检索结果-南通市图书馆

作者：吴泽彬广东财经大学

学位级别：硕士

“十四五”规划和2035年远景目标纲要中明确指出,要完善金融支持创新体系,鼓励发展天使投资、创业投资,更好发挥创业投资引导基金和私募股权基金的作用。创业投资的发展有利于企业科技创新、市场开拓和高层次技术人才的培养,也利于国家... 详细信息

“十四五”规划和2035年远景目标纲要中明确指出,要完善金融支持创新体系,鼓励发展天使投资、创业投资,更好发挥创业投资引导基金和私募股权基金的作用。创业投资的发展有利于企业科技创新、市场开拓和高层次技术人才的培养,也利于国家科技进步和产业结构升级调整等。投资抵扣政策作为政府采用税收手段促进创业投资发展和引导创业投资方向的重要工具,研究投资抵扣政策对于创投企业投资的影响具有重要的理论意义。随着2017现行投资抵扣政策进行试点实施,从微观投资事件视角对现行投资抵扣政策进行研究,对后续政策完善也具有重大的现实意义。本文以(财税[2017]38号文)为背景,基于11个试点地区创业投资事件数据,采用双重差分模型(DID)研究投资抵扣政策对于创投企业投资的影响,并进一步研究不同组织形式的创投企业受投资抵扣政策的影响。实证研究结果表明;(1)投资抵扣政策能够促进创投企业对种子期、初创期的科技型企业的投资;(2)相较于公司制,投资抵扣政策对于有限合伙制创投企业的激励效应更大。最后,本文根据实证研究结果和借鉴英美两国相关税收政策提出建议:(1)引入税收事先裁定认定创业投资企业投资抵扣条件;(2)实施差异化抵扣率;(3)降低投资抵扣优惠政策门槛;(4)降低公司制创投企业税负。

关键词：创业投资投资抵扣税收优惠投资影响

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环境税对制造业企业绿色创新绩效影响研究

环境税对制造业企业绿色创新绩效影响研究

作者：廖奕奕广东财经大学

学位级别：硕士

制造业作为我国国民经济的主体,正面临着污染量排放增加和资源枯竭的双重压力,制约了我国经济的可持续发展。要实现我国经济和生态保护双赢,需要从生态和创新两方面着手。制造业绿色创新绩效提高需要有完善的政策机制来保障。为此,我国... 详细信息

制造业作为我国国民经济的主体,正面临着污染量排放增加和资源枯竭的双重压力,制约了我国经济的可持续发展。要实现我国经济和生态保护双赢,需要从生态和创新两方面着手。制造业绿色创新绩效提高需要有完善的政策机制来保障。为此,我国环境税体系在不断调整改革步伐,希望通过环境税的激励和挤压双重作用,将污染问题经济化,充分发挥税收杠杆的绿色调节作用。本文以A股上市的2015-2019年303家企业为研究对象,基于投入和产出视角建立制造业绿色创新绩效评价体系,利用DEA—SBM模型测算出对绿色创新绩效的具体数值,实证研究环境税与绿色创新绩效的非线性关系,并进一步考察不同财税政策组合对绿色创新绩效的效应,以及所有权的异质性分析,得出结论:我国环境税与绿色创新绩效呈现“U”型的非线性关系;环境税通过企业研发投入这一中介效应对绿色创新绩效发挥效应;环境税与环保补贴、税收优惠的结合可以发挥出政策协同效应;相比国有企业,非国有企业对环境税的传导机制更加敏感。基于上述分析,本文最后分别从税制、政府和产业三个层面对我国环境税驱动制造业企业绿色创新绩效提出政策建议。

关键词：环境税绿色创新绩效制造业企业

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政商关系对企业纳税遵从的影响

政商关系对企业纳税遵从的影响

作者：王慧梅广东财经大学

学位级别：硕士

党二十大明确提出了“全国人民迈上全面建设社会主义现代化国家的新征程”的目标,要实现这一目标的前提是国家治理体系的现代化。税收征管是现代化国家治理重要的工具,也是实现全面社会主义现代化国家重要政策的制度保障。纳税人税收遵... 详细信息

