检索结果-南通市图书馆

作者：谭飞东北农业大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种严重的病毒性传染病。该病毒属于尼多病毒目,冠状病毒科,冠状病毒属成员,可以引起新生仔猪严重的呕吐、腹泻、... 详细信息

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种严重的病毒性传染病。该病毒属于尼多病毒目,冠状病毒科,冠状病毒属成员,可以引起新生仔猪严重的呕吐、腹泻、脱水为主要特征的高度接触性肠道传染病,各个年龄阶段的猪群都会发病,哺乳仔猪病死率高达100%。自2010年冬季以来,新生哺乳仔猪的腹泻病开始在全国各地规模化猪场暴发,本次流行的腹泻病具有发病日龄早、死亡率高的新特点。为此本研究在2013-2014年黑龙江省6个地级市的10座规模化猪场采取新生哺乳仔猪临床表现为腹泻症状的粪便与小肠进行实验室RT-PCR病原检测分析,结果表明黑龙江省地区规模化猪场新生仔猪PEDV RT-PCR检出率为56%,PEDV+TGEV RT-PCR检出率为6%,PRV RT-PCR检出率为10%,TGEV RT-PCR检出率为10%,表明引起黑龙江省规模化猪场新生仔猪腹泻的主要病原是PEDV,同时也存在与其他腹泻病毒的混合感染,由于PEDV-M基因比较稳定,是研究PEDV遗传变异的优先选择基因,因此针对阳性病料扩增出6条PEDV-M基因序列进行遗传进化分析,这6条PEDV-M基因序列之间的核苷酸同源性为98.2%9%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为97.6%8.2%。利用MEGA 6.0进行遗传进化树的构建,扩增出的6条PEDV-M基因的遗传进化树分为二个大系,大部分遗传距离较近,处于同一分支。其中LJJHD-M-13和LJJQ-M-14与泰国KU06RB08、泰国KU07RB08的亲缘关系较近,LJJC-M-14、LJJJ-M-14、LJJH-M-13、LJMM-M-14这四株毒株与韩国M1595、韩国CPF259的亲缘关系较近,同时扩增出的6条PEDV-M基因不与CV777毒株为一系,与其亲缘性较远。说明这些地区的PEDV流行毒株已经发生变异,形成独特的流行进化分支,因此新的疫苗毒株和免疫方法的研究对预防和控制该病具有重要的意义。本研究进一步建立了PEDV的RT-LAMP检测方法。根据GenBank中发表的PEDV基因序列,用DNAstar软件进行分析对比后,针对PEDV-N基因进行引物设计。利用Primer Explorer5.0软件设计引物,经过严格筛选,最终确定一组引物,包括外引物F3、B3,内引物FIP、BIP。用此引物对病毒RNA进行RT-LAMP反应,并对实验反应条件进行了优化。结果表明,RT-LAMP检测方法的最佳反应条件为:反应温度为61℃,反应时间为50min,Mg2+2.5μL,dNTPs1.5μL,外引物和内引物最佳浓度比为1:4,即外引物（F3:B3=1:1）为1μL,内引物（FIP:BIP=1:1）为4μL。经过灵敏性、特异性、稳定性试验,结果表明,RT-LAMP的敏感性是RT-PCR的100倍,特异性强,且稳定性好。用本实验建立的RT-LAMP方法对125份样品提取的RNA进行检测后,与RT-PCR方法检测结果对比,二者符合率为100%,该检测方法,具有操作简便、敏感性高、特异性强、不需要昂贵的仪器设备,非常适合基层的检疫部门对猪流行性腹泻的监测与防控,在现实中具有广阔的应用价值。

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PRV流行毒株的分离鉴定及gE/gI双基因缺失疫苗株的免疫原性分析

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作者：陈铭泽东北农业大学

学位级别：硕士

伪狂犬病(Pseudorabies,PR,又名 Aujeszky’s disease)是一种由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起多种哺乳动物的急性、高度接触性传染病。猪伪狂犬病是猪的主要传染病之一,PRV可感染神经系统,感染后出现发热、脑脊髓炎等症状... 详细信息

