检索结果-南通市图书馆

作者：韩丽媛北京协和医学院

学位级别：硕士

目的：本研究旨在应用荧光双相电泳结合质谱技术建立人前列腺癌和前列腺良性增生的核基质蛋白差异表达图谱并进行鉴定和分析;为临床找寻前列腺癌的诊断和预后标志物奠定实验室基础。材料和方法：1、应用细胞荧光免疫技术特异标记BP... 详细信息

目的：本研究旨在应用荧光双相电泳结合质谱技术建立人前列腺癌和前列腺良性增生的核基质蛋白差异表达图谱并进行鉴定和分析;为临床找寻前列腺癌的诊断和预后标志物奠定实验室基础。材料和方法：1、应用细胞荧光免疫技术特异标记BPH-1、LNCaP、PC-3三种细胞中的AnnexinⅡ和GRP78蛋白;分析蛋白的细胞定位;2、硫酸铵沉淀法提取组织的核基质蛋白（NMPs）,荧光差异双向电泳技术（DIGE）进行蛋白质分离;4、Typhoon9410多功能成像系统扫描双向电泳图谱,DeCyder5.0软件分析,对差异表达的蛋白点进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析。结果：1、AnnexinⅡ在BPH-1和LNCaP细胞中主要定位于胞浆和细胞膜上,且均呈现弱阳性表达,在PC-3细胞中强表达并且细胞核中表达增多;2、GRP78在BPH-1细胞中大部分表达于细胞浆内,少量表达在细胞核中,在LNCaP和PC-3的细胞核和细胞浆中均可见;3、成功获得了人前列腺癌组织和前列腺良性增生组织的核基质蛋白表达差异图谱;4、获得到24个有统计学意义的差异蛋白点,其中16个蛋白点在前列腺癌组织中表达下降,8个蛋白点在前列腺癌组织中表达上调;5、鉴定差异蛋白大致可分为蛋白酶类、肌动蛋白、与细胞增殖相关的各种因子等类别。结论：1、AnnexinⅡ和GRP78的差异表达可能与前列腺癌细胞的不同分化程度有关;2、人前列腺癌和人前列腺良性增生组织的核基质蛋白组分存在显著差异。

关键词： AnnexinⅡ GRP78 前列腺癌前列腺增生核基质蛋白(NMPs) 荧光差异双向电泳

附睾管腔液蛋白鉴定及精子表面GPI锚蛋白的探索性鉴定

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附睾管腔液蛋白鉴定及精子表面GPI锚蛋白的探索性鉴定

作者：王小强中国协和医科大学

学位级别：硕士

目的：鉴定大鼠附睾管腔液中有可能参与精子成熟、贮存及保护的附睾管腔分泌蛋白以及精子表面的GPI锚蛋白。方法：1,借助乙酰唑胺大鼠饲胃模型,采用电泳技术分离分析乙酰唑胺作用后附睾管腔液蛋白组份的变化;2,利用双向电泳结合质谱的... 详细信息

目的：鉴定大鼠附睾管腔液中有可能参与精子成熟、贮存及保护的附睾管腔分泌蛋白以及精子表面的GPI锚蛋白。方法：1,借助乙酰唑胺大鼠饲胃模型,采用电泳技术分离分析乙酰唑胺作用后附睾管腔液蛋白组份的变化;2,利用双向电泳结合质谱的蛋白质组学核心技术,分析鉴定正常成年大鼠附睾不同区段管腔液蛋白的差异,并采用***-blot.免疫组化技术对差异蛋白进行定性、定量、定位分析;3,纯化嗜水气单胞菌毒素,制备抗嗜水气单胞菌毒素多克隆抗体。使用嗜水气单胞菌毒素为蛋白探针,用Sandwich Western-blot法鉴定精子表面的GPI锚蛋白. 结果：1，成功建立了乙酰唑胺大鼠饲胃模型。乙酰唑胺作用后引起附睾精子的病理性变化,包括活动力下降、畸形率增加。但是,乙酰唑胺作用并未引起附睾管腔液蛋白组份的改变;2,从正常成年大鼠附睾头段及尾段管腔液的22个差异蛋白点中鉴定出12个蛋白质。其中11个蛋白质在不同种属哺乳动物的附睾组织中已有鉴定报道,而过氧化物酶(Peroxiredoxin6,Prdx6)为新发现的存在于附睾头段及尾段管腔液中的体液蛋白。***及免疫组化技术进一步证实,该蛋白表达于附睾上皮细胞中并存在于附睾精子上,在附睾头部及尾部的表达量不同;3,本实验纯化出了高纯度有生物活性的嗜水气单胞菌毒素,自行制备了特异性强、效价高的抗毒素多克隆抗体。Sandwich Western-blot结果显示附睾精子表面有数种能被该毒素识别的GPI锚蛋白,分布在分子量为15-130kD之间。结论：1,乙酰唑胺作用后能引起精子病理性变化,但是乙酰唑胺并不会引起附睾管腔液蛋白组份的变化。乙酰唑胺作用后出现的精子病理性变化与附睾管腔液蛋白的变化并无直接关系;2,过氧化物酶(Peroxiredoxin6,Prdx6)有可能参与附睾精子的成熟、贮存与抗氧化保护,该蛋白的具体机制有待进一步研究阐明;3,嗜水气单胞菌毒素能作为一种有效的生物探针,用于精子表面GPI锚蛋白的鉴定研究。

