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发热伴血小板减少综合征病毒非结构蛋白的表达和定位及宿主互作蛋白的筛选和分析

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吉林大学学报（医学版） 2024年第5期50卷 1286-1296页

作者：骆丽可程子文程廓李永刚王大为杨宝玲锦州医科大学基础医学院病原生物学教研室辽宁锦州121000 锦州医科大学畜牧兽医学院基础兽医学教研室辽宁锦州121000

目的:通过免疫沉淀联合质谱分析的方法筛选发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)非结构蛋白(NSs)的宿主互相作用(互作)蛋白,探讨互作蛋白的功能、亚细胞定位及参与的生物途径,为阐明SFTSV的复制和致病机制提供依据。方法:将真核表达载体pS... 详细信息

目的:通过免疫沉淀联合质谱分析的方法筛选发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)非结构蛋白(NSs)的宿主互相作用(互作)蛋白,探讨互作蛋白的功能、亚细胞定位及参与的生物途径,为阐明SFTSV的复制和致病机制提供依据。方法:将真核表达载体pSFTSV-NSs-Flag (实验组)和Flag-CMV-3 (阴性组)分别转染进人胚胎肾293T细胞中,同时设置空白组(不进行任何处理)。收集各组细胞裂解液,采用间接免疫荧光和Western blotting法验证SFTSV NSs在宿主细胞中的表达及定位。蛋白裂解液经protein A/G处理,采用免疫沉淀法富集与NSs结合的宿主蛋白,通过银染和考马斯亮蓝染色初步分析捕获的互作蛋白,观察各组蛋白差异条带。采用液相色谱和串联质谱技术得到蛋白质的序列信息,保留可信蛋白基于UniProt数据库检索,对鉴定到的蛋白进行基因本体论(GO)功能富集分析、蛋白结构域和功能位点数据库(IPR)、真核生物同源蛋白簇(KOGs)功能注释、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析、亚细胞定位和转录因子(TF)功能注释,确定互作蛋白的亚细胞结构、基因功能及参与的生物过程。结果:SFTSV NSs在相对分子质量33 000处表达单一特异性条带,免疫荧光检测其定位于细胞质中,且聚集呈砂粒体包涵体样。银染和考马斯亮蓝染色,实验组和阴性组均存在显著差异条带。质谱筛选出46种潜在互作蛋白;GO功能富集分析、KOGs功能注释和KEGG信号通路富集分析,与病毒翻译、细胞代谢及蛋白质运输相关的生物途径富集到较多数目的蛋白,注释中有8种蛋白具有中间丝蛋白结构域。亚细胞定位所占百分率最高的是细胞质蛋白;与NSs定位场所一致。TF功能注释,有1种蛋白来自NF-Y家族。结论:互作蛋白在协助蛋白质正确折叠、参与核糖体翻译和构成细胞骨架等进程中发挥作用,可能参与了抗病毒复制,可作为候选蛋白进一步研究SFTSV的复制机制。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒非结构蛋白蛋白-蛋白互相作用免疫沉淀质谱

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小鼠抗寨卡病毒包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2024年第5期40卷 447-454页

作者：薛潘董阳超武福星陈洋张剑元航武苏闪袁若栋李宝莉雷迎峰延安大学医学院陕西延安716000 空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室陕西西安710032

目的制备小鼠抗寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体。方法首先构建ZIKV Eecto的原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,将其转化至大肠杆菌感受态BL21后,利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组Eecto蛋白以包涵体形式表... 详细信息

目的制备小鼠抗寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体。方法首先构建ZIKV Eecto的原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,将其转化至大肠杆菌感受态BL21后,利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组Eecto蛋白以包涵体形式表达,经过变性、复性和超滤获得纯化的蛋白。将Eecto蛋白3次免疫后,获得多克隆抗体血清,进行效价测定,并利用ZIKV prME真核表达质粒转染的HEK293T细胞进行Western blot法和免疫荧光法分析。取效价较高的小鼠脾脏制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法获取分泌抗体的杂交瘤细胞,并进一步制备腹水。对腹水进行抗体效价测定、亚类分析。以ZIKV同属病毒日本脑炎病毒(JEV)、黄热病病毒(YFV)、登革病毒1-4(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)的Eecto为包被抗原,利用ELISA分析ZIKV单克隆抗体的交叉反应性,进一步对效价高、特异性强的抗体进行特异性分析。结果成功构建了原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,并获得纯化的Eecto蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性;制备筛选得到1D6、4F11、4H7、4F8四株单克隆抗体,其中三株(1D6、4H7、4F8)为IgGκ型抗体,一株(4F11)为IgMκ,1D6腹水效价大于1∶108;其中1D6和4H7为ZIKV特异性抗体,与其他黄病毒无交叉反应。结论成功制备了小鼠抗ZIKV Eecto单克隆抗体,为后续建立ZIKV检测方法及致病机制研究提供了实验材料。