伪狂犬病(Pseudorabies,PR,又名 Aujeszky’s disease)是一种由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起多种哺乳动物的急性、高度接触性传染病。猪伪狂犬病是猪的主要传染病之一,PRV可感染神经系统,感染后出现发热、脑脊髓炎等症状,严重可导致死亡,给世界各国猪养殖业造成了严重的经济损失。本研究的病料采自免疫了 PRV经典毒gE基因缺失弱毒活疫苗的黑龙江某发病猪场,取PRV发病典型的脑组织病料,根据GenBank PRV gE和gB保守序列设计鉴定引物,进行PCR扩增,在500bp和600bp左右出现了与预期大小一致的片段,初步确定为PRV野毒感染。通过对gE和gC基因进行序列测定,并进行同源性和遗传进化分析。结果显示,gE基因与参考毒株同源性在97.1%～100%,gC基因与参考毒株同源性在94.3%～100%。遗传进化分析结果显示,该分离毒株与我国近几年分离的流行变异株位于同一分支,而与国内外经典毒株分处不同分支;氨基酸序列分析结果显示,gE和gC存在国内流行变异株的特征序列,表明该分离毒株为流行变异株。利用BHK21细胞分离病毒,采用噬斑纯化方法对病毒进行纯化。将纯化后的病毒传代后,对收获的各代次病毒液进行TCID50测定,病毒滴度均可达108.0TCID50/mL以上。对病毒的纯净性进行检验,确定无细菌、霉菌和支原体污染。经特异性检验,病毒能被抗猪伪狂犬病毒特异性血清中和;间接免疫荧光实验结果显示病毒可与PRVgE单克隆抗体特异性结合,进一步证明分离纯化的病毒为PRV流行变异株,将该分离株命名为HLJ-01株。对分离株HLJ-01进行复制动力学分析,并绘制生长曲线,在感染48 h时病毒滴度最高(108.50 TCID50/mL)。透射电镜观察结果显示,病毒颗粒直径约为150 nm,呈球形,有囊膜,囊膜外有明显的放射状纤突,呈现典型疱疹病毒特征。对分离毒株HLJ-01进行了致病性研究,小鼠致病性实验结果显示,病毒对小鼠的半数致死量为104.32 LD50/0.1mL。仔猪致病性实验结果显示,104.0、105.0、106.0、107.0TCID50病毒感染猪后,均100%发病,死亡率分别为20%、60%、80%、100%。剖检病死猪观察各组织器官病理变化,所有攻毒猪均出现脑部出血,脾脏、肝脏部分坏死,淋巴结肿大出血,部分肺脏有少许实变。组织病理学检查结果显示,脑胶质细胞增生,神经元细胞大量变性;肺脏广泛性淤血、炎性浸润;扁桃体结缔组织增生;肝细胞广泛轻度变性;脾广泛性淋巴细胞减少;肾上皮细胞大量变性;心肌细胞萎缩,间质水肿,结缔组织增生。将本实验室前期构建的猪伪狂犬gE/gI双基因缺失毒株(WuC-ΔgE/gI株)制备灭活疫苗,并对制备工艺进行优化,确定细胞传代的最佳密度为6.0×105～8.0×105 cells/mL,接毒时最佳细胞密度为 3.0×106 cells/mL～4.0 ×106 cells/mL,病毒最佳接种剂量为 1‰(v/v)～1%(v/v)。对灭活疫苗进行性状检验、无菌检验和安全性检验,均符合标准。进一步对免疫效力进行分析,对免疫猪进行中和抗体测定,二免后28天血清中和抗体效价为1:84。免疫后攻毒实验结果显示,该疫苗能抵抗流行毒株的感染,攻毒保护率为100%。病理解剖结果显示,未免疫组表现为脑膜充血和出血;肝脏变性;肺部实变、坏死;心脏冠状动脉充血。疫苗免疫组剖检未见明显病理变化。组织病理学分析结果显示,攻毒对照组肺脏有广泛性淤血,炎性细胞浸润,大量浆液性渗出;扁桃体结缔组织增生;脑胶质细胞轻度增生,神经元细胞大量变性;腹股沟淋巴结可见髓质出血,有铁血黄素沉积;肝细胞广泛轻度变性;脾广泛性淋巴细胞减少;肾上皮细胞大量变性;心肌细胞萎缩,间质水肿。疫苗组和健康对照组各器官组织均无病变。对各组织器官进行病毒载量测定,结果显示攻毒对照组各器官病毒载量均在106 copies/g以上,其中脑部、肺部和扁桃体病毒拷贝数较高。免疫组各器官组织病毒载量均在103 copies/g 以下。综上,本研究分离获得一株猪伪狂犬病毒,经鉴定该分离株为流行变异株,且具有较强的致病力。利用已构建的双基因缺失疫苗株制备灭活疫苗,免疫仔猪后能抵抗流行毒株的攻击,证明其具有良好的免疫原性,为疫苗候选株的筛选和临床应用奠定基础。