关键词：附睾精子成熟乙酰唑胺过氧化物酶6 嗜水气单胞菌素 GPI锚蛋白双向电泳

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雌激素反应性蛋白与乳腺癌的相关性研究

雌激素反应性蛋白与乳腺癌的相关性研究

作者：裘佳中国协和医科大学

学位级别：硕士

乳腺癌是严重威胁女性生命的恶性肿瘤之一，尽管在乳腺癌的诊断和治疗方面已经取得了长足进步，但是其诊断和治疗现状仍难以令人满意。肿瘤标志物的测定是乳腺癌诊断和治疗的重要参考依据。长期以来我们关注受雌激素调节的靶器官产生... 详细信息

乳腺癌是严重威胁女性生命的恶性肿瘤之一，尽管在乳腺癌的诊断和治疗方面已经取得了长足进步，但是其诊断和治疗现状仍难以令人满意。肿瘤标志物的测定是乳腺癌诊断和治疗的重要参考依据。长期以来我们关注受雌激素调节的靶器官产生的特异反应蛋白。我们的假说是：该类蛋白在雌激素所致的肿瘤发生发展过程中将随之改变，以其为目标与乳腺癌建立相关性，将有可能发现新的乳腺癌蛋白标志物而应用于诊断与治疗。我们的前期研究显示，大鼠子宫腔液中—分子量为250kD的蛋白受雌激素的调节，称其为雌激素反应性蛋白(ERPy)。对该蛋白的初步研究显示，正常乳腺组织和乳腺癌变组织中有相似抗原表位的蛋白表达。本研究既在此基础上进一步鉴定其分子属性及其与乳腺癌的相关性。并以粘蛋白MUC1为切入点，对培养的乳腺癌细胞系给予药物影响，以验证雌激素调节蛋白与乳腺癌的相关性以及探索MUC1与其他相关蛋白在乳腺癌中是否有协同作用。本研究采用双向电泳结合质谱，生物信息学，免疫化学，细胞培养，激光共聚焦显微镜观察，流式细胞检测等技术，结果显示： 1、利用兔抗大鼠ERPy多克隆抗体进行的Western blot鉴定显示，在乳腺癌组织提取物中有140kD和／或160kD两条蛋白条带被特异识别;而且在不同病人乳腺癌组织中识别的抗原的表达量有所不同。这种差异或许反映了肿瘤发生发展的状态，在评价病人预后方面有一定的意义;或许有作为预示标志物的可能。因此，对于这两个抗原仍有必要继续鉴定。 2、利用兔抗大鼠ERPy多克隆抗体对MCF7全细胞裂解液进行的Western鉴定显示，一分子量为50kD蛋白被特异识别。经2DE分离结合抗体Western blot识别也在50kD位置显示两个蛋白点，分别为pI 6.0和pI 6.5。对两个点进行质谱分析获得肽指纹图谱，经蛋白质数据库检索表明：这两个蛋白点均为烯醇酶。 3、进一步研究发现，MCF7细胞在给予雌激素后烯醇酶的表达量确实增加。同时用购买的抗烯醇酶抗体对14例乳腺癌病人组织进行确认实验，结果表明，烯醇酶在乳腺癌组织中的表达高于癌旁组织。结果提示，烯醇酶可能是与雌激素导致癌变过程有关的蛋白酶之一，因此有可能成为乳腺癌的诊断标志物。 4、以粘蛋白MUC1为切入点，通过雌激素和三苯氧胺对培养的乳腺癌细胞系中MUC1的表达影响，进行了雌激素反应蛋白与乳腺癌发生的相关性研究。首先，培养MCF7和MDA-MB-231细胞达到良好的生长状态。然后加入不同浓度的E和TAM，通过MTT实验确定了观察E或TAM通过ER或非ER途径影响的最适给药浓度。 5、采用激光共聚焦显微镜观察了E或TAM对MUC1蛋白在MCF7和MDA-MB-231细胞的定位情况。结果显示MUC1蛋白的定位没有改变。MUC1蛋白的定位情况不能反映肿瘤发展的程度，因此不适于作为TAM治疗后效果评价的参考指标。 6、通过流式细胞实验检测，确认MUC1是雌激素反应性蛋白，E或TAM通过ER途径影响MUC1蛋白的表达。结果提示当TAM采用临床常用剂量治疗ER阳性的病人时，MUC1的表达量可以反映对癌细胞的抑制效果，此时MUC1蛋白可以作为预后标志物。但是，当TAM治疗ER阴性的病人，TAM超过常用剂量，MUC1的表达量则不能完全反映癌细胞的抑制效果，此时不适于作为TAM治疗后效果评价的参考指标。 7、当E或TAM作用于MCF7时，MUC1与E-cadherin的定位没有改变，因此不能将MUC1与E-cadherin的定位作为TAM治疗的预后标志物进行观察。流式细胞实验表明，E-cadherin不随MUC1表达量的改变而改变，因此MUC1和E-cadherin没有直接的协同作用。本研究的结果为探讨雌激素反应性蛋白与雌激素在乳腺癌的相关性提供有意义的信息，这些信息将有助于发展新的诊断与治疗方法，以及对雌激素受体治疗效果作出评价。