关键词：寨卡病毒(ZIKV) 包膜蛋白胞外区(Eecto) 原核表达单克隆抗体

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亚精胺抑制核糖体DNA转录

科学通报 2024年第15期69卷 2072-2080页

作者：许银丰万伟湖南第一师范学院基础生物学实验室长沙410205 浙江大学医学院生物化学系杭州310058

核糖体是细胞内合成蛋白的唯一细胞器,主要由核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)和核糖体蛋白组装形成.rDNA转录生成rRNA在细胞内的核仁处完成,是核糖体生物发生的重要限速步骤之一.在正常细胞内,核糖体DNA(ribosomal DNA,rDNA)的转录活性... 详细信息

核糖体是细胞内合成蛋白的唯一细胞器,主要由核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)和核糖体蛋白组装形成.rDNA转录生成rRNA在细胞内的核仁处完成,是核糖体生物发生的重要限速步骤之一.在正常细胞内,核糖体DNA(ribosomal DNA,rDNA)的转录活性受到营养状态的严密调控.而在癌细胞内,癌基因的激活、抑癌基因的失活和生长相关信号通路的失调等多种不同的机制均可导致rDNA的转录绕过营养状态的控制.癌细胞内异常激活的rDNA转录是癌细胞快速生长、增殖的必要前提,也是癌细胞的共有特征之一.抑制癌细胞内异常激活的r DNA转录有望开发出新的抗癌药物.我们既往的研究揭示,肿瘤蛋白p53诱导核蛋白2(tumor protein p53 inducible nuclear protein 2,TP53INP2)的核仁定位是其促进rDNA转录的重要前提,可用来指示细胞内的rDNA转录活性.本研究发现,天然活性成分亚精胺可抑制TP53INP2的核仁定位,并显著降低细胞的rDNA转录活性.机制研究表明,亚精胺可抑制蛋白激酶雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1)的必需亚基Raptor的乙酰化并降低细胞内m TORC1的活性,进而抑制r DNA的转录.功能研究揭示,亚精胺可显著抑制蛋白的合成和细胞的增殖.本研究提示,抑制细胞内的r DNA转录活性可能是亚精胺发挥抗癌作用的重要机制之一.

关键词：癌症 mTORC1 rDNA转录核糖体生物发生亚精胺

CXCL8通过增加M2型巨噬细胞浸润及抑制CD8+T细胞浸润促进结直肠癌免疫抑制微环境的形成

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细胞与分子免疫学杂志 2024年第10期 880-886页

作者：邵莹兰燕宋冰孙嘉颖杨涛山西医科大学基础医学院病理生理学教研室山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室山西医科大学基础医学院药理学教研室

目的探讨CXC趋化因子配体8（CXCL8）对结直肠癌（CRC）微环境的免疫调节作用。方法使用过表达CXCL8的鼠源CRC细胞株CT26细胞建立BALB/c小鼠皮下移植瘤模型，监测肿瘤生长情况，成瘤三周后剥离肿瘤组织并取出小鼠脾脏，一方面制备肿瘤... 详细信息

目的探讨CXC趋化因子配体8（CXCL8）对结直肠癌（CRC）微环境的免疫调节作用。方法使用过表达CXCL8的鼠源CRC细胞株CT26细胞建立BALB/c小鼠皮下移植瘤模型，监测肿瘤生长情况，成瘤三周后剥离肿瘤组织并取出小鼠脾脏，一方面制备肿瘤单细胞悬液，流式细胞术检测肿瘤微环境中M2型巨噬细胞及CD8+T细胞的浸润情况；另一方面制备脾脏单细胞悬液，分选脾脏CD8+T细胞，在体外将T细胞与过表达CXCL8的CT26细胞共培养，细胞毒性实验检测T细胞杀伤能力。结果过表达CXCL8促进小鼠CRC移植瘤生长；过表达CXCL8的CRC组织中M2型巨噬细胞浸润增加、 CD8+T细胞浸润减少；过表达CXCL8的小鼠CRC细胞并不影响CD8+T细胞体外杀伤能力。结论 CXCL8过表达CRC细胞通过增加M2型巨噬细胞浸润及抑制CD8+T细胞浸润促进CRC免疫抑制微环境的形成。