党二十大明确提出了“全国人民迈上全面建设社会主义现代化国家的新征程”的目标,要实现这一目标的前提是国家治理体系的现代化。税收征管是现代化国家治理重要的工具,也是实现全面社会主义现代化国家重要政策的制度保障。纳税人税收遵从治理能力则是近年来国家税收治理改革关注的重点。然而,数字化经济的到来,使得企业偷税漏税行为屡禁不止,如何以较低的税收征管成本提升纳税人的税收遵从程度,一直以来都是各国政府尤其是税务机关面临的急需解决的重要难题。制度理论认为,制度变化会左右企业的战略决策。企业纳税遵从这一行为不可避免地会受到政商关系这一重要制度影响。近年来,随着反腐败斗争、“放管服”改革以及营商环境优化建设等的深入和普及,政商关系正向着“亲清”的理想状态转变。政商关系的良性演变必然对企业的纳税遵从行为产生积极且深远的影响。不同于以往学者关于企业纳税遵从影响因素的研究,本文从新型政商关系这一崭新视角切入,丰富该领域现有的研究思路,旨在探讨以“亲近”和“清白”为特点的新型政商关系对企业纳税遵从行为的影响。以2017年至2021年间,2635家中国上市公司的9892份样本数据,结合中国城市政商关系指数,采用双向固定效应模型实证分析考察了“亲清”政商关系对企业纳税遵从的影响。研究结果表明“亲清”政商关系能够显著促进企业纳税遵从度,并且相较于国有企业,这一促进作用在非国有企业更加显著;以及相较于中部地区企业,东部地区与西部地区企业纳税遵从度受“亲清”政商关系的影响程度较为显著。研究结论可为政府通过积极建设新型政商关系,促进企业纳税遵从度的提升提供经验证据,因此本文的研究具有重要的现实意义。

关键词：企业纳税遵从新型政商关系政治关联税收征管

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环境保护税对经济高质量发展的影响效应研究

环境保护税对经济高质量发展的影响效应研究

作者：吕春洋广东财经大学

学位级别：硕士

改革开放四十年来,伴随着经济的迅速发展,我国面临着严峻的环境污染问题,急需政府采用强制手段治理污染,提升生态环境质量。我国《环境保护税法》于2018年正式实行,探讨如何完善环境保护税进而对经济高质量发展发挥出更好的促进作用,对... 详细信息

改革开放四十年来,伴随着经济的迅速发展,我国面临着严峻的环境污染问题,急需政府采用强制手段治理污染,提升生态环境质量。我国《环境保护税法》于2018年正式实行,探讨如何完善环境保护税进而对经济高质量发展发挥出更好的促进作用,对于进一步完善我国绿色税收制度具有现实指导意义。本文运用理论和实证两种方法,结合全国30个省份2003-2021年数据,研究了征收环境保护税对经济高质量发展的影响。首先,本文对环境保护税与经济高质量发展的相关概念进行了阐述。其次,本文从新发展理念5个子维度分析环境保护税征收的政策效果,构建指标体系测算各省份经济高质量发展水平,并分地区、分子系统进行了横向对比。最后,本文运用固定效应模型进行实证分析,并拓展性研究了市场化程度的调节作用。本文研究结论如下:(1)环境保护税对经济高质量发展的影响,应根据经济高质量发展子维度指标权重及总体何种机制更显著来判断。(2)我国经济高质量发展水平整体而言呈稳步增长态势。(3)现阶段环境保护税的实施为经济高质量发展带来了积极影响,子维度回归结果显示,环境保护税显著提升了创新、协调、绿色、共享发展水平,对于开放发展则表现为抑制作用。(4)环境保护税政策效果存在区域异质性。(5)市场化程度在环境保护税对经济高质量发展的影响中起到了调节作用。根据以上研究结论,本文提出如下建议:(1)合理制订税率。(2)完善税收优惠政策,激发企业技术创新活性。(3)从地区实际情况出发,进一步细化环境保护税征收标准。(4)发挥环境保护税与其他环境规制手段的复合作用。(5)搭建税务信息共享平台。