关键词：乳腺癌雌激素雌激素反应性蛋白三苯氧胺 MUC1 烯醇酶双向电泳质谱激光共聚焦显微镜流式细胞实验

人精液和卵泡液中抑制素B（INH-B）的分离纯化与鉴定研究

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人精液和卵泡液中抑制素B（INH-B）的分离纯化与鉴定研究

作者：杜江北京协和医学院

学位级别：硕士

研究背景：血清抑制素B(INH-B)的检测在男性不育症的诊治中已逐渐得到广泛的应用。一般认为INH-B更能直接反映睾丸的生精功能,并具有无创性的优点,可作为评价男性生育力的重要指标,诸如预测非阻塞性无精症患者行睾丸穿刺能否获得精子的... 详细信息

研究背景：血清抑制素B(INH-B)的检测在男性不育症的诊治中已逐渐得到广泛的应用。一般认为INH-B更能直接反映睾丸的生精功能,并具有无创性的优点,可作为评价男性生育力的重要指标,诸如预测非阻塞性无精症患者行睾丸穿刺能否获得精子的参考依据。目前国际国内应用的血清INH-B检测试剂盒几乎全是英国DSL公司的产品,且价格昂贵。DSL公司以Groome NP实验室的雄厚研究基础为支撑,将其研究结果成功转化。查阅文献凡INH-B研究所用的抗体最初都是该实验室惠赠。在90's年代开发出第一代INH-B ELISA检测试剂盒,在2000年又改进推出第二代产品。本研究课题的立项源于市场的需求,因国内尚无自主知识产权的INH-B检测试剂盒,在某试剂公司的要求下进行合作开发国产化产品。研究目的：制备高特异性、高亲和力的单克隆抗体是研发的核心问题。因此,本研究将集中开展INH-B单抗制备的关键步骤与必要条件的探索。研究表明,男性体内IN的重要生理活性形式为INH-B,其组装过程大部分在生精细胞内完成,然后释放到循环系统和精液中。女性卵泡液中INH-B的含量为几十ng/ml～几百ng/ml,比血液及精液中的含量高约103倍本实验拟尝试从人精液和/或人卵泡液中分离纯化INH-B,为单抗的筛选提供天然抗原分子。由于对人精液和卵泡液中INH-B的研究相对薄弱,更多的研究资料来源于动物,因此本研究还将对其存在形式和理化性质获得更直接的资料。主要目的有三个：1.探索人精液和卵泡液中INH-B的有效分离纯化方法。2.鉴定人精液和卵泡液中INH-B的可能分子存在形式。3.扩大人卵泡液中蛋白质组成的信息资料。研究路线与方法：1.目的蛋白的富集：采用人精液和卵泡液为研究材料,分别利用乙腈、丙酮、乙醇三种有机溶剂沉淀法去除样品中的高丰度蛋白,富集低丰度蛋白INH-B,以及利用饱和硫酸铵分级沉淀方法,比较四种方法对于低丰度目的蛋白INH-B的富集效果。以INH-B ELISA检测盒的结果为依据,跟踪监测并比较四种方法对于低丰度目的蛋白INH-B的富集效果。2.选用DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱和羟基磷灰石柱层析、肝素亲和柱方法,分离初步富集的样品以进一步纯化。同样方法监测并比较三种方法对于样品的分离纯化效果。3.利用蛋白质等电点分离法(Rotofor System)对富集样品和柱分离样品分别做等电分离比较,以确定柱分离步骤的有效性,同时鉴定INH-B的等电点。4.利用免疫共沉淀(CO-IP)和Western-blot方法寻找阳性条带,利用质谱分析方法鉴定样品中INH-B的α、βB两个亚基的分子存在形式及成熟卵泡液中部分蛋白质的组成。研究结果：1.由于精液特殊的粘稠性(含大量的精胶蛋白),在对其进行有机溶剂蛋白沉淀和饱和硫酸铵分级沉淀的过程中,去除精胶蛋白的同时会损失大部分的INH-B。因此,经多次实验验证后,我们放弃了对于精液中INH-B的分离纯化和鉴定研究。2.卵泡液样品经丙酮、乙醇、乙腈处理后分别可清除60.9%、46.3%、88.7%的高丰度蛋白,同时乙腈法能回收61.8%的INH-B。3.通过比较肝素亲和柱方法、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱和羟基磷灰石柱层析三种方法,其中第二种方法最稳定,并且能回收样品中83.2%的INH-B。4.乙腈沉淀处理的卵泡样品中仍有较多的杂蛋白,因此,经DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱处理后的样品比直接用乙腈沉淀样品做Rotofor System分离的效果要好。其中,INH-B的回收率为75.3%,卵泡液中INH-B的pI在4.55左右。5.通过质谱方法,鉴定出六种成熟卵泡液中存在的蛋白质,分别是载脂蛋白D(Apolipoprotein D)、载脂蛋白A(Apolipoprotein A)、载脂蛋白M(ApolipoproteinM)、视黄醇结合蛋白4 (Retinol-binding protein 4)、甲状腺素运载蛋白(Transthyretin OS)、SERPINA1蛋白Alpha型抗胰蛋白酶(SERPINA1 Isoform 2 of Alpha-1-antitrypsin)。结论：1.卵泡液是INH-B研究的最合适材料。同时,利用乙腈法处理卵泡原液去除高丰度蛋白是最有效的方法并能保留较多的INH-B。2.使用人卵泡液为实验材料,利用INH-B本身的生化性质,通过乙腈富集、阴离子交换柱分离、等电点分离的“三步分离法”,初步纯化获得人体卵泡液中天然INH-B蛋白分子粗制品,纯化回收率达38.7%,并较准确鉴定出其在人体中的等电点为4.55。3.利用现有的商品化抗体并没有鉴定出在精液和卵泡液中INH-B的分子存在形式。但经多个步骤纯化已经获得相对含量较高的INH-B粗制品