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抗猪氨基肽酶单克隆抗体的制备及阻断氨基肽酶受体功能的分析

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作者：焦文超东北农业大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)和猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)这使两种病毒是哺乳仔猪高致死率的主要原因,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。如何有效防治这两种疾病是当前亟待解决的问题,而对... 详细信息

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)和猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)这使两种病毒是哺乳仔猪高致死率的主要原因,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。如何有效防治这两种疾病是当前亟待解决的问题,而对相关致病机理的研究可为有效防治提供理论依据。猪氨基肽酶(porcine aminopeptidase N,p APN)是一类锌离子依赖性的膜结合II型金属糖蛋白,存在于细胞表面,广泛分布于哺乳动物的多种组织细胞的表面,在中枢神经系统的突触膜、粒细胞和单核细胞、肾近曲小管上皮和肺脏细胞表面都有高水平的表达,尤其在小肠微绒毛表面大量存在,主要功能是水解肽、酰胺等结构中的酰胺键,从而释放出不同的N-中性氨基酸。APN作用的天然底物包括血管作用肽、神经肽激素、细胞因子和免疫调节剂等,因此它能参与很多重要过程的深度反应。研究发现,PEDV和TGEV均以pAPN作为细胞感染受体,同时p APN的抗体可以有效阻断p APN与PEDV和TGEV的结合。因此,制备抗p APN抗体及对其生物学特性的分析可以为有效防治PED和TGE提供理论依据和试验数据。本研究以天然p APN蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行融合,通过间接ELISA方法筛选,最终获得2株抗p APN的杂交瘤细胞系(命名为3E5和2E3),这两株细胞分泌的抗体亚类分别为IgG1和IgM,效价分别为1:1000和1:500。通过Western blot证实3E5株和2E3株分泌的抗体是针对p APN的SPC段(p APN 500aa-963aa段),且与天然p APN可发生特异性结合,免疫荧光实验证实3E5株和2E3分泌的抗体可以与IEC-2细胞和PK-15细胞上的天然p APN蛋白发生特异性结合。将抗p APN的单克隆抗体与IEC-2细胞和PK-15细胞作用后,再分别感染PEDV和TGEV,于接毒后24h、48h、72h在显微镜下观察病变效果,结果表明,抗p APN的单抗可有效阻断p APN受体,且IEC-2细胞和PK-15细胞病变均被不同程度的抑制。进一步收取吸附后、病毒感染24h和病毒感染48h的细胞感染物,提取RNA,通过荧光定量PCR检测病毒拷贝数,并对这三组样品进行显著性分析。结果表明,经p APN单克隆抗体作用后,细胞感染物中的病毒拷贝数显著降低,表明抗p APN单抗有效地阻断了p APN受体与病毒的结合,并进一步抑制了病毒的繁殖。将p APN单克隆抗体分别做1:10、1:100和1:1000倍稀释,将不同稀释度的p APN单抗分别与IEC-2细胞和PK-15细胞作用后,再接种PEDV和TGEV,于病毒吸附后,收取细胞感染物,提取RNA,通过荧光定量PCR检测病毒拷贝数,检测分析不同浓度p APN单抗对p APN受体的阻断作用。结果表明,不同浓度的pAPN单抗都具有阻断p APN受体,抑制p APN受体与病毒结合,从而抑制病毒在细胞中的吸附的能力,且随着单抗浓度的降低阻断作用也随之降低。此外,将抗p APN的单克隆抗体与IEC-2细胞和PK-15细胞作用后,再分别感染不同拷贝数的PEDV和TGEV,于病毒吸附后,收取细胞感染物,提取RNA,通过荧光定量PCR检测病毒拷贝数,检测分析p APN单抗对p APN受体阻断后对不同浓度病毒增殖的抑制作用。结果表明,p APN单抗对不同浓度的病毒都具有阻断作用,且不同浓度病毒组p APN单抗对p APN受体的阻断作用并无明显差异。以上结果证明,3E5株和2E3株分泌的抗体对p APN具有较高的特异性和亲和性,3E5株可有效阻断p APN受体与TGEV的结合,并抑制TGEV在细胞中的感染和增殖,为进一步设计抗病毒药物、封闭病毒受体、阻止病毒感染等研究奠定基础。

