岛素受体表达。因此,同步检测培养基中残余葡萄糖含量,反映细胞膜改变的Annexin-V表达、细胞形态学改变、细胞增殖抑制率变化等指标,有可能在一定程度上反映出细胞是否出现受体水平的胰岛素抵抗现象。胰岛索受体由α、p各两个亚基组成,其中p亚基是发挥胰岛素细胞膜与细胞内效应的功能单位,因此该指标是反映受体水平胰岛素抵抗的特异性敏感指标。AKT时胰岛素信号通路上的关键信号分子,它的磷酸化可激活葡萄糖转运子,进而启动葡萄糖由膜外向膜内转运,因此,通过在检测上述指标同时,同步观察P-AKT的表达变化可以反映出受体后水平的胰岛素抵抗现象。本课题组前期动物实验研究已初步证实,大鼠肝缺血再灌注时,可出现受体前水平的胰岛素抵抗现象(论文待发表)。肝脏的缺血再灌注损伤本质上主要是因缺血缺氧、脂质过氧化自由基大量生成造成的肝实质细胞遭受过氧化损伤,离体肝实质细胞在过氧化损伤时是否存在胰岛素抵抗现象尚有待进一步证实。为证实过氧化损伤是否确实会引发肝细胞出现胰岛素抵抗现象,以及其发生机制,本课题试图在体外实验中利用过氧化氢(H202)处理人正常肝细胞(L02细胞)制作过氧化损伤模型,观察L02细胞在遭受过氧化损伤时过氧化损伤指标丙二醛(MDA)、胰岛素抵抗指标培养基中残余葡萄糖、凋亡指标膜联蛋白V (Annexin5)表达、细胞的生存率及细胞形态学的变化、InsRβ及AKT的表达,证实L02细胞过氧化损伤时是否存在受体及受体后水平葡萄糖利用障碍的胰岛素抵抗现象,初探其可能机制,为临床上防治缺血再灌注损伤提供新思路。材料和方法： 1.材料：L02细胞购自中国典型培养物保藏中心(武汉),过氧化氢购自国药集团化学试剂有限公司,Dmem/High Glucose培养基和改良型RPMI-1640培养基购自Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;批次号：110311;胰酶购自Amresco,货号：0457;葡萄糖测定试剂盒购自上海名典生物工程有限公司;丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒购自南京建成科技有限公司。 2.细胞培养：①培养瓶中的细胞覆盖率达到80%-90%时进行传代。②吸弃原有培养基,加入2ml的PBS清洗细胞后弃掉。③加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行),消化1-2分钟。④细胞都变圆后吸出胰酶终止消化。⑤加入3ml的完全培养基,移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来。⑥把细胞传到3个相同规格的培养瓶中,置于37℃,5%C02培养箱中继续培养。⑦以生长稳定的3-5代细胞制备细胞悬液,接种于6孔板,每孔细胞数约为5×105个,用于实验。 3.实验分组：实验设3组：①A组：L02细胞正常培养24h不加H2O2处理,②B组：L02细胞正常培养24h后力160μmol/LH2O2,③C组：L02细胞正常培养24h后加入517μmol/LH202。分别于0、12、24h收集细胞及上清,采样待测。 4.过氧化损伤模型的制作：预实验——用不同浓度的H202作用于L02细胞,Oh、12h、24h后MTT试验计算其抑制率,据结果选取合适的浓度160μmol/LH2O2(24h抑制率为35.8%)、517μmol/L(24h抑制率为50%)用于试验。接种细胞于6孔板,培养24h后,分别加入不同浓度的H202,制作不同程度的细胞过氧化损伤模型。 5.葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)检测细胞上清液残余葡萄糖含量：将试剂1与

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Livin、Survivin和Ki-67蛋白在胆囊腺癌组织中的表达及临床意义

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作者：王峰波南方医科大学

学位级别：硕士

背景：胆囊腺癌是最常见的胆道系统恶性肿瘤,恶性度高,早期诊断困难,药物治疗效果差,死亡率高。胆囊腺癌的发生、发展是一个多基因联合作用的结果,对参与其中的各种癌基因和抑癌基因不断的研究,并寻找对胆囊腺癌早期诊断、治疗和预后... 详细信息