关键词： CXC趋化因子配体8(CXCL8) M2型巨噬细胞 CD8+ T细胞结直肠癌(CRC)

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糖尿病诱导的小鼠室旁核催产素和加压素阳性神经元FOS表达

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神经解剖学杂志 2024年第1期40卷 35-42页

作者：王淑敏贾鹏任淑婷吕思婷张婷杨彦玲史娟延安大学医学院生理学教研室延安716000 空军军医大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研室西安710032 中国人民解放军94750部队医院龙岩366200 延安大学医学院解剖学教研室延安716000 延安大学医学院病原生物学教研室延安716000

目的:探索糖尿病(DM)不同状态下小鼠下丘脑室旁核(PVN)催产素和加压素阳性神经元的FOS表达变化。方法:腹腔注射溶媒或链脲佐菌素(STZ)制备对照组或糖尿病小鼠模型,根据机械痛测试区分糖尿病痛(DNP组)与非痛组(DWP组)。采用免疫组化和免... 详细信息

目的:探索糖尿病(DM)不同状态下小鼠下丘脑室旁核(PVN)催产素和加压素阳性神经元的FOS表达变化。方法:腹腔注射溶媒或链脲佐菌素(STZ)制备对照组或糖尿病小鼠模型,根据机械痛测试区分糖尿病痛(DNP组)与非痛组(DWP组)。采用免疫组化和免疫荧光染色技术检测PVN内FOS、催产素(OXT)和加压素(VP)阳性神经元的分布及双标情况,并进行计数和比较。结果:7 d时三组(Control组、DNP组和DWP组)小鼠PVN内均有较多的FOS表达,而28 d时DWP和DNP组FOS的表达几近于无,与7 d组相比差异显著(P<0.05或0.001)。与对照组相比,DNP组和DWP组动物的VP和OXT荧光染色同样存在随着造模时间延长染色强度减弱的趋势(P<0.05)。VP、OXT与FOS的双标染色计数结果显示,在DWP 7 d组,VP/FOS双标细胞数为74.33±22.10,占VP阳性细胞数的(56.64±7.52)%,而OXT/FOS的双标率则仅为(10.44±3.14)%。在DNP 7 d组,OXT/FOS双标细胞数为51.00±31.80,占OXT阳性细胞数的(18.50±9.51)%,而VP/FOS的双标率仅为(9.34±3.27)%。与此相对,28 d组FOS的表达锐减,几乎无双标细胞。结论:下丘脑PVN内的VP和OXT阳性神经元在糖尿病痛与非痛,疾病发展的不同阶段存在明显不同的可塑性变化特点,理解这些变化对于揭示糖尿病及其并发症的神经机制具有重要意义。

关键词：糖尿病神经病理性痛下丘脑室旁核催产素加压素小鼠

新医科背景下应用型医学院校基础医学课程改革探索

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基础医学教育 2024年第3期26卷 207-211页

作者：程红兵陈云霞张毅强王佳张雄鹰原丽王金胜长治医学院微生物学教研室长治046000 长治医学院生物化学与分子生物学教研室长治医学院免疫学教研室长治医学院生理学教研室长治医学院病理学教研室

在新医科背景下,应用型医学院校基础医学课程势必面临变革。文章在分析现阶段基础医学教学改革存在主要问题的基础上,通过优化基础医学课程教学体系、成立虚拟教研室、建立课程思政素材库、加强线上线下混合式课程建设、构建整合实验教... 详细信息

在新医科背景下,应用型医学院校基础医学课程势必面临变革。文章在分析现阶段基础医学教学改革存在主要问题的基础上,通过优化基础医学课程教学体系、成立虚拟教研室、建立课程思政素材库、加强线上线下混合式课程建设、构建整合实验教学体系、改革考核评价体系等举措,推进了基础医学教育创新建设,并提出新医科背景下基础医学课程建设持续改进的若干思路和对策,为应用型医学人才培养提供有益的探索。