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金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定及对治疗乳腺炎的初步应用

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作者：汤婷婷东北农业大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为葡萄球菌属的革兰阳性球菌,可引起食物中毒、心内膜炎、葡萄球菌烫伤皮肤综合征和中毒性休克综合征,是一种常见的人兽共患病病原。目前治疗金黄色葡萄球菌主要是使用抗生素,而抗生素的滥用导致... 详细信息

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为葡萄球菌属的革兰阳性球菌,可引起食物中毒、心内膜炎、葡萄球菌烫伤皮肤综合征和中毒性休克综合征,是一种常见的人兽共患病病原。目前治疗金黄色葡萄球菌主要是使用抗生素,而抗生素的滥用导致金黄色葡萄球菌耐药菌株愈来愈多,给临床治疗带来困难。本研究通过噬菌体富集法从猪粪中分离出5株金黄色葡萄球菌烈性噬菌体,分别命名为4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6。通过电镜观察,5株噬菌体均具有典型的二十面体头部和不能收缩的短尾部,属于尾噬菌体目、短尾噬菌体科。通过对噬菌体基因组进行限制性内切酶(Eco R Ⅰ、Hpa Ⅰ、Rsr Ⅱ、Sac Ⅰ、Sph Ⅰ、Bgl Ⅱ、SMa Ⅱ、Sac Ⅱ、Sna B Ⅰ、Avr Ⅱ、Pst Ⅰ)分析,结果表明噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6是5株不同的噬菌体。宿主范围测定结果显示,4086-1、4086-2、4086-3可感染金黄色葡萄球菌*** CVCC546、*** 4086、*** Ben和*** ATCC 43300,4086-4和4086-6均可感染金黄色葡萄球菌*** CVCC 546和*** 4086。一步生长曲线测定结果显示,噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6的潜伏期分别为10 min、10 min、20 min、20 min和10min;裂解周期分别为90 min、100 min、80 min、80 min和90 min;裂解量分别为365.7PFU/infected cell、400 PFU/infected cell、19.4 PFU/cell、149.4 PFU/infected cell和52.4PFU/infected cell。研究不同理化因素对噬菌体的影响结果显示,噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6在-20～42℃范围内,均能稳定存活,62℃以上作用40 min全部失活。噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6在p H 4～10的环境中较为稳定,表明噬菌体有较强的酸碱耐受性。噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6在75%乙醇中作用30 min后完全灭活;在80%丙酮中作用30 min后,效价分别降低1、1、1、1.5和2个数量级;但对DMSO和氯仿不敏感,能够稳定存活。通过检测不同去污剂对噬菌体的作用,结果显示,5株噬菌体经0.1%SDS处理30 min后,均完全失活;噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6在0.1%月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)、0.1%CTAB和0.1%苯扎溴铵中作用30min后,效价均无明显变化。检测渗透压对噬菌体的活性影响,结果表明随着溶液中氯化钠浓度的升高(0～4.5M),噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6效价均无明显变化,表明5株噬菌体对渗透压有一定的耐受能力。分析二价阳离子(钙、镁离子)对噬菌体的影响,结果表明4086-1和4086-3在添加钙离子的LB培养基中,效价最高;噬菌体4086-2和4086-6在添加钙离子和镁离子的LB培养基中,效价最高;噬菌体4086-4在添加镁离子的LB培养基中滴度最高。通过研究噬菌体感染后金黄色葡萄球菌的动态变化来观察噬菌体裂解细菌的能力,结果表明,噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6以不同MOI(MOI为0.01、0.1、1.0、10)感染细菌后,均能显著降低金黄色葡萄球菌数量,8小时后,细菌数量开始上升,表明产生部分噬菌体抗性菌。通过分析噬菌体对金黄色葡萄球菌ATCC 43300生物膜形成的影响,结果显示,噬菌体4086-1清除生物膜的能力最强。利用金黄色葡萄球菌ATCC 43300(耐甲氧西林金葡菌)建立小鼠乳腺炎模型,应用噬菌体治疗后,结果表明噬菌体能够有效地降低乳腺组织中的细菌数,病理结果表明噬菌体治疗后,乳腺组织腺泡内炎性浸润减少。通过ELISA检测乳腺组织中的细胞因子水平,结果显示,同对照组相比,噬菌体治疗组和抗生素治疗组的促炎性因子TNF-α和IL-6均显著降低,且噬菌体治疗组的促炎性因子水平低于抗生素治疗组,表明经噬菌体治疗后可有效缓解炎症反应。综上,本研究分离了5株金黄色葡萄球菌噬菌体,鉴定了它们的生物学特性,为其应用提供了重要的实验数据。通过分析噬菌体在体外对金黄色葡萄球菌生物膜的破坏作用,并应用其对小鼠乳腺炎模型进行治疗,为金黄色葡萄球