关键词：人精液人卵泡液抑制素B质谱蛋白质分离纯化

1.血清抑制素B在鉴别梗阻性与非梗阻性无精子症中的应用价值 2.非梗阻性无精子症患者Y染色体微缺失的研究

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1.血清抑制素B在鉴别梗阻性与非梗阻性无精子症中的应用价值 2.非...

作者：蔡文娟中国协和医科大学

学位级别：硕士

目前,临床上还没有鉴别OA和NOA敏感性和特异性都非常高的血清学标志物。研究血清INHB的鉴别效果是当务之急。INHB自被发现迄今已有七十余年。在已经完成的INHB试验研究中,发现其预测精子发生状态效果较好,是一个非常有临床应用前景的激... 详细信息

目前,临床上还没有鉴别OA和NOA敏感性和特异性都非常高的血清学标志物。研究血清INHB的鉴别效果是当务之急。INHB自被发现迄今已有七十余年。在已经完成的INHB试验研究中,发现其预测精子发生状态效果较好,是一个非常有临床应用前景的激素。 INHB研究的目的是预测睾丸内精子发生的状况,从而为男性不育症的临床诊治提供依据。然而,抑制素B在国内男性的正常参考值范围以及在鉴别OA和NOA的应用价值这两个问题一直没有得到解决。由于血清INHB在不同种族差异具有显著性,因此国外的正常参考范围以及鉴别OA和NOA的切点不能在国内得以应用。尽管国内一些临床研究给出了参考范围,但是均由于标本量不够以及实验方法落后等原因而没有被普遍采用。 FSH、精浆中性α-Glu在OA和NOA患者之间存在差异。近年来,国外越来越多的证据显示,INHB比FSH更能够预测精子的发生。通过研究比较血清INHB和FSH、精浆中性α-Glu在预测OA或者NOA的敏感性和特异性,可以阐明INHB在鉴别OA和NOA的应用价值,从而为更科学的应用INHB提供理论指导与实验依据。目的：本研究通过测定血清抑制素B (INHB)并与卵泡刺激素(FSH)和精浆中性α-葡糖苷酶(α-Glu)等经典指标比较,评价INHB在鉴别诊断梗阻性(OA)和非梗阻性无精子症(NOA)中的应用价值,并对睾丸精子发生障碍作出预判。方法健康生育男性组(n=60),以睾丸活检为金标准确定OA组(n=39)和NOA组(n=77),留取血液和精液标本,进行精液常规分析,检测血清INHB、FSH和精浆中性α-Glu的水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线法,通过计算ROC曲线下面积,确定切点值并分析评价检测指标的敏感性和特异性。结果本实验室健康育龄男性血清INHB的95%参考值范围为：20.37-206.21pg/ml。血清INHB. FSH.精浆中性α-Glu、血清INHB/FSH比值以及INHB+FSH联合在OA组与NOA组之间均差别显著,具有统计学意义(P0.05),位点数目的差异在统计学上具有显著性(χ2=22.04,P＜0.05)。在12名NOA且存在Y染色体微缺失的患者中,有1、2、3、6名患者分别缺失4、3、2、1个位点。结论：通过检测15个微缺失位点发现NOA患者中Y染色体微缺失的发生率为16.44%。15个位点的Y染色体微缺失检测比6个位点的检测更有临床意义和价值。Y染色体微缺失的多重PCR检测会导致假阴性结果,需要单重PCR进行确认。研究还发现AZFb+c的缺失对生精功能损伤可能较为严重、Y染色体

