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牛乳蛋白κ-酪蛋白在谷氨酸棒状杆菌中的表达及优化

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食品与发酵工业 2024年

作者：张雅楠王雨露武小月刘秀霞白仲虎江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心

牛奶的蛋白质主要以酪蛋白为主，κ-酪蛋白（kappa casein， κ-CN）是酪蛋白（casein）的一种，约占牛脱脂乳中总酪蛋白含量的13%。κ-酪蛋白具有乳蛋白的营养作用，可应用于未来牛奶的全合成，同时它水解产生的肽类物质还具有抑制血... 详细信息

牛奶的蛋白质主要以酪蛋白为主，κ-酪蛋白（kappa casein， κ-CN）是酪蛋白（casein）的一种，约占牛脱脂乳中总酪蛋白含量的13%。κ-酪蛋白具有乳蛋白的营养作用，可应用于未来牛奶的全合成，同时它水解产生的肽类物质还具有抑制血液凝固及抗血栓形成的作用。谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为一种安全生产菌株，是食用蛋白生产的优势细胞平台。该研究利用谷氨酸棒状杆菌作为受体菌株表达异源蛋白的优势实现κ-酪蛋白的外源表达。根据κ-酪蛋白的信号肽和前肽的分析设计并合成谷氨酸棒状杆菌密码子偏好性κ-酪蛋白基因，利用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株用于表达κ-酪蛋白，并对该蛋白N端促溶标签、表达元件信号肽、表达宿主等进行优化，同时对发酵条件进一步优化。结果表明，对κ-酪蛋白进行二级结构及无序性分析，预测结果显示κ-酪蛋白具有固定的无序区域。采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测κ-酪蛋白的表达情况，结果表明κ-酪蛋白能在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株中成功表达，在其N端添加SUMO、FH8促溶标签能提高κ-酪蛋白可溶表达量，进行信号肽和宿主筛选能进一步提高蛋白产量。该研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达κ-酪蛋白，并通过优化手段进一步提高了产量，为未来牛奶全合成的实现奠定了基础。

关键词： κ-酪蛋白谷氨酸棒状杆菌无序区域表达元件优化宿主优化促溶标签

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人工神经网络优化大肠埃希菌摇瓶培养基

中国生物制品学杂志 2023年第11期36卷 1378-1382,1390页

作者：徐世友易中恒张婷婷郭济中张旭东焦磊雷清兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的采用人工神经网络(artificial neural network,ANN)优化一种可获得高生物量及菌体活力大肠埃希菌(E.coli)的摇瓶培养基。方法以葡萄糖(glucose,Glu)、酵母浸出物(yeast extract,YE)、酵母蛋白胨(yeast peptone,YP)、大豆蛋白胨(soy peptone,SP)和酵母基础氮源(yeast nitrogen base,YNB)占比为混料分量,菌体悬浮液A_(600)(A1)、培养物湿菌重(G,g/L)和菌体活力指标值(A2,A_(460))为响应值,采用混料设计试验筛选对响应值具有显著影响的混料分量。以混料设计试验结果为训练和验证数据样本构建ANN模型,输入变量为混料分量且约束同混料分量上下限,输出变量为混料设计响应值。通过所构建ANN获得的优化后培养基配方和参考值,应用蒙特卡洛模拟进一步调整培养基配方,并获得E.coli摇瓶培养基配方,再对培养基配方进行10次验证试验。结果E.coli摇瓶培养基配方:Glu 26 g/L、SP26 g/L、YNB 13 g/L,培养基总浓度为65 g/L。验证结果为:培养可获得A1≥14的批次几率为60%,G≥77 g/L的批次几率为50%,A2≥11的批次几率为40%。培养结果数据均值与参考值均等价。结论本研究优化获得的E.coli摇瓶培养基可培养获得高生物量及菌体活力的E.coli。