关键词：基础医学教学改革教学重构知识图谱评价体系新医科

赖氨酰氧化酶LOXL2稳定性的理论计算研究

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中国生物化学与分子生物学报 2024年第5期40卷 685-695页

作者：林李锐林凯邹海鹰许丽艳李恩民东庚汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室广东汕头515041 汕头大学医学院生物信息学教研室广东汕头515041 汕头大学医学院医学信息学研究中心广东汕头515041 汕头大学医学院广东省沿海高发地区分子生物学重点实验室广东汕头515041 汕头大学医学院肿瘤研究中心广东汕头515041 汕头市医学科学院广东汕头515041

赖氨酰氧化酶LOXL2是一种依赖于铜离子的胺氧化酶,催化胶原蛋白和弹性蛋白的赖氨酸残基侧链发生氧化脱氨,发挥着稳固细胞外基质的作用。而稳定性是蛋白质的一个重要特性,直接影响蛋白质的分子动态及其正常功能发挥,这与人类的健康和疾... 详细信息

赖氨酰氧化酶LOXL2是一种依赖于铜离子的胺氧化酶,催化胶原蛋白和弹性蛋白的赖氨酸残基侧链发生氧化脱氨,发挥着稳固细胞外基质的作用。而稳定性是蛋白质的一个重要特性,直接影响蛋白质的分子动态及其正常功能发挥,这与人类的健康和疾病密切相关。然而,关于LOXL2的稳定性目前鲜有报道,哪些位点对其稳定性有显著影响尚不清楚。本研究采用冷冻电镜和Alphafold2的数据,建立LOXL2的全长结构,通过分子动力学模拟得到其优化构象。再通过4种方法(mCSM,PremPS,DeepDDG和FoldX),计算所有位点的稳定性属性,筛选出对稳定性有显性影响的位点(定义为关键位点)。结果表明,95个关键位点对LOXL2的稳定性具有显著影响,在5个结构域上的分布数量依次为14、13、8、11和26,而结构域间的连接肽段上也有23个关键位点。在这些关键位点中,类型及数量分别为Leu(24个)、Val(20个)、Ile(12个)、Trp(11个)、Phe(11个)、Tyr(6个)、Cys(6个)、Met(4个)和Arg(1个)。其中大部分关键位点(88个)为疏水性质,这与蛋白质折叠的主要力量为疏水作用的情况是一致的,而Cys两两成对,构成二硫键,对LOXL2的结构及功能发挥重要作用。讨论中,我们将预测结果与实验值进行比较,并用自由能微扰方法,对部分关键位点进行比较,从多方面论证此项工作的可信度。此项研究,可为靶向LOXL2的疾病治疗研究,提供重要指导。

关键词：赖氨酰氧化酶样2 稳定性分子动力学模拟计算预测吉布斯自由能

基于倾向性评分逆概率加权法的视网膜母细胞瘤疗效评价及其预后影响因素分析

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解放军医学杂志 2024年第3期49卷 302-307页

作者：石丽娟李丽石福艳周希彬吴志鸿潍坊医学院临床医学院眼科学教研室山东潍坊261053 解放军总医院第三医学中心眼科医学部北京100039 潍坊医学院公共卫生学院卫生统计学教研室山东潍坊261053

目的评估手术、化疗及手术联合化疗3种治疗方式对视网膜母细胞瘤(RB)的疗效,分析RB患者的预后影响因素。方法选取2000年1月1日-2019年12月31日美国监测、流行病学和最终结果(SEER)数据库登记的RB患者1188例临床资料进行回顾性分析。采... 详细信息