关键词：血清抑制素B 卵泡刺激素精浆中性α-葡糖苷酶梗阻性无精子症非梗阻性无精子症 Y染色体微缺失男性

大鼠睾丸特异表达基因Ube1的分离鉴定及生物学特征研究

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大鼠睾丸特异表达基因Ube1的分离鉴定及生物学特征研究

作者：杜颖中国协和医科大学

学位级别：硕士

精子发生是一个十分复杂但又高度有序的细胞分化过程,是相关基因严格受时空调控相继转录表达的结果。生精细胞的发生分多阶段进行,曲细精管截面上不仅可以看到处于精子发生过程不同阶段的各种生精细胞的组合,还可以看到支持细胞、间质... 详细信息

精子发生是一个十分复杂但又高度有序的细胞分化过程,是相关基因严格受时空调控相继转录表达的结果。生精细胞的发生分多阶段进行,曲细精管截面上不仅可以看到处于精子发生过程不同阶段的各种生精细胞的组合,还可以看到支持细胞、间质细胞等其它类型的细胞。它们分别具有自己的基因时空表达规律,但是此过程中的分子机制尚未完全阐明。因此分离得到单一的生精细胞群并建立单一细胞类型的cDNA文库,就可以特异性地研究单一细胞的基因表达和有效地筛选不同生精细胞群之间差异表达的基因。本研究采用牛血清白蛋白的梯度沉降法分离高纯度生精细胞,并通过抑制性消减杂交(Suppressive Subtractive Hybridization,SSH)技术,构建了A型精原细胞和粗线期精母细胞的双向消减cDNA文库,并对筛选出来的部分已知和未知基因进行深入探索。根据SSH的结果,我们从A型精原细胞和粗线期精母细胞的双向消减cDNA消减文库中选择了576个PCR纯化产物进行斑点杂交(Dot Blotting)分析,以验证差异表达并分析其表达差异的强度。结果得到480个克隆在两种细胞之间表达差异相差大于2倍。随后我们选取40个存在明显表达差异的克隆进行测序分析,共产生了37个质量满意的ESTs序列,总测序成功率达到92.50%。将这些EST分为已知基因、已知EST和全新EST三类。由于不同组织中基因的表达水平不同及cDNA文库构建所产生的冗余性,结果从大鼠A型精原细胞和粗线期精母细胞双向消减cDNA文库中得到的已知基因、已知EST和全新EST分别为89.19%、5.40%和5.40%。对代表已知基因的ESTs按照功能分类,发现主要涉及细胞凋亡、信号传导和细胞间物质运输、细胞结构/运动、转录调节、代谢、线粒体基因几类,并初步探讨了大鼠精子发生过程中差异表达基因的作用和意义。将大鼠精原细胞特异表达的克隆编号为P5B10的EST序列进行RACE(RapidAmplification of cDNA Ends)技术扩增,获得一个新的cDNA序列,命名为大鼠泛素激活酶基因(Rattus norvegicus Ubiquitin-Activating Enzyme E1,Ubel)。在我们发现大鼠Ubel之前,GenBank库中没有大鼠Ubel的报道,我们第一次克隆了大鼠的Ubel基因的全长,登录GenBank,获得登录号为EF690356。该基因序列全长3433bp,其中开放阅读框有3171bp,编码一个含1057个氨基酸的蛋白质。预测其编码蛋白分子量为11.78kD,等电点5.32。Blast比对显示,Ubel基因与小鼠泛素激活酶基因(Ubelyl)的同源性为92%,与人泛素激活酶基因(UBE1)的同源性为83%。Ubel基因编码的蛋白质包含了泛素激活酶信号位点和泛素激活酶活化位点,分别位于410-418aa和629-637aa,它们均存在于人类和小鼠的泛素激活酶中。逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)结果显示,Ubel在大鼠睾丸中大量表达,而在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脑、卵巢中没有表达;我们用RT-PCR和荧光定量PCR检测了精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞和支持细胞中Ubel的表达特性,结果显示精原细胞中Ubel基因大量表达,精母细胞、精子细胞和支持细胞中微弱表达。因此,Ubel是大鼠睾丸特异表达的基因,可能通过参与泛素/蛋白酶体途径来影响大鼠精子发生。以上这些工作为Ubel的进一步功能研究完成初步的准备工作。