关键词：环境保护税经济高质量发展熵值法固定效应

曼陀罗内生细菌MY1的初步鉴定及对谷瘟病抑菌作用研究

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曼陀罗内生细菌MY1的初步鉴定及对谷瘟病抑菌作用研究

作者：石玉星山西农业大学

学位级别：硕士

本研究对植物组织中分离提取的多株内生菌进行了筛选,得到1株对谷瘟病菌及其他多种病原真菌有抑菌活性的曼陀罗内生细菌MY1,并对该菌株的分类学地位、发酵条件、代谢物理化性质、抑菌机理、抑菌活性物质及促生与生防作用等进行了研究,... 详细信息

本研究对植物组织中分离提取的多株内生菌进行了筛选,得到1株对谷瘟病菌及其他多种病原真菌有抑菌活性的曼陀罗内生细菌MY1,并对该菌株的分类学地位、发酵条件、代谢物理化性质、抑菌机理、抑菌活性物质及促生与生防作用等进行了研究,以期为微生物农药的技术开发与应用提供理论基础。具体研究成果如下:1.采用平板对峙法和生长速率法筛选出对谷瘟病菌具有高抑菌活性的内生菌株,对抑菌效果最好的菌株MY1进行抑菌谱测定,结果表明该菌株活体及其代谢产物对供试多种病原真菌均有良好的抑菌活性,尤其是能显著抑制黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)和桃褐腐病菌(***)的生长。通过菌株形态特征观察,生理生化鉴定以及16S rDNA序列分析,初步鉴定菌株MY1为甲基营养型芽孢杆菌(Bacills methylotrophicus)。2.采用比浊法测定菌株MY1的生长曲线,结果表明,MY1菌株发酵培养的第0～12 h为迟缓期,12～32h为对数期,32～56h为稳定期,56～72h为衰亡期。采用单因素试验法和正交试验法对MY1菌株培养液成分及培养条件进行优化,结果表明,发酵培养MY1的最佳基础培养液为BPY培养液,最佳碳源为乳糖,最佳氮源为牛肉膏+酵母粉,最适培养条件为:温度28℃,pH 9.0,装液量100 mL/500 mL,接种量2%,转速160 rmin-1,发酵时间96h。3.菌株代谢物物理性质及稳定性测定结果表明:MY1菌株代谢物的排油能力较好,且液滴在parafilm膜上明显出现坍塌现象,说明菌株代谢物中含有脂肽类物质,具有表面活性;MY1菌株代谢物的热稳定性较好,在酸碱性环境下非常稳定,抑菌物质对紫外光和自然光照射不敏感,可以耐受较长时间贮存。4.通过显微观察及电导率法对MY1菌株抑菌机制进行初探,结果表明:经MY1菌株代谢物处理后,谷瘟病菌(Pyriculariagrisea)菌丝出现生长异常,断裂,内含物质溢出等现象;同时***的细胞膜透性随着MY1代谢物处理时间的延长而增大,对细胞的破坏性加剧。6.对MY1菌株抑菌活性物质产生的检测结果表明:MY1菌株可以产生胞外蛋白酶和纤维素酶,不能够产生几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、吲哚-3-乙酸,不具有溶磷能力。7.采用浸种法和灌根法测定MY1菌株代谢物对谷子种子萌发和幼苗生长的影响,结果表明代谢物原液处理谷子种子的发芽指数最高;以2 0X稀释液对幼苗的促生效果最佳,谷子幼苗的各项生长指标也较对照组分别提高了 30.15%、36.84%、20.25%、42.11%,而高浓度处理时则会出现不同程度的抑制作用;经测定不同浓度MY1代谢物处理后对谷子防御酶活性的影响表示,菌株MY1对于谷子植株防御酶活性的提高有一定的促进作用。

关键词：曼陀罗内生细菌菌株鉴定发酵条件优化物理性质稳定性抑菌机制促生生防

番茄和油菜内生菌的分离、筛选及对植物病原菌拮抗活性研究

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番茄和油菜内生菌的分离、筛选及对植物病原菌拮抗活性研究

作者：张立新山西农业大学

学位级别：硕士

本文对山西太谷、运城等地区采集的番茄和油菜生长期健康植株进行了内生菌的分离和拮抗病原真菌的平板筛选,内生细菌对番茄促生作用筛选,以及对拮抗性较强的菌株进行了代谢产物活性测定和菌株鉴定,并对灰霉病菌拮抗机理进行了初步研究。... 详细信息