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干酪乳杆菌菌影作为DNA疫苗包装载体对免疫应答的影响

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作者：侯瑞东北农业大学

学位级别：硕士

DNA疫苗与传统疫苗相比,具有明显的优势。但由于DNA为生物大分子,难以被细胞直接摄入,而且核酸容易降解。因此“裸”DNA疫苗难以被抗原提呈细胞摄入、表达及抗原递呈,导致免疫应答水平较低,其推广使用受到限制。细菌菌影(bacterial ghos... 详细信息

DNA疫苗与传统疫苗相比,具有明显的优势。但由于DNA为生物大分子,难以被细胞直接摄入,而且核酸容易降解。因此“裸”DNA疫苗难以被抗原提呈细胞摄入、表达及抗原递呈,导致免疫应答水平较低,其推广使用受到限制。细菌菌影(bacterial ghosts,BGs)是裂解细菌细胞壁、去除细胞质内容物之后形成的细菌空壳。它具有完整的天然表面抗原,不仅能直接作为疫苗使用,还可以作为一种良好的载体。本研究利用干酪乳杆菌菌影作为包装载体,分析其对DNA免疫效果的影响。首先,将质粒pCI-EGFP和菌影装载的pCI-EGFP分别与RAW264.7细胞和原代巨噬细胞混匀,未处理的巨噬细胞作为对照,通过荧光显微镜观察。结果显示:质粒转染RAW264.7细胞和原代巨噬细胞后,只观察到微弱的荧光,而菌影装载质粒转染RAW264.7细胞和原代巨噬细胞后,可观察到大量绿色荧光,表明EGFP在转染细胞中获得了有效表达。同时,通过流式细胞仪检测转染效率,结果显示:质粒转染RAW264.7细胞和原代巨噬细胞后,阳性细胞率分别为1.4%和1.8%,而菌影装载质粒转染RAW264.7细胞和原代巨噬细胞后,阳性细胞率分别为7.2%和57.6%。转染效率明显提高,进一步验证了荧光显微镜的观察结果,表明干酪乳杆菌菌影可有效促进巨噬细胞对DNA的转染。通过荧光定量PCR检测巨噬细胞中IL-1β、IL-10、TNF-α、iNOS细胞因子和Toll受体基因mRNA的变化,结果显示:干酪乳杆菌菌影包装DNA刺激巨噬细胞后,IL-1β、IL-10、TNF-α、iNOS、TLR2和TLR9 mRNA含量增加,TLR4 mRNA含量降低。说明菌影包装DNA转染巨噬细胞后,可显著调节相关免疫分子基因表达。分别用pCI-PRV-VP6质粒和菌影装载pCI-PRV-VP6质粒刺激骨髓来源的树突细胞,未处理的树突细胞作为对照,通过流式细胞仪检测树突细胞表面成熟标志分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86的数量变化。结果显示:经干酪乳杆菌菌影刺激后,树突细胞成熟标志分子含量均增加,表明干酪乳杆菌菌影能够刺激树突细胞成熟。通过荧光定量PCR检测不同处理的树突细胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ基因mRNA含量变化。