关键词：人工神经网络大肠埃希菌摇瓶培养基

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A型肉毒抗毒素ELISA方法的建立及验证

药物分析杂志 2023年第3期43卷 525-530页

作者：张玲玲段丽娟刘建光李育合谢小荣苏慧梁凌宇高建军兰州生物制品研究所有限责任公司血清室甘肃省疫苗工程技术研究中心兰州730046

目的:建立定量检测A型肉毒抗毒素效价的酶联免疫吸附法(ELISA法),并进行验证。方法:以A型肉毒类毒素为包被抗原包被酶标板,封闭后加入稀释的血清样品,以辣根过氧化物酶标记的兔抗马IgG(IgG-HRP)作为酶标抗体,加入四甲基联苯胺显色剂(TMB... 详细信息

目的:建立定量检测A型肉毒抗毒素效价的酶联免疫吸附法(ELISA法),并进行验证。方法:以A型肉毒类毒素为包被抗原包被酶标板,封闭后加入稀释的血清样品,以辣根过氧化物酶标记的兔抗马IgG(IgG-HRP)作为酶标抗体,加入四甲基联苯胺显色剂(TMB)显色10~15 min, 2 mol·L^(-1)硫酸终止反应,于酶标仪上读取A_(450 nm)值,以标准曲线样品浓度的对数(X)为横坐标,A_(450 nm)值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,将待测血清样品A_(450 nm)值代入曲线方程即可得到血清样品浓度,乘以稀释倍数即为血清样品效价。结果:在优化的条件下,该方法具有较高的特异性,除了与A型肉毒抗毒素血清反应外,对B、C、D、E、F型肉毒抗毒素血清均无交叉反应;在线性范围50~400 mIU·mL^(-1)时线性关系良好,r>0.990 0;准确度介于80%~120%;精密度(重复性和中间精密度)RSD<20%;采用该方法测定20批A型肉毒抗毒素血清的效价范围在525~2 450 IU·mL^(-1),中和试验法检测范围在675~2 400 IU·mL^(-1),二者的相关系数r=0.906 0(P<0.001),呈显著性正相关。结论:建立的ELISA定量检测方法在实验室条件下可以取得稳定的结果,为A型肉毒抗毒素效价的测定提供了一种简便的体外检测方法。

关键词： A型肉毒抗毒素 ELISA方法小鼠中和试验法定量检测效价测定验证

汉逊酵母活性及活力荧光素二乙酸酯-碘化丙啶双荧光染色检测方法的建立及应用

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中国生物制品学杂志 2023年第11期36卷 1347-1352页

作者：王玢徐世友杨俊杰周晖国雷清兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的建立用于检测汉逊酵母活性和活力的荧光素二乙酸酯(carboxyfluorescein diacetate,CFDA)-碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色法。方法通过单因素试验,优化CFDA的染色时间(5、10、20、40、60、120 min)、工作液浓度(50、100、... 详细信息

目的建立用于检测汉逊酵母活性和活力的荧光素二乙酸酯(carboxyfluorescein diacetate,CFDA)-碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色法。方法通过单因素试验,优化CFDA的染色时间(5、10、20、40、60、120 min)、工作液浓度(50、100、200、300μmol/L)及PI的染色时间(5、10、15、20、25 min)、工作液浓度(2、10、20、30μmol/L)。采用最适条件检测理论存活率为0、25%、50%、75%和100%的汉逊酵母样品,荧光显微镜下观察荧光信号,ImageJ软件分析灰度值;计数存活及死亡细胞个数,计算实际存活率和实际死亡率。同时分析实际灰度值、实际存活率及实际死亡率与相应理论值的相关性。采用建立的CFDA-PI双荧光染色法检测3批汉逊酵母培养物的活性及活力。结果CFDA和PI的最佳染色时间为60和5 min,最佳工作液浓度为200和2μmol/L。不同理论存活率汉逊酵母样品的实际灰度值、实际存活率及实际死亡率与相应理论值均具有显著相关性(R^(2)=0.9983~0.9992,P研究中汉逊酵母活性和活力的快速检测。

关键词：汉逊酵母荧光素二乙酸酯碘化丙