本文对山西太谷、运城等地区采集的番茄和油菜生长期健康植株进行了内生菌的分离和拮抗病原真菌的平板筛选,内生细菌对番茄促生作用筛选,以及对拮抗性较强的菌株进行了代谢产物活性测定和菌株鉴定,并对灰霉病菌拮抗机理进行了初步研究。 1.从番茄和油菜体内共分离到95 株细菌,23 株真菌和8 株放线菌,并对内生菌进行了拮抗病原真菌平板筛选。结果表明:番茄和油菜体内均以细菌分离种数最多,真菌次之,放线菌最少。不同番茄品种体内分离的内生菌种数有差别。植株不同部位内生菌分离种数也不同,茎部分离真菌种数高于根部,而分离细菌种数少于根部。通过对内生菌拮抗病原真菌平板筛选,筛选出一批对病原真菌拮抗性较强的内生菌。内生细菌fq12 和yc8 两菌株对6 种病原真菌均有较强的拮抗活性,尤以对灰霉病菌和菌核病菌拮抗活性最强。内生真菌fq72 菌株对灰霉病菌和菌核病菌产生较宽抑菌带,表现出强烈的抑制作用。内生放线菌株对6种病原菌拮抗活性较小。 2.拮抗内生菌代谢产物活性测定表明,fq12 和yc8 两菌株发酵液高温处理后均对灰霉病菌和菌核病菌产生强烈的抑制作用,对其它4 种病菌也产生一定的抑制作用。fq72 菌株培养滤液对灰霉病菌和菌核病菌有强烈的拮抗活性,其培养滤液高温处理后抑菌活性不丧失。内生细菌对番茄幼苗促生测定结果表明,所分离的大部分细菌对番茄种子萌芽及根芽生长无抑制作用,部分菌株显示出对番茄幼苗具有显著的促生效果。fq65、fq29 两细菌能显著提高番茄种子出苗率、促进生长,增加幼苗鲜重和干重。

关键词：番茄油菜内生菌筛选拮抗作用促生作用鉴定代谢产物

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温度处理下麦长管蚜对吡虫啉敏感性的研究

温度处理下麦长管蚜对吡虫啉敏感性的研究

作者：裴秀芹山西农业大学

学位级别：硕士

温度是影响杀虫剂活性和药效的主要环境因素。本文以麦长管蚜作为靶标害虫,研究了低温预处理下麦长管蚜对吡虫啉的敏感性,高温预处理和后处理对麦长管蚜对吡虫啉敏感性的影响,亚致死浓度吡虫啉对麦长管蚜耐热性及F1代的影响;温度对麦长... 详细信息

温度是影响杀虫剂活性和药效的主要环境因素。本文以麦长管蚜作为靶标害虫,研究了低温预处理下麦长管蚜对吡虫啉的敏感性,高温预处理和后处理对麦长管蚜对吡虫啉敏感性的影响,亚致死浓度吡虫啉对麦长管蚜耐热性及F1代的影响;温度对麦长管蚜对吡虫啉敏感性影响的田间试验,结果如下： 1.与农药对照相比吡虫啉对5℃预处理2h麦长管蚜的毒力较低;5℃预处理降低了麦长管蚜对吡虫啉的敏感性,随着时间的延长效果越明显;5℃、10℃预处理都能降低麦长管蚜对吡虫啉的敏感性,但麦长管蚜对吡虫啉的敏感性随着温度处理与吡虫啉处理间隔时间的延长而减弱。 2.与农药对照相比吡虫啉对30℃预处理2h麦长管蚜的毒力较高;除30℃、35℃预处理60min可以降低麦长管蚜对吡虫啉敏感性外,30℃、35℃30、90、120min预处理提高了麦长管蚜对吡虫啉的敏感性,且随着时间的延长效果越明显;30℃、35℃预处理2h提高了麦长管蚜对吡虫啉的敏感性,但随着温度处理与用药间隔时间的延长而减弱;麦长管蚜经LC20吡虫啉处理2h后不同高温处理对麦长管蚜的死亡率有显著的影响,随着温度的升高麦长管蚜死亡率增加;麦长管蚜喷药2h后同一高温处理不同时间对麦长管蚜的死亡率有显著的影响,随着时间的延长麦长管蚜死亡率升高;亚致死浓度吡虫啉明显降低了麦长管蚜的耐热性、寿命和繁殖量,并且亚致死浓度吡虫啉使麦长管蚜产仔畸型,随着温度的升高畸型率升高,对F1代的寿命繁殖均无明显影响。 3)选择两个高温天（2013年5月20日、2013年5月20日）,在一天中不同时间进行喷药;结果表明5月20日不同时间施药对吡虫啉的药效影响不大;5月21日不同时间施药对吡虫啉的药效有一定的影响,其中14：00防效最高,17：00防效最低,分别为65.79%、38.60%。