关键词：泛素激活酶精子发生抑制性消减杂交 cDNA快速扩增逆转录-聚合酶链反应荧光定量PCR

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附睾特异蛋白的鉴定研究

附睾特异蛋白的鉴定研究

作者：齐晓伟中国协和医科大学

学位级别：硕士

目的:鉴定大鼠附睾管腔液中可能参与精子成熟/精子表面修饰的附睾特异蛋白。方法:借助实验性大鼠左侧精索静脉曲张(ELV)动物模型分析和比较附睾中特异改变的蛋白成分,采用的主要实验技术包括:双向电泳结合质谱分析及数据库检索,免疫印... 详细信息

目的:鉴定大鼠附睾管腔液中可能参与精子成熟/精子表面修饰的附睾特异蛋白。方法:借助实验性大鼠左侧精索静脉曲张(ELV)动物模型分析和比较附睾中特异改变的蛋白成分,采用的主要实验技术包括:双向电泳结合质谱分析及数据库检索,免疫印迹与免疫组织化学鉴定技术以及基因分析技术,作进一步鉴定确认。结果:1,ELV模型动物多个附睾蛋白成分明显高于假手术动物。对其中之一,22 kD蛋白经质谱分析及数据库检索提示为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PBP),其分子量为22 kD,pⅠ6.0。经免疫印迹确认为附睾特异来源。2D-Western在22 kD的位置显示六个平行的识别点(串珠状),此外,抗体还识别24 kD和43 kD多个点。2,附睾头段与尾段管腔液蛋白成分有明显差异。2D凝胶显示约100-150个斑点,择其中差异显著的8个斑点,分别标为EP-1～EP-8,送交质谱分析。数据检索提示EP-1是丝/苏氨酸蛋白激酶16(STK16);EP-2和EP-3是附睾蛋白DE;EP-4是细胞色素P450同源序列蛋白;EP-5和EP-6是附睾视黄酸结合蛋白成分;EP-8是peroxiredoxin6(PRX6);EP-7未鉴定出结果。3,对EP-1和EP-8的进一步分析显示,EP1/STK16鉴定结果为阴性;而EP-8确认为附睾PRX6蛋白;2D-Western结果显示,在28 kD和25 kD位置抗体特异性识别平行点(串珠状),并且免疫印记免疫组化及mRNA鉴定均证实PRX6蛋白在附睾头部的表达高于尾部。结论:本研究鉴定的大鼠附睾PBP可能以多种分子形式存在,包括糖基化修饰,该蛋白与精子表面修饰的关系需进一步研究;EP-8/PRX6作为附睾新发现的双功能酶可能在精子成熟和储存过程中具有抗氧化保护作用,确切功能值得深入研究。

关键词：附睾精子成熟磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PBP) peroxidase 6(PRX6) 双向电泳(2D)

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人类遗传资源整合与共享的初步研究

人类遗传资源整合与共享的初步研究

作者：曹宗富中国协和医科大学

学位级别：硕士

一、研究目的 1.研究人类遗传资源的整合方法,建立资源整合技术体系,开展各类人类遗传资源的整合;2.利用整合的遗传资源进行汉族群体遗传多样性与遗传结构的初步研究。二、研究方法 (一)人类遗传资源整合方法与技术体系的初步研究 1.... 详细信息