目的评估手术、化疗及手术联合化疗3种治疗方式对视网膜母细胞瘤(RB)的疗效,分析RB患者的预后影响因素。方法选取2000年1月1日-2019年12月31日美国监测、流行病学和最终结果(SEER)数据库登记的RB患者1188例临床资料进行回顾性分析。采用倾向性评分逆概率加权法(IPTW)对接受手术、化疗或手术联合化疗治疗的3组患者基线特征进行平衡。采用Log-rank检验比较3组患者的生存概率,采用Cox回归模型分析RB患者预后影响因素。结果共纳入RB1188例,其中手术组426例,化疗组200例,手术联合化疗组562例。经IPTW加权后,患者的年龄、性别、种族等基线资料均达到平衡(P>0.05)。Log-rank检验结果显示,加权前后3组生存曲线比较差异均有统计学意义(P学意义(P>0.05)。加权后患者1年、3年和5年的生存概率为:手术组99.7%、98.9%和98.6%;化疗组97.4%、95.8%和95.8%;手术联合化疗组97.9%、95.8%和95.0%。Cox回归分析结果显示,与手术组比较,化疗组患者特异性死亡风险比为1.367(95%CI 1.100~1.700),手术联合化疗组特异性死亡风险比为1.132(95%CI0.963~1.330);与RB病灶为1个的患者比较,RB病灶数≥2个的患者特异性死亡风险比为0.399(95%CI0.268~0.594)。结论RB患者接受治疗后生存概率较高;在控制年龄、性别等因素的影响后,3种治疗方式中手术的疗效更好;多灶性可能是RB患者预后的独立影响因素。

关键词：视网膜母细胞瘤逆概率加权疗效生存分析

云南松松塔粗提物体外抗拉沙病毒活性及机制的研究

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中国人兽共患病学报 2024年

作者：刘贞麟张曼琳刘奇王聪大理大学基础医学院病原生物学综合实验室

目的研究云南松松塔粗提物抗拉沙病毒（LASV）活性及机制。方法利用拉沙假病毒系统及拉沙细胞-细胞融合检测松塔粗提物抗LASV活性。其中,构建拉沙假病毒系统以慢病毒骨架质粒***.R-E.与含有拉沙包膜蛋白质粒转染于293T细胞,生成了一... 详细信息

目的研究云南松松塔粗提物抗拉沙病毒（LASV）活性及机制。方法利用拉沙假病毒系统及拉沙细胞-细胞融合检测松塔粗提物抗LASV活性。其中,构建拉沙假病毒系统以慢病毒骨架质粒***.R-E.与含有拉沙包膜蛋白质粒转染于293T细胞,生成了一种含有荧光素酶报告基因的假性拉沙病毒。可以在BSL-2级生物安全实验室中检测松塔粗提物抗LASV活性的研究。其次,拉沙细胞-细胞融合模型的构建是通过对已有的质粒进行酶切,连接,鉴定,获得重组质粒,编码带有荧光报告基因及拉沙包膜蛋白的质粒（PAAV-EGFP-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ）将其转染至293T细胞,获得表面表达有拉沙包膜蛋白的荧光细胞,与靶细胞huh7细胞混合铺于96孔板,在37℃,酸性件下发生膜融合,后续用膜融合系统来检测松塔粗提物抗LASV活性研究;对松塔粗提物作用于LASV假病毒感染的具体时期进行分析,通过time of addition及time of remove试验分析松塔粗提物抗病毒作用靶点;采用Weston-blot方法检测p24蛋白量,判断松塔粗提物对病毒的裂解作用。结果松塔粗提物可有效抑制LASV感染,用4个谱系的LASV假病毒（LASV lineagesⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）感染靶细胞,测得IC50值分别为:42.06μg/mL、22.26μg/mL、80.57μg/mL及19.32μg/mL,抑制LASV包膜蛋白（GPC）介导的细胞-细胞融合活性的检测,测得IC50值分别为:122.9μg/mL、64.43μg/mL、90.05μg/mL及195.6μg/mL;松塔粗提物具有广谱抗病毒作用,可有效抑制沙粒病毒属:淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、卢霍病毒及胡宁病毒假病毒感染,IC50值分别为:2.716μg/mL、12.02μg/mL、29.95μg/mL;松塔粗提物作用于LASV假病毒感染早期,于感染后2 h内加入粗提物的抑制率明显高于4 h后加入药物,且以阻断LASV假病毒的吸附及融合为主;松塔粗提物对LASV假病毒无裂解作用,提取物处理组测得p24蛋白含量与未处理组无显著差异。结论本研究证实云南松松塔粗提物在体外环境下可有效抑制LASV感染,且具有广谱抗病毒作用;经试验结果证实松塔粗提物主要作用于病毒感染早期,以阻断病毒的吸附及融合为主,为松塔提取物抗LASV的深入研究提供重要的参考依据。

关键词：云南松松塔粗提物拉沙病毒抗病毒活性抗病毒机制