关键词：麦长管蚜低温预处理高温预处理毒力敏感性

植物内生放线菌Fq24的分离筛选及生物活性初步研究

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植物内生放线菌Fq24的分离筛选及生物活性初步研究

作者：张姝山西农业大学

学位级别：硕士

本文从山西太谷、临汾、运城地区采集的番茄、辣椒、向日葵等健康植株中成功分离出15种内生放线菌。通过平板对峙培养和发酵液抑菌活性测定,筛选出对番茄灰霉病菌具较强拮抗作用的内生放线菌菌株Fq24。对该菌株做了初步鉴定,并对其发酵... 详细信息

本文从山西太谷、临汾、运城地区采集的番茄、辣椒、向日葵等健康植株中成功分离出15种内生放线菌。通过平板对峙培养和发酵液抑菌活性测定,筛选出对番茄灰霉病菌具较强拮抗作用的内生放线菌菌株Fq24。对该菌株做了初步鉴定,并对其发酵条件和代谢产物的生物活性进行了初步研究。结果如下: 1.结合形态观察和生理生化特征,初步认为Fq24属于链霉菌属直丝变种。通过与病原真菌平板对峙培养发现Fq24菌株对番茄灰霉病菌、核盘菌、番茄叶霉病菌、棉花炭疽病菌等均有拮抗作用;Fq24的发酵液对灰霉菌和核盘菌的抑制作用明显,抑菌率分别达到68.4%和88.2%。 ***24发酵液的培养基最适配方为:2%葡萄糖、2%大豆粉、3%玉米面、1%淀粉、0.1%牛肉膏、0.2%KNO、0.2%NaCl、0.03%MgSO、0.6%CaCO、0.02%KHPO,初始pH为6.5。培养条件为:接种量10%,装液量100mL/500mL瓶,温度28℃,转速160rpm,培养时间7d。 ***24代谢产物的生物活性研究表明:(1)低浓度的Fq24发酵液能提高番茄种子的发芽率(出苗率),促进植株生长,但高浓度降低发芽率(出苗率),抑制幼苗生长。(2)用Fq24发酵液处理过的番茄,其体内POD、SOD酶活性较对照(无菌水处理)明显上升。可见,Fq24的代谢产物对POD、SOD酶活性的提高有诱导作用。(3)对番茄灰霉病的盆栽试验表明,喷施Fq24发酵液可明显降低灰霉病的发病率,其中以间隔48h接种的防效最好,达到82.14%。

关键词：内生放线菌番茄灰霉病发酵代谢产物生物活性

辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯敏感基线的建立及其抗性风险评估

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辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯敏感基线的建立及其抗性风险评估

作者：曹俊宇山西农业大学

学位级别：硕士

辣椒炭疽病菌(Colletotrichum spp.)是辣椒种植中的严重病害,既可引起辣椒幼苗死亡也可危害果实,造成果腐,对辣椒的产量和品质影响很大。目前,化学防治仍然是控制辣椒炭疽病菌的重要手段。但杀菌剂的不合理使用,引起了辣椒炭疽病菌对多... 详细信息