结果显示:干酪乳杆菌菌影包装DNA刺激树突细胞后,以上基因mRNA含量均显著增加。说明菌影包装DNA刺激树突细胞后,可显著上调相关基因表达。混合淋巴细胞反应结果显示:当树突细胞与T细胞混合比例为1:1和1:10时,菌影包装DNA刺激后的树突细胞能够有效刺激T细胞增殖,表明菌影可促进树突细胞的成熟和活化。最后,分别用pCI-PoRV-VP6和干酪乳杆菌菌影包装的pCI-PoRV-VP6经口服、肌肉和腹腔免疫小鼠,检测菌影包装DNA后对免疫效果的影响,间接ELISA方法检测血清中特异性IgG水平。结果显示:经口服、肌肉和腹腔不同途径免疫后,菌影包装DNA组的血清IgG含量显著高于DNA免疫组,表明菌影包装DNA免疫后可有效提高体液免疫效果。应用MTT法检测淋巴细胞增殖指数,结果显示:经口服和腹腔免疫后,菌影包装DNA组的脾细胞增殖指数显著高于DNA免疫组。经肌肉免疫后,菌影包装DNA组和DNA免疫组的脾细胞增殖指数差异不显著。通过流式细胞仪检测CD4/CD8T细胞比例,结果显示:通过口服和腹腔免疫后,菌影包装DNA组与DNA免疫组相比,CD4T细胞比例均显著增加,表明菌影包装DNA免疫后,显著提高了细胞免疫水平。应用ELISA方法检测IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子,结果显示:菌影包装DNA组的血清细胞因子含量显著高于DNA免疫组,表明菌影包装DNA免疫后,增加细胞因子的分泌。综上,将干酪乳杆菌菌影包装DNA后,能够提高DNA在巨噬细胞中的转染效率,并促进树突细胞成熟和活化,进一步调节免疫相关因子基因的表达,从而有效提高体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制新型、安全、有效的DNA递送载体,提供了一个新的技术平台,也为其他蛋白质或药物以干酪乳杆菌菌影作为递送载体的研究提供了参考。

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表达产气荚膜梭菌α-β2-ε-β1毒素的重组干酪乳杆菌的安全性评价及免疫效果的分析

表达产气荚膜梭菌α-β2-ε-β1毒素的重组干酪乳杆菌的安全性评...

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作者：郭志侯东北农业大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)属于梭菌属(Clostridium),是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及动物坏死性肠炎、肠毒血症等多种疾病的主要病原菌。菌体分泌的外毒素是其主要的致病因子,可以产生多达16种,根据产生的外毒素种类不... 详细信息