背景：胆囊腺癌是最常见的胆道系统恶性肿瘤,恶性度高,早期诊断困难,药物治疗效果差,死亡率高。胆囊腺癌的发生、发展是一个多基因联合作用的结果,对参与其中的各种癌基因和抑癌基因不断的研究,并寻找对胆囊腺癌早期诊断、治疗和预后判断等方面有效的方法,已成为当前研究的热点。越来越多的研究显示与细胞恶性增殖和分化受阻一样,凋亡异常在大多数恶性肿瘤的发病学上亦占有重要地位。凋亡在正常情况下用来消灭DNA受损或细胞循环周期失调的细胞。肿瘤细胞的增殖率并不总是高于相应的正常细胞,这表明肿瘤细胞的积累是细胞逃过“凋亡排除”作用的结果。凋亡调控失调可以异常地延长细胞的生存时间,促进有转化作用的基因突变的积累,从而参与肿瘤的发生。所以肿瘤不仅是细胞增殖分化异常疾病,也是凋亡异常疾病。凋亡抑制蛋白参与抑制细胞凋亡、调节着细胞分裂、细胞周期及信号传导等多个重要环节,与肿瘤的发生、发展关系甚为密切。 Survivin和Livin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子,Survivin和Livin在癌组织中的表达与恶性肿瘤的侵袭性、预后均有一定关系。作为一个新的凋亡抑制蛋白,Survivin和Livin在凋亡调节中起着重要作用。与其它的凋亡抑制蛋白家族成员不同,Survivin和Livin在人胚胎组织中高度表达并参与胚胎发育过程中的组织分化和器官形成,在终末分化的成人组织中未有检出,但广泛表达于多种肿瘤组织。研究表明,在许多恶性实体瘤如肺癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌和胃肠癌以及一些造血系统恶性肿瘤中均有很强的表达。近年来,Livin和Survivin在消化系肿瘤中的研究更是取得了很大的进展,但关于胆囊癌的研究较少,尤其是Livin与胆囊腺癌的研究未见文献报道。目的：本文应用免疫组化的方法检测Livin、Survivin和Ki-67在胆囊腺癌组织中的表达情况,探讨它们与患者临床特征之间的关系,并分析它们之间的相关性。方法： 1.收集制作标本所有病例均来源自广州军区武汉总医院2007年至2011年期间收治的胆囊癌病例,选取手术切除后病理诊断明确,术前均未行放化疗且保存完好的存档组织蜡块。选取的40例胆囊腺癌病例,其中男性11名,女性29名;年龄<55岁者17例,≥55岁者23例;肿瘤直径<2cm者16例,≥2cm者24例;根据国际抗癌联盟TNM分期：Ⅰ期4例,Ⅱ期13例,Ⅲ期11例,Ⅳ期12例;25例患者伴发胆囊结石,15例无结石;病理分级：高分化6例,中分化10例,低分化24例;淋巴结转移阴性19例,阳性21例。随机抽取20例同期因胆囊息肉手术切除的胆囊组织(取病变范围外2cm并且病理证实无炎症、化生及增生性病变)作为对照组。本实验选取的病例均已取得患者及其家人的知情同意,并签署知情同意书。 ***染色60℃烤片30min,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水;磷酸盐缓冲液(PBS)洗5min,反复3次;苏木素染色液染色5min;自来水冲洗去多余的染色液,约10min,蒸馏水洗涤;盐酸酒精分化30秒;自来水冲洗,浸泡15min;伊红染色液染色30s-2min(根据染色结果和要求调整时间);梯度酒精脱水,甲苯透明,中性树胶封片。 3.免疫组化染色60℃烤片30min,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水后,对组织抗原进行高温热修复;室温下冷却至常温;磷酸盐缓冲液洗5min,共3次,加3%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶活性;磷酸盐缓冲液洗2min,共3次;滴加非免疫性动物血清阻断非特异性结合,20min后甩去封闭液加一抗4℃保湿,过夜;磷酸盐缓冲液洗5min,共3次,滴加二抗,室温孵育30min;磷酸盐缓冲液洗2min,共3次;滴加试剂SABC,室温下20min,磷酸盐缓冲液洗5min,4次;DAB显色,自来水终止反应并冲洗5min;苏木素轻度复染,清水冲洗;梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 4.数据测量胆囊组织中Livin和Survivin表达的判断以胞浆和(或)胞核出现棕黄色染色为阳性,Ki-67的阳性表达为细胞核染成棕黄色。在经过免疫组化染色成功后,通过HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统观察,每例每个指标在肿瘤区域随机选取5个高倍视野(×400)采集图片,应用免疫组化测量程序测量三种指标Livin、Survivin和Ki-67的具体表达参数。本实验中选取平均阳性单位值(PU)来比较各标本的阳性表达差异。 5.统计学分析将测量结果以及临床资料建立数据库,采用SPSS13.0统计软件包对数据进行统计学处理。组间差异比较采用独立样本T检验,指标之间的关联性采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果： 1. Livin、Survivin和Ki-67在胆囊腺癌及正常胆囊组织中的表达 Livin蛋白在胆囊组织中的表达：在胆囊腺癌标本中可