辣椒炭疽病菌(Colletotrichum spp.)是辣椒种植中的严重病害,既可引起辣椒幼苗死亡也可危害果实,造成果腐,对辣椒的产量和品质影响很大。目前,化学防治仍然是控制辣椒炭疽病菌的重要手段。但杀菌剂的不合理使用,引起了辣椒炭疽病菌对多种药剂敏感性降低,甚至产生了抗药性。啶氧菌酯(picoxystrobin)属呼吸抑制类杀菌剂,在美国已经获得登记用于辣椒炭疽病等病害的防治,但在我国尚未普遍应用。迄今为止,国内外尚未见该病害对啶氧菌酯抗药性的研究报道。为此,本研究测定了辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯的敏感性,并建立了相对敏感基线;在此基础上诱导了辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯的抗性突变体、并对其适合度及生物学特性进行了研究,以期为啶氧菌酯防治辣椒炭疽病菌的科学、合理使用提供参考。主要研究内容如下:1、建立辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯的敏感基线。在山西省晋中市3个未使用过啶氧菌酯及同类药剂的地区采集并分离到45株辣椒炭疽病菌菌株,采用菌丝生长速率法对其进行敏感性测定,结果显示,其EC50值介于1.4041～16.6497 μg/mL,平均值为6.7831±3.4994μg/mL,其EC50呈连续性单峰曲线,且45株菌株对啶氧菌酯敏感性频率分布呈现近似正态分布,因此其EC50的平均值可作为辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯的相对敏感基线。水杨肟酸(SHAM)作为旁路氧化途径中主要替代氧化酶的抑制剂,可增强啶氧菌酯对辣椒炭疽病菌菌丝的抑制作用。在SHAM的处理浓度为150 μg/mL时,EC50+S介于0.0221～0.2752 μg/mL之间,平均值为0.1090±0.058 μg/mL。旁路氧化所表现出的增效值F(F=EC50/EC50+S)最低为6.0391,最高为301.4412,平均为78.0262。2、室内诱导辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯的抗性突变体。随机从3个采集地菌株中各选取敏感菌株1株,采用药剂诱导、药剂驯化和紫外+药剂联合诱导三种方法分别对这3株辣椒炭疽病菌敏感菌株进行抗药性诱导,共诱导获得8株抗性突变体,其中低抗菌株6株,中抗菌株2株,未获得高抗性水平突变体。3、测定抗性突变体的适合度及生物学特性。结果显示,辣椒炭疽病菌对抗啶氧菌突变体的抗性可稳定遗传,其产孢量、菌丝生长速率、致病力与亲本敏感菌株相比没有显著差异。在不同营养条件、pH值、温度以及渗透压条件下,辣椒炭疽病菌抗感菌株均以淀粉作为碳源、硝酸钾作为氮源时利用率最高;在中性偏酸条件下抗感菌株生长较旺盛,而在强酸或强碱条件下抗感菌株菌丝生长较差;抗感菌株菌丝最适生长温度均为25℃。此外,渗透压敏感性测定结果表明,抗感菌株在供试的几种葡萄糖浓度下均可生长,相比无糖培养基,在含有葡萄糖的培养基上菌落直径会明显增加,而对于NaCl浓度而言,抗感菌株随着NaCl浓度的提高菌丝生长受到抑制,且敏感菌株与不同抗性水平菌株对高浓度NaCl渗透压均很敏感,其渗透压敏感性没有显著差异。4、测定啶氧菌酯与嘧菌酯、醚菌酯、啶菌噁唑、多菌灵、咪鲜胺的交互抗性。结果显示,在防治辣椒炭疽病菌中,啶氧菌酯与同属甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的嘧菌酯、醚菌酯之间存在交互抗药性,与啶菌噁唑、多菌灵、咪鲜胺之间均无交互性产生。综合分析表明辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯具有较高的抗药性风险,建议生产上应将啶氧菌酯与其它无交互抗性的药剂交替或混合使用从而延缓啶氧菌酯抗药性的产生。

