SHH、E-cadherin和IL-6在慢性结石性胆囊炎组织中的表达及其意义

作     者：孙世波 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：卢绮萍

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：慢性结石性胆囊炎 胆囊癌 Sonic hedgehog E-cadherin IL-6 

摘      要：背景和目的： Sonic Hedgehog(SHH)分泌信号分子家族在早期胚胎发育、器官分化过程中发挥重要的调控作用,通路的异常激活还与人类肿瘤的发生与演进密切相关。SHH蛋白是由SHH基因编码的一种高度保守的分泌型糖蛋白。上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)是一类广泛分布于胚胎和成熟组织上皮组织介导细胞间同质粘附的钙依赖性单次跨膜糖蛋白,是在生理条件下维持组织结构形态的完整性和细胞极性的重要成分。白细胞介素-6(interleukin-6)是细胞因子网络中重要成分之一,亦是一种多功能的细胞因子,通过复杂的细胞信号传导途径,对细胞生长、分化、凋亡、转化及免疫反应等过程都具有重要的调节作用。最近越来越多的研究显示,SHH信号通路的异常激活和过度表达、E-cadherin表达减弱或缺失及IL-6的失调控参与多种肿瘤的发生过程,但SHH信号通路、E-cadherin和IL-6在炎症疾病尤其是结石性胆囊炎组织中的作用在国内尚无报道。本课题拟通过对慢性结石性胆囊炎、胆囊癌组织标本中SHH、E-cadherin和IL-6表达水平的同步观察,探讨慢性结石性胆囊炎向胆囊癌发展转化机制,目的旨在寻找胆囊癌特异性分子标志物,以利早期诊断及特异性靶向治疗。 材料和方法： 1.胆囊炎标本的收集：选取广州军区武汉总医院2005年1月至2010年12月间经病理确诊、且术后病理蜡块保存完好的慢性结石性胆囊炎患者术后的组织标本120例,其中男性48例,女性72例,平均年龄51.8岁。其中轻度慢性结石性胆囊炎45例,中度慢性结石性胆囊炎45例,重度慢性结石性胆囊炎30例。对照组为囊腺癌患者术后组织标本(36例),男性20例,女性16例,平均年龄61.4岁,手术前均未放疗或化疗。 2.常规HE染色判断胆囊炎分级：60℃烤片30min,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水;磷酸盐缓冲液(PBS)洗5min,共3次;苏木素染色液染色5min;自来水冲洗去多余的染色液,约10min,蒸馏水洗涤;盐酸酒精分化30s;自来水冲洗,浸泡15min;伊红染色液染色30s-2min(根据染色结果和要求调整时间);梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。慢性结石性胆囊炎分级标准：轻度：病程5年;B超检查提示有胆囊体积的萎缩或增大,有胆囊壁弥漫性或局限性(结节状)增厚,多伴有息肉样病变;病理检查显示黏膜上皮部分或大部分脱失,未脱失的腺上皮细胞形成代偿性区域性增生集中,增生的腺体有不规则的扩张,腺上皮细胞增生活跃。增厚的胆囊壁组织内形成单个腺管及多个腺管的异型增生灶,炎细胞浸润程度重,淋巴滤泡形成,纤维结缔组织增生,多有罗-阿氏窦下延,黏液腺分泌增强。 3.免疫组化法检测组织标本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白表达：60℃烤片30mmin,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水后,对组织抗原进行高温热修复;室温下冷却至常温;磷酸盐缓冲液(PBS)洗5min,共3次,加3%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶活性;磷酸盐缓冲液(PBS)洗2mmin,共3次;滴加非免疫性动物血清阻断非特异性结合,20min后甩去封闭液加一抗4℃保湿,过夜;PBS洗5min,共3次,滴加二抗,室温孵育30min;PBS洗2min,共3次;DAB显色,自来水终止反应并冲洗5min;苏木素复染,清水冲洗;梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 4.病理图像分析定量检测组织标本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白含量：切片经免疫组化染色完成后,每张切片随机选取5个不同高倍视野(×400)进行拍照。免疫组织化学染色图像分析检测：在光镜下观察指标：免疫复合物沉积部位及免疫反应强度的观察。阳性判断标准：当细胞膜和(或)胞浆出现棕黄色阳性物质作为阳性细胞。观察参数：慢性结石性胆囊炎和胆囊癌组织中E-cadherin和IL-6表达的阳性颗粒的参数值——平均灰度、阳性单位。图像分析及数据统计分析：在400倍视野下,每张玻片选取5个视野,采用武汉千屏公司HMIAS-2000高清晰度彩色病理图片报告分析系统测定阳性颗粒的平均灰度和阳性单位值。 5.统计学分析：运用SPSS13.0软件进行统计学分析。胆囊炎、胆囊癌组织SHH、IL-6、E-cad蛋白表达的阳性单位、平均灰度值以x±s表示,采用单因素方差分析进行了完全随机设计的方差分析(方差齐时采用Fisher法,其中两两比较采用LSD法;方差不齐时采用Welch法,其中两两比较采用Dunnett T3法)及Pearson相关分析,以F为统计量,以双侧a=0.05作