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肝脏缺血再灌注时MIP-1α和HIF-1α表达的时空相关性分析和意义探讨

肝脏缺血再灌注时MIP-1α和HIF-1α表达的时空相关性分析和意义探...

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作者：刘志超南方医科大学

学位级别：硕士

肝脏是机体最大的实质性器官,接受25%的心脏输出血液,具有门静脉和肝动脉双重血供,供血量非常丰富。自1908年Pringle报道在肝切除术中应用控制肝十二指肠韧带的止血方法以来,肝脏对缺血耐受的时限及肝内不同细胞群体对缺氧的耐受性差别... 详细信息

肝脏是机体最大的实质性器官,接受25%的心脏输出血液,具有门静脉和肝动脉双重血供,供血量非常丰富。自1908年Pringle报道在肝切除术中应用控制肝十二指肠韧带的止血方法以来,肝脏对缺血耐受的时限及肝内不同细胞群体对缺氧的耐受性差别受到普遍关注,至今仍有较大争论。肝脏缺血再灌注常见于创伤、休克、及多种复杂肝脏手术,特别是用Pringle手法阻断肝血流切除大的肝内病灶和肝移植手术。在肝脏血供恢复后,肝脏受到进一步的“打击”,发生缺血再灌注损伤(hepatic ischemical reperfusion injury, HIRl)。HIRI发生机制复杂,炎症反应被认为是HIRI的实质。肝脏缺血再灌注时肝细胞发生代谢功能障碍,各种炎性因子生成,大量氧自由基生成,同时门静脉系统淤血,肠粘膜屏障功能障碍。再灌注后含有毒素的门静脉血流入肝产生损害作用,激活免疫细胞分泌大量炎性介质,炎性介质反向促进免疫细胞的激活。炎性介质和缺氧状态作用于肝脏细胞并可能产生复杂的病理生理过程。本文主要通过观察肝缺血再灌注不同时限大鼠肝脏和小肠的病理形态学变化及检测肝脏及小肠标本中的巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflamationg protein-1 a,MIP-1α)、缺氧诱导因子1 a (hypoxia inducible factor-1 a, HIF-1 a)的表达变化,探讨其相关性,并对二者在肝缺血再灌注损伤发生中的意义及相关机制进行探讨。目的通过建立SD大鼠肝脏缺血-再灌注损伤模型,观察大鼠肝脏缺血45min后再灌注不同时限肝脏及小肠的病理形态学变化,免疫组织化学方法检测MIP-1α和HIF-1a在肝脏及小肠组织中的表达情况,观察MIP-1a和HIF-1a在HIRI时表达的时空分布特点,进一步了解炎性损伤及氧化应激在肝脏缺血及再灌注时对肝脏缺血所致的消化道淤血性损伤以及后者对肝脏的再灌注损伤时发挥的作用。方法 1.