金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定及对治疗乳腺炎的初步应用

作     者：汤婷婷 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：乔薪瑗

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：金黄色葡萄球菌 噬菌体 生物学特性 生物膜 乳腺炎 

摘      要：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为葡萄球菌属的革兰阳性球菌,可引起食物中毒、心内膜炎、葡萄球菌烫伤皮肤综合征和中毒性休克综合征,是一种常见的人兽共患病病原。目前治疗金黄色葡萄球菌主要是使用抗生素,而抗生素的滥用导致金黄色葡萄球菌耐药菌株愈来愈多,给临床治疗带来困难。本研究通过噬菌体富集法从猪粪中分离出5株金黄色葡萄球菌烈性噬菌体,分别命名为4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6。通过电镜观察,5株噬菌体均具有典型的二十面体头部和不能收缩的短尾部,属于尾噬菌体目、短尾噬菌体科。通过对噬菌体基因组进行限制性内切酶(Eco R Ⅰ、Hpa Ⅰ、Rsr Ⅱ、Sac Ⅰ、Sph Ⅰ、Bgl Ⅱ、SMa Ⅱ、Sac Ⅱ、Sna B Ⅰ、Avr Ⅱ、Pst Ⅰ)分析,结果表明噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6是5株不同的噬菌体。宿主范围测定结果显示,4086-1、4086-2、4086-3可感染金黄色葡萄球菌*** CVCC546、*** 4086、*** Ben和*** ATCC 43300,4086-4和4086-6均可感染金黄色葡萄球菌*** CVCC 546和*** 4086。一步生长曲线测定结果显示,噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6的潜伏期分别为10 min、10 min、20 min、20 min和10min;裂解周期分别为90 min、100 min、80 min、80 min和90 min;裂解量分别为365.7PFU/infected cell、400 PFU/infected cell、19.4 PFU/cell、149.4 PFU/infected cell和52.4PFU/infected cell。研究不同理化因素对噬菌体的影响结果显示,噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6在-20～42℃范围内,均能稳定存活,62℃以上作用40 min全部失活。噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6在p H 4～10的环境中较为稳定,表明噬菌体有较强的酸碱耐受性。噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6在75%乙醇中作用30 min后完全灭活;在80%丙酮中作用30 min后,效价分别降低1、1、1、1.5和2个数量级;但对DMSO和氯仿不敏感,能够稳定存活。通过检测不同去污剂对噬菌体的作用,结果显示,5株噬菌体经0.1%SDS处理30 min后,均完全失活;噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6在0.1%月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)、0.1%CTAB和0.1%苯扎溴铵中作用30min后,效价均无明显变化。检测渗透压对噬菌体的活性影响,结果表明随着溶液中氯化钠浓度的升高(0～4.5M),噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6效价均无明显变化,表明5株噬菌体对渗透压有一定的耐受能力。分析二价阳离子(钙、镁离子)对噬菌体的影响,结果表明4086-1和4086-3在添加钙离子的LB培养基中,效价最高;噬菌体4086-2和4086-6在添加钙离子和镁离子的LB培养基中,效价最高;噬菌体4086-4在添加镁离子的LB培养基中滴度最高。通过研究噬菌体感染后金黄色葡萄球菌的动态变化来观察噬菌体裂解细菌的能力,结果表明,噬菌体4086-1、4086-2、4086-3、4086-4和4086-6以不同MOI(MOI为0.01、0.1、1.0、10)感染细菌后,均能显著降低金黄色葡萄球菌数量,8小时后,细菌数量开始上升,表明产生部分噬菌体抗性菌。通过分析噬菌体对金黄色葡萄球菌ATCC 43300生物膜形成的影响,结果显示,噬菌体4086-1清除生物膜的能力最强。利用金黄色葡萄球菌ATCC 43300(耐甲氧西林金葡菌)建立小鼠乳腺炎模型,应用噬菌体治疗后,结果表明噬菌体能够有效地降低乳腺组织中的细菌数,病理结果表明噬菌体治疗后,乳腺组织腺泡内炎性浸润减少。通过ELISA检测乳腺组织中的细胞因子水平,结果显示,同对照组相比,噬菌体治疗组和抗生素治疗组的促炎性因子TNF-α和IL-6均显著降低,且噬菌体治疗组的促炎性因子水平低于抗生素治疗组,表明经噬菌体治疗后可有效缓解炎症反应。综上,本研究分离了5株金黄色葡萄球菌噬菌体,鉴定了它们的生物学特性,为其应用提供了重要的实验数据。通过分析噬菌体在体外对金黄色葡萄球菌生物膜的破坏作用,并应用其对小鼠乳腺炎模型进行治疗,为金黄色葡萄球