一、研究目的 1.研究人类遗传资源的整合方法,建立资源整合技术体系,开展各类人类遗传资源的整合;2.利用整合的遗传资源进行汉族群体遗传多样性与遗传结构的初步研究。二、研究方法 (一)人类遗传资源整合方法与技术体系的初步研究 1.通过制定人类遗传资源描述规范,建立资源整合的信息标准体系;根据描述规范进行各类遗传资源的数字化改造与数据汇交,通过数据库等现代信息技术实现人类遗传资源的异构整合与信息共享;2.制定人类遗传资源整合共享流程文件和平台运行管理办法,完善整合共享流程;逐步建立人类遗传资源质量管理体系,确保整合资源的质量。 (二)人类遗传资源的共享——我国汉族群体遗传多样性与遗传结构的初步研究 1.选择非洲、欧洲、大洋洲、亚洲、北美洲和南美洲共六个大洲的12个人群为研究人群,将整合的汉族人群依居住地分为20个亚人群,选择微卫星为多态性标记;2.通过基因频率、观测杂合度、基因多样度等参数分析汉族的遗传多样性;3.通过计算固定指数(Fst)、基因分化系数(Gst)分析汉族人群的遗传分化和变异;通过分子方差分析对群体的变异来源进行测量;4.通过构建进化树、主成分分析、贝叶斯聚类等方法分析汉族人群的遗传结构,并通过我国汉族和世界人群的遗传关系进一步验证我国汉族人群的遗传结构。三、研究结果 (一)人类遗传资源整合方法与技术体系的初步研究 1.通过14个信息描述规范的制定与应用,实现了369977份人类遗传资源的数字化改造与数据汇交;2.制定了人类遗传资源整理整合与共享的管理办法和程序文件,初步建立了人类遗传资源的质量管理体系。 (二)人类遗传资源的共享——我国汉族群体遗传多样性与遗传结构的初步研究 1.我国汉族各个亚人群都具有较高的观测杂合度和基因多样度,人群之间较低的基因分化系数和较小的遗传距离提示我国汉族人群之间存在着遗传相似性;2.较高的多样度提示汉族群体中间存在较高的变异,分子方差分析结果显示汉族人群的遗传差异主要来源于人群内部个体之间,而不是人群之间。 3.遗传结构分析显示汉族人群大致以长江为界划分为南方群体和北方群体,其中南方群体主要包括广东、广西、贵州、四川、福建、湖南、江西、重庆和浙江,北方群体包括天津、新疆、山东、河南、河北、湖北、江苏、安徽、辽宁、内蒙古和山西。四、主要结论 1.通过人类遗传资源描述规范的制定与应用,基木建立了人类遗传资源整合的方法与技术体系;通过数据库等现代信息技术手段实现了一定规模的人类遗传资源的数字化改造与数据汇交,为人类遗传资源的实物共享奠定了基础。 2.资源整合作为一种模式,使得大规模群体研究成为可能;我国汉族人群具有丰富的遗传多样性,大致以长江为界划分为南方群体和北方群体,但群体间的遗传差异比较小,差异主要来源于人群内部个体之间。

关键词：人类遗传资源标准化整合共享微卫星数据库遗传多样性遗传结构汉族

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抗菌肽衍生物的杀精效果研究

抗菌肽衍生物的杀精效果研究

作者：张尉北京协和医学院

学位级别：硕士

研究背景：体外杀精剂是控制生育和避孕的有效手段,其中壬苯醇醚-9(Nonoxinol-9,N-9)因其具有强大的杀精效果而成为广泛接受的表面活性剂类杀精剂,已经在美国和其它一些国家使用超过了30年。作为一种有效的杀精避孕阴道外用生物制剂,除... 详细信息

研究背景：体外杀精剂是控制生育和避孕的有效手段,其中壬苯醇醚-9(Nonoxinol-9,N-9)因其具有强大的杀精效果而成为广泛接受的表面活性剂类杀精剂,已经在美国和其它一些国家使用超过了30年。作为一种有效的杀精避孕阴道外用生物制剂,除了拥有快速有效的杀精避孕性质之外,安全低毒也非常重要。但近年来有研究表明,N-9存在安全隐患,长期反复使用可能会对阴道上皮细胞造成损伤,所以尽快研制新型安全的杀精避孕剂已迫在眉睫。抗菌肽(Antimicrobial peptides)是广泛存在于生物体内的一类抵抗外源性病原微生物致病作用的防御性小分子多肽(分子质量2mL),于37℃C保温液化30mmin-。液化后进行常规分析,严格按照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第五版推荐的标准执行,其中精子总数60×106～100×106,精液浓度>20×106/mL,精子活动率>60%。2.体外杀精效果实验：按照WHO推荐的Sander-Cramer方法,精液与抗菌肽以1：5迅速混合,37℃C水浴20s,显微镜下随机观察计数5个视野,再以伊红-苯胺黑染色技术观察精子细胞的存活,筛选出具有较强杀精作用的抗菌肽衍生物。同时测定杀精抗菌肽和N-9的EC100。最后观察测定杀精抗菌肽的时间-浓度依赖性。3.细胞毒性研究：采用CCK-8试剂盒检测细胞毒性,对抗菌肽衍生物和N-9进行细胞毒性分析,评价N-9的细胞毒性并筛选出细胞毒性较低的抗菌肽衍生物,并计算它们的IC50值。4.家兔抗生育实验：采用阴道内给药的方法向雌性育龄新西兰大耳白兔阴道内注入杀精剂量的抗菌肽溶液,交配后观察统计兔子怀孕情况。生理盐水为阴性对照,N-9为阳性对照。相同组分观察阴道内给药后,兔红细胞溶血情况。5.杀精机制初探：采用HOS-EG实验方法了解杀精抗菌肽杀精后精子膜破坏情况。6.抗菌实验：微量稀释法检测杀精抗菌肽候选衍生物对白色念珠菌和大肠杆菌的抗菌作用效果。研究结果：1.19种抗菌肽Maximin衍生物(M1-M19)中M1、M7、M1、M15和M17这五种抗菌肽在浓度为2000mg/L、作用时间为20s时就能完全制动精子,ECloo分别是：M7=M11=2000mg/L,Ml=M15=M17=1500mg/L。N-9的EC100=100mg/L。2.利用Hela-229细胞分析细胞毒性时,M11的细胞毒性明显低于其它四种抗菌肽,表现出较高的安全性。N-9具有强大的细胞毒性,IC50=3.01mg/L。3.杀精抗菌肽衍生物M11的家兔抗生育实验结果显示M11药物组的活胎数和避孕率与阴性对照组相对比均无统计学意义。***-EG实验结果显示,杀精抗菌肽和N-9对精子的细胞膜完全破坏;M11对精子的破坏主要集中的精子尾部,而M15和M17对