实验分组成年健康SD雄性大鼠55只,随机分为三组：正常组(n=5)、缺血再灌注组(n=25)、假手术组(n=25),缺血再灌注组和假手术组又根据缺血再灌注后不同时限点(0h、3h、12h、24h、72 h)随机分为5个亚组,每组5只。 2.动物模型建立术前禁食12h,自由饮水;正常组：处死后进腹直接取材。缺血再灌注组：术前处理同正常组,行腹腔内注射麻醉(3%戊巴比妥钠40mg/kg),取上腹3 cm正中切口,进入腹腔游离并用无损伤动脉钳夹闭肝蒂45min后放开动脉钳,再灌注0h组进腹后直接取材,其余大鼠切口给予缝合,继续饲养,于各再灌注时限点(3h、12h、24h、72h)取材。假手术组：术前处理及麻醉方法同缺血再灌注组,进入腹腔后仅游离肝蒂但不阻断,取材方法及时限点同缺血再灌注组。 3.观察指标与方法①光镜下病理变化观察：10%福尔马林固定大鼠肝脏及小肠标本(上段空肠组织长约5cm),梯度酒精脱水,石蜡包埋后,常规连续切片。切片行HE常规染色。②超微病理变化观察：肝脏及小肠电镜标本取材后放于3%戊二醛中固定20min修块取材,SPURR低粘度包埋剂浸透包埋聚合。组织标本行扫描电镜观察。③MIP-1α和HIF-1a表达检测——免疫组织化学SABC法：检测试剂盒购于武汉博士德生物制品公司。MIP-1a免疫组化结果以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达。HIF-1a阳性判断标准为胞质棕黄色颗粒沉着,少量核染色。每张切片取10个200倍视野运用HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统行免疫组化染色阳性反应产物定量分析,记录阳性单位(positive unit, PU),并取其平均值,以PU值表示阳性产物表达的多少。 4.统计处理所有计量数据均以平均值±标准差(x±s)表示,计算基本统计量,所有实验组用析因设计的方差分析比较主效应和交互效应后,多重比较采取LSD法进行检验,P<0.05表示结果具有统计学意义。双变量相关分析(Bivariate)两变量间相关性。采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,P<0.05代表有统计学意义。结果 ***染色光镜下观察：正常组及假手术组的肝脏结构基本完整。缺血45min再灌注即时可见肝细胞轻度水肿,肝窦间隙开始狭窄;3h时可见肝细胞肿胀,胞质半透明、疏松呈网状;12h时肝细胞呈弥漫性肿大,水样变,肝小叶内可见点状坏死与嗜酸性小体形成;24h时肝细胞损伤最重,可见肝小叶变形,肝板破坏,部分出现片状坏死;72h时可见肝窦间隙狭窄减轻,肝小叶重构。正常组小肠结构完整,再灌注0h可见小肠上皮下间隙扩大,毛细血管充血,上皮与固有层出现分离,腺体轻度受损;3h腺体受损明显,伴部分顶部绒毛脱落;12h上皮与固有层分离明显,大部分腺体受损,毛细血管开始扩张;24h绒毛明显脱落,固有层部分消化、