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)属于梭菌属(Clostridium),是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及动物坏死性肠炎、肠毒血症等多种疾病的主要病原菌。菌体分泌的外毒素是其主要的致病因子,可以产生多达16种,根据产生的外毒素种类不同,可分为A、B、C、D和E 5个血清型,其中α、β、ε和ι是最主要的外毒素。产气荚膜梭菌感染是人、多种家畜、经济动物、野生动物最常见的一种人兽共患病,其发病急、死亡快,给我国畜牧业发展带来巨大的经济损失。疾病的发生通常是通过多种毒素共同作用引起,用单一毒素为免疫原制备的疫苗不能有效的抵抗异源毒素的攻击,因此制备多种毒素的免疫原,对于预防该疾病的发生更具有实际意义。本研究首先对实验室构建的重组干酪乳杆菌p PG-2-α-β-ε-β/*** 393进行生物安全评价。通过重组干酪乳杆菌在消化环境中生存性能及口服后在动物消化道内的定植能力、对兔子生产性能、血液理化指标、组织病理学、释放到环境中的能力进行研究。结果显示该重组干酪乳杆菌在p H值为4.5的胃液环境中作用5h后存活率为14.96%。在肠液环境中作用不同时间以后,在各个时间点均能检测到活菌数而且其存活率均大于2%,对2%胆盐浓度和8%的盐浓度具有良好的耐受能力。口服重组菌后第14d,仍保持较高的定植率,分别为15.1%,25.3%,48.2%,29.3%,可知重组菌在动物机体内各个肠段的定植能力都不一样,并且其在盲肠中的定植率最高。口服接种后未引起中毒反应和死亡,动物日采食量和日增重量与PBS组相比有明显的提高,且对兔子的血液生理指标和肝、肾功能等均无影响,组织病理学观察各组织也未发现病理学变化。通过PCR方法对饲料、饮水、笼子拭子、垫料样品进行检测,结果显示均未检测到重组干酪乳杆菌,表明重组干酪乳杆菌经口服后没有释放到环境中。为了进一步探讨重组干酪乳杆菌的免疫效果,本研究用产气荚膜梭菌易感动物兔子作为实验动物,进行口服免疫。实验动物分为三组,实验Ⅰ组口服免疫p PG-2-α-β-ε-β/*** 393重组菌,剂量为5×1010CFU/只;实验Ⅱ组每只兔子口服同等剂量的p PG-2/*** 393;实验组III口服同等剂量的PBS溶液。免疫程序为:共免疫三次,每次免疫间隔时间为2w,每次连续免疫3d,每天免疫1次。于免疫后不同时间收集动物粪便、鼻腔冲洗液和血清,分别测定了粪便、鼻腔冲洗液中特异性s Ig A水平以及血清中特异性IgG水平。ELISA检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后,粪便、鼻腔冲洗液样品中均检测到了较高水平的特异性s Ig A,与空载体组、PBS组比较,结果差异显著,同时在血清中也检测到了较高水平的特异性Ig G抗体,表明口服重组干酪乳杆菌既可诱导机体产生局部的黏膜免疫应答,又可刺激机体产生系统的体液免疫应答。第三次免疫后7天,进行了毒素攻毒实验和组织病理学观察,以检测分析口服重组干酪乳杆菌对动物的保护作用。试验结果显示,免疫重组干酪乳杆菌后产生的特异性抗体能够完全抵抗1LD100的产气荚膜梭菌天然毒素的攻击。综上,口服重组干酪乳杆菌p PG-2-α-β-ε-β/*** 393对动物具有较好的安全性,不会引起动物生产性能、血液理化指标、组织病理学的变化,且不会释放到环境中。口服后可有效诱导机体产生黏膜免疫应答和体液免疫应答,对动物机体有良好的保护作用,通过本研究的开展,为产气荚膜梭菌α-β-ε-β毒素重组乳酸杆菌口服疫苗的应用奠定了基础。

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一株IBDV超强毒株的分离鉴定及VP2蛋白亚单位疫苗的免疫原性分析

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作者：王彩虹东北农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的以侵害雏鸡中枢免疫器官法氏囊为主要特征的急性、高度传染性的免疫抑制性疾病。IBD自发现以来,在世界各地广泛流行... 详细信息