关键词：抗菌肽壬苯醇醚-9(N-9) 杀精细胞毒性抗生育实验

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子宫雌激素反应蛋白ULF-250的鉴定

子宫雌激素反应蛋白ULF-250的鉴定

作者：程露阳中国协和医科大学

学位级别：硕士

本研究在前期工作中从大鼠子宫腔液中发现一种新的雌激素反应蛋白,ULF-250。研究证实该蛋白只特异地表达于大鼠子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞中,并随动情周期的不同表达部位与含量呈现周期性变化。初步研究还显示,抗ULF-250抗体与乳腺癌... 详细信息

本研究在前期工作中从大鼠子宫腔液中发现一种新的雌激素反应蛋白,ULF-250。研究证实该蛋白只特异地表达于大鼠子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞中,并随动情周期的不同表达部位与含量呈现周期性变化。初步研究还显示,抗ULF-250抗体与乳腺癌组织中某种未知抗原产生交叉识别。因此,本研究的目的:在既往研究的基础上进一步鉴定ULF-250的分子属性;并探讨ULF-250与乳腺癌的相关性。主要实验技术包括: 双向电泳分离、免疫印迹分析、质谱分析及数据库检索等。路线和方法: 1,ULF-250的分子属性鉴定:去卵巢大鼠补充给予雌二醇造成子宫产生大量宫腔液(ULF);收集ULF分别进行SDS-PAGE和双向电泳(2-DE)分离;通过Western和2D-Western确认抗ULF-250抗体识别的蛋白成分并与凝胶上的条带或斑点相对应;对目标蛋白分别用MALDI-TOF-MS和HPLC-ESI-MS/MS两种方法进行质谱分析并获得肽质量指纹谱(PMF);与蛋白数据库比对及文献检索鉴定未知蛋白。 2,ULF-250与乳腺癌的相关性探索:制备人乳腺癌组织提取物,进行SDS-PAGE和双向电泳分离;利用抗ULF-250抗体进行Western鉴定,以获得初步的特异性识别信息以及确认抗原交叉反应性;利用MALDI-TOF-MS对特异识别的蛋白斑点做进一步鉴定分析。结果: 1,通过2-DE结合MALDI-TOF-MS和HPLC-ESI-MS/MS质谱分析以及查阅文献,确认未知的雌激素反应蛋白ULF-250是ebnerin/DMBT1;2,用抗ULF-250抗体进行的Western鉴定显示,在乳腺癌组织中有约160kD及55kD等多条蛋白条带被识别;3,利用2DE-Western抗ULF-250抗体特异识别多个蛋白斑点,择其中3个点进行质谱鉴定,数据库检索提示分别为fibrinogen gamma、transferrin、fibrin beta三种蛋白;4,上述三种蛋白在乳腺癌的发生中不是关键成分。结论: 1,经鉴定确认未知的雌激素反应蛋白ULF-250是ebnerin/DMBT1;2,文献检索提示ebnerin/DMBT1可能在生殖过程中起重要作用。此外,我们的研究显示,该蛋白不仅在子宫上皮细胞表达而且还分泌到子宫腔液中,其功能值得进一步研究;3,ULF-250与乳腺癌组织可能存在共同抗原,本研究未鉴定出与肿瘤相关的关键抗原,仍可利用抗ULF-250抗体进行广泛深入的鉴定。

关键词：子宫腔液雌激素反应蛋白(ULF-250) 双向电泳质谱乳腺癌