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丹参对大鼠肝脏缺血再灌注时活化转录因子6α表达的影响及意义

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作者：徐志广南方医科大学

学位级别：硕士

肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia and reperfusion injury,HIRI)常继发于严重创伤、失血性休克所致肝缺血后、肝脏大手术需行肝门阻断、肝脏移植术后,是由多重因素造成的一个复杂的病理生理过程。目前研究发现,内质网应激(endoplasmi... 详细信息

肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia and reperfusion injury,HIRI)常继发于严重创伤、失血性休克所致肝缺血后、肝脏大手术需行肝门阻断、肝脏移植术后,是由多重因素造成的一个复杂的病理生理过程。目前研究发现,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在一定程度上具有细胞自我保护作用,适度的ERS会启动细胞生存途径,但应激反应程度过强或时间过长,ERS会导致组织损伤,使细胞发生凋亡和坏死。已发现ERS介导的细胞凋亡在肝脏缺血再灌注损伤过程中起着重要的作用。研究证实：肝缺血再灌注时应用丹参(Radix Salvia miltiorrhiza,RSM)预处理,可通过减轻钙超载和脂质过氧化自由基损伤发挥细胞保护作用,但其作用是否与调节ERS有关尚不得而知。本实验通过观察大鼠肝脏缺血再灌注时RSM对活化转录因子6a(activating transcription factor-6α,ATF-6α)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Cysteinylasparate specific proteinase-12, Caspase-12)表达的影响,探讨其是否可通过调节内质网(endoplasmic reticulum, ER)稳态发挥肝保护作用。目的建立大鼠肝脏缺血再灌注模型,观察活化转录因子6α(ATF-6α)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)在大鼠肝脏缺血45min再灌注不同时限的表达情况及丹参对其表达的影响,探讨肝脏缺血再灌注时活化转录因子6α(ATF-6a)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)的差异表达、丹参对ERS的具体调节机制。方法 1.健康雄性Wistar大鼠80只随机分为正常对照组(n=5只)、假手术组(n=25只)、缺血再灌注组(n=25只)和丹参预处理组(n=25只),假手术组、缺血再灌注组及丹参预处理组又按不同再灌注时限(Oh、3h、12h、24h、72h)分为五个亚组,每组5只大鼠。 2.正常对照组断颈处死后开腹切取肝组织;实验各组大鼠以3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔内注射麻醉,取上腹正中切口,假手术组仅解剖肝门不钳夹肝蒂;缺血再灌注组进腹后向上牵开肝脏,显露并游离肝十二指肠韧带,在肝十二指肠韧带远心端安置无损伤动脉钳钳夹肝蒂45min后去除动脉夹、使血液复流,制备缺血再灌注损伤模型。假手术组和缺血再灌注组断流前30min经尾静脉注入生理盐水40ml/kg;丹参预处理组动物模型制备同缺血再灌注组,断流前30min经尾静脉推注丹参注射液6ml/kg(正大青春宝药业公司,批准文号：国药准字Z33020177)加生理盐水稀释至40ml/kg。实验各组大鼠于不同再灌注时限断颈处死,开腹切取肝组织分别置于10%甲醛中固定和液氮中保存待检。 3.大鼠肝脏标本取材后左外叶经10%福尔马林固定,用于HE染色及免疫组织化学染色。中叶置于液氮中保存,用于免疫印迹法(Western blot)检测ATF-6α及Caspase-12蛋白的表达。 ***染色及免疫组织化学均按试剂盒内操作步骤进行,兔抗大鼠ATF-6α和Caspase-12的工作浓度为1：100,均购于武汉博士德生物工程有限公司。 5.光镜下进行病理组织学观察,免疫组织化学SABC法检测ATF-6α及Caspase-12在肝脏不同缺血时限的表达量,采用Image pro-plus6.0软件分析免疫组化图片方法：每组内每张切片随机挑选10个200倍视野进行拍照,对每张照片进行分析得出每张照片阳性细胞的积分光密度值(IOD)。 6.免疫印迹法(Western blot)检测各组ATF-6α及Caspase-12蛋白的表达：兔抗大鼠p-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(Santa Cruz生物公司),兔抗大鼠ATF-6α单克隆抗体(Santa Cruz生物公司),兔抗大鼠Caspase-12单克隆抗体(Santa Cruz生物公司),超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所),PVDF膜(Millipor公司),柯达医用X射线胶片(Kodak公司)。各组织块于-80℃冰箱保存,加细胞裂解液提总蛋白,用Bradford法进行蛋白定量。取等量样品40gg,在蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液使其终浓度为1×,95℃处理5min。蛋白质变性处理,SDS-PAGE电泳分离,转移至PVDF膜,转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配)封闭1h之后加入一抗(1：500稀释)4℃过夜;用硫代巴比妥酸(TBS)缓冲液洗涤3次,每次5min;加入标记的二抗(1：3000稀释)室温孵育1h,用化学发光法Eclplus显色,X线底片曝光,将胶片进行扫描,用Alp

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大鼠肝脏缺血再灌注不同时限信号转导与转录激活子1的表达及意义

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作者：廖喜望南方医科大学

学位级别：硕士

肝脏缺血-再灌注损伤(hepatic ischemia with reperfusion injury,HIRI)常见于肝脏移植、失血性休克、创伤等情况,HIRI发生机制复杂。肝脏中度缺血及再灌注早期损伤多较轻微,肝细胞轻度肿胀,少数水样变性,肝功能指标无显著性改变。而中... 详细信息