关键词：辣椒炭疽病菌啶氧菌酯敏感基线生物学特性交互抗性

Bt杀虫蛋白原核表达及对异迟眼蕈蚊的杀虫活性

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Bt杀虫蛋白原核表达及对异迟眼蕈蚊的杀虫活性

作者：王帆帆山西农业大学

学位级别：硕士

本试验对8株分离自江苏省紫金山土壤的野生苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)进行筛选后,得到1株对食用菌异迟眼蕈蚊(Bradysia difformis Frey)有较好杀虫活性的Bt菌株23-5。同时,对该菌株进行了形态鉴定、生理生化鉴定、16S r... 详细信息

本试验对8株分离自江苏省紫金山土壤的野生苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)进行筛选后,得到1株对食用菌异迟眼蕈蚊(Bradysia difformis Frey)有较好杀虫活性的Bt菌株23-5。同时,对该菌株进行了形态鉴定、生理生化鉴定、16S rDNA鉴定和杀虫蛋白基因型鉴定等研究,并对该菌株含有的杀虫蛋白基因进行了原核表达,以期为食用菌Bt微生物农药的开发和应用提供理论依据。具体研究成果如下:1.通过胃毒法测定了8个Bt菌株对异迟眼蕈蚊的室内杀虫活性,结果表明8个Bt菌株中对异迟眼蕈蚊的校正死亡率最高可达84.48%(23-5菌株),最低为43.11%。采用抑菌圈法测定了Bt菌株对平菇、毛木耳、茶树菇和双孢菇四种食用菌菌丝生长的影响,发现8个Bt菌株均减缓了四种食用菌菌丝生长速度,但最终菌丝仍然可以盖过Bt菌落继续生长。故选择校正死亡率最高的菌株23-5进行以下试验。2.对菌株23-5进行分类鉴定时主要采用形态鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定三种鉴定方法,同时采用PCR-RFLP法确定菌株23-5含有的杀虫蛋白类型。结果表明该菌株能够产生圆形或不规则形晶体,生理生化鉴定及16S rDNA鉴定结果均显示该菌株与苏云金芽孢杆菌最为接近。PCR-RFLP结果显示该菌株含有的杀虫蛋白基因型组合为cry4/10+cry11+cyt1+cyt2。所以确认该菌株属于苏云金芽孢杆菌(Bt)3.以NCBI上公布的与cry4B、cry10、cry11、cyt1、cyt2五种杀虫蛋白基因相关信息为依据,扩增菌株23-5中各杀虫蛋白基因片段,结果显示23-5中含有的cry4B、cry10、cry11、cyt1、cyt2基因序列的长度分别为1470bp、2043bp、1941bp、750bp、792pb。各基因的克隆载体和表达载体分别构建成功后,进行PCR验证和双酶切验证。各杀虫毒蛋白基因的生物信息学分析表明Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa和Cyt2Ba蛋白均为亲水性蛋白,Cyt1Aa蛋白为疏水性蛋白,分别得到其氨基酸组成、理化性质和保守结构域。4.将各杀虫蛋白基因构建成功的表达载体进行蛋白表达和纯化,IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE结果表明杀虫蛋白Cry4B、Cry10、Cry11主要存在于表达菌株的沉淀中,呈包涵体形式,恢复其生物活性需通过变复性的方式,再进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化;目标蛋白Cyt2主要存在于上清液,呈可溶形式表达,可直接进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化;目标蛋白Cyt1表达不明显。融合蛋白Cry4B、Cry10、Cry11和Cyt2表达的大小分别为70KD、84KD、88kD和70kD。5.分别提取各工程菌株的目标蛋白,用Brandford法测定蛋白浓度,进行各目标蛋白的室内毒力测定。各蛋白浓度为250 ng/mL时,蛋白Cyt2对异迟眼蕈蚊的杀虫活性最高,校正死亡率达70.18%;蛋白Cry4B、Cry10、Cry11对异迟眼蕈蚊的杀虫活性较低,三者之间无显著性差异,校正死亡率为33.33-35.09%。

关键词：苏云金芽孢杆菌菌株筛选分类鉴定蛋白表达杀虫活性