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的以侵害雏鸡中枢免疫器官法氏囊为主要特征的急性、高度传染性的免疫抑制性疾病。IBD自发现以来,在世界各地广泛流行,随着IBDV变异毒株的出现,传统疫苗不能产生有效的免疫保护,给养禽业造成了严重的经济损失。本研究将绥化某鸡场疑似鸡传染性法氏囊病发病鸡的法氏囊病料进行处理,根据Gen Bank中IBDV VP2和VP5基因序列的重叠区设计一对鉴定引物,进行PCR扩增,可扩增出约300 bp的特异性条带,与预期大小相符,经测序鉴定正确,初步鉴定为IBDV。将处理的病料接种鸡胚进行病毒分离,鸡胚出现绒毛尿囊膜增厚,胚体水肿、出血等典型的IBD病变。采用蚀斑纯化方法,将分离的病毒在DF1细胞上进行纯化,纯化后的病毒进行琼脂扩散试验、特异性试验、血凝试验、外源病毒检验、PCR鉴定、VP2基因的遗传进化分析和氨基酸同源性分析。琼脂扩散试验显示,纯化后的病毒能与IBDV特异性血清结合形成特异性沉淀线;特异性实验结果显示,纯化的病毒可被IBDV特异性血清中和;血凝试验和外源病毒检验结果显示,纯化病毒无血凝性,且无其他外源病毒污染;对纯化病毒进行PCR和测序鉴定结果正确,命名为IBDV-SH株。扩增分离株VP2基因,进行遗传进化分析,结果显示,分离株IBDV-SH与超强毒株OKYM和HK46处于同一分支;VP2氨基酸序列同源性分析结果显示,VP2氨基酸序列与超强毒株OKYM、HLJ-7、UK661、HK46、Gx氨基酸序列同源性达100%,推测分离株IBDV-SH可能为超强毒株。对IBDV-SH分离株进行致病性分析,分别感染10日龄SPF鸡胚和6周龄SPF鸡,结果显示对鸡胚的半数致死量(ELD)为10/0.2m L,对鸡的半数致死量(LD)为10/0.1m L,半数感染量为10/0.1m L。利用q PCR方法检测感染鸡各组织器官病毒载量,结果显示法氏囊、泄殖腔和肾脏等脏器中病毒拷贝数较高,肺脏中病毒含量相对最少。将纯化的病毒灭活后,免疫21日龄SPF鸡,免疫后21 d,收集血清,检测琼脂扩散(AGP)效价为1:12.8,同时将IBDV-SH株以100 BID/只感染免疫鸡,结果显示保护率为80%,表明该分离毒株具有良好的免疫原性。进一步将IBDV-SH分离株VP2基因克隆至原核表达载体p ET-28a,转化大肠杆菌,诱导表达VP2蛋白。通过琼脂扩散检测,目的蛋白可与IBDV抗体反应,形成特异性沉淀线;Western blot检测结果显示,在50 k Da处出现特异性条带,符合目的蛋白大小,且主要以可溶形式表达。对诱导剂乳糖浓度、诱导时间、温度及起始菌液浓度进行优化,确定诱导剂乳糖浓度为0.03 mol/L,诱导时间为5 h,诱导起始菌液浓度OD为0.5～0.6,诱导温度为37℃。经不同饱和度硫酸铵处理蛋白后,结果显示40%饱和度硫酸铵可以沉淀全部VP2蛋白,经AGP和SDS-PAGE检测,表达蛋白纯化结果较好。取AGP效价为1:8、1:16、1:32的VP2蛋白,经灭活、乳化后配制疫苗,进行剂型检验、无菌检验、稳定性和安全性检验,均符合标准。将制备的亚单位疫苗和IBDV商品疫苗分别免疫21日龄SPF鸡,免疫后21 d,对血清抗体进行AGP效价测定,商品疫苗免疫组AGP抗体效价为10.6,AGP效价为1:8、1:16、1:32的VP2蛋白疫苗免疫组的AGP抗体效价分别为1:6.1、1:8.0、1:18.4,对照组血清未检出AGP抗体效价。经点眼途径感染IBDV BC6/85,结果显示,AGP效价为1:8、1:16、1:32的VP2蛋白疫苗免疫组的攻毒保护率分别为60%、80%、100%;对免疫组和对照组鸡进行剖检,健康鸡各组织脏器未见病理变化,攻毒对照组可见胸肌、腿肌出血,法氏囊胶冻样病变、出血、萎缩或肿大等病理变化,免疫组剖检未见明显病理变化。组织病理学分析结果显示,攻毒对照组鸡的法氏囊滤泡内淋巴细胞数量减少;胸腺部分髓质上皮细胞变性、坏死;脾脏红髓和白髓内大量淋巴细胞坏死,免疫组和健康对照组均未见明显的组织病理学变化。综上,本研究通过分离IBDV超强毒株,构建可溶性表达其VP2蛋白的重组大肠杆菌,并对表达的VP2蛋白进行免疫原性分析,为研发有效预防IBDV流行变异毒株的基因工程亚单位疫苗奠定基础。

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