肝脏缺血-再灌注损伤(hepatic ischemia with reperfusion injury,HIRI)常见于肝脏移植、失血性休克、创伤等情况,HIRI发生机制复杂。肝脏中度缺血及再灌注早期损伤多较轻微,肝细胞轻度肿胀,少数水样变性,肝功能指标无显著性改变。而中度以上缺血,随再灌注时间延长,血管收缩,血小板聚集引起微循环再灌注不足,能量供给障碍造成肝细胞、内皮细胞以及Kupffer细胞肿胀,进一步对肝脏的微循环造成了严重损害,继而引起Kupffer细胞和中性粒细胞活化,产生炎性细胞因子和氧自由基。这些物质作用于细胞并产生相应生物学效应是较复杂的病理生理过程。细胞内信号转导通路在该过程中起桥梁作用,近期研究显示Janus激酶信号转导与转录激活子(Januskinase signal transduc-ers and activators of transcription,JAK-STAT)信号转导通路参与了HIRI,并与细胞凋亡有关。本实验研究肝脏缺血45min再灌注不同时限JAK-STAT信号通路中STAT1及caspase3在肝细胞的表达情况,并观察丹参对其影响。目的建立大鼠肝脏缺血-再灌注损伤模型,观察JAK-STAT信号通路蛋白STAT1和Caspase3在大鼠肝脏缺血45min再灌注不同时限的表达情况及丹参对两者表达的影响。探讨JAK-STAT信号通路在HIRI中的作用,进一步了解HIRI的信号转导机制,旨在为治疗HIRI提供新的思路。方法1、成年健康SD雄性大鼠80只,随机分为四组:正常组(n=5)、缺血-再灌注组(n=25)、假手术组(n=25)、丹参组(n=25),后3组又根据再灌注后不同时间(0h、3h、12h、24h、72h)随机分为5个亚组,每组5只。2、正常组:术前30min经尾静脉注入生理盐水40ml/kg,以3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔内注射麻醉,取上腹正中切口长约3 cm,进腹后直接取材。缺血-再灌注组:术前输液同前,进入腹腔游离肝蒂后,用无损伤动脉钳夹闭,全血流阻断45min后撤除动脉钳,分别于复流0h、3h、12h、24h、72h取材。假手术组:术前输液同前,进入腹腔后仅游离肝蒂但不阻断,与缺血-再灌注组相同时限点取材。丹参组:丹参注射液6g/Kg加生理盐水至40ml/Kg,术前30min经尾静脉推入,余麻醉、手术方法及取材同上。3、大鼠肝脏标本取材后经10%的福尔马林固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋,常规制备4μm厚连续切片。电镜标本取材后即放入预先配置的3%戊二醛中固定20min后进行修块取材。4、肝脏标本切片按HE常规染色步骤进行染色。STAT1与Caspase-3免疫组化检测试剂盒购于武汉博士德生物制品公司,免疫组织化学采取SABC法,实验步骤按试剂盒内说明书进行,一抗浓度为1:100。5、STAT1免疫组化结果以细胞核或细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达,Caspase-3阳性判断标准为胞质内出现棕黄色颗粒。各组切片均采用HPIAS—1000高清晰彩色病理图像分析系统对免疫组化染色阳性反应产物进行定量分析。每张切片取10个200倍视野记录阳性单位(positive unit,PU),取其平均值,以PU值大小代表阳性产物表达的多少。6、数据以平均值±标准差((?)±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,采取析因设计方差分析分析主效应与交互效应后,SNK法检验各组间差别。两个变量间相关性分析采用双变量相关分析(Bivariate)。P＜0.05代表有统计学意义。结果1、STAT1在正常与假手术组各时限点肝脏细胞内未见明显表达,两组比较无显著性差异(P＞0.05)。缺血-再灌注组再灌注0h STAT1在靠近中央静脉区周围肝细胞浆内出现STAT1棕色淡染颗粒,随再灌注时间延长,STAT1表达细胞逐渐增多,汇管区亦出现表达,12～24h表达最显著,72h尚有表达。丹参组STAT1较同期缺血-再灌注组低(P＜0.05)。(见表1)2、Caspase3在正常组及假手术组未见明显表达,两组比较无显著性差异(P＞0.05)。再灌注0h在肝窦内皮细胞及中央静脉周围肝细胞中可见表达,随再灌注时间的延长,肝细胞表达逐渐增多,在再灌注24 h达到峰值,72 h回落至基线水平。丹参组Caspase3阳性表达均显著低于同期缺血-再灌注组(P＜0.05)。(见表2)3、缺血-再灌注组,STAT1与caspase3呈显著正相关关系(P＜0.01);丹参组,STAT1与csapase3呈显著正相关关系(P＜0.01)。4、HE染色光镜下观察:正常组及假手术组的肝脏结构基本完整,肝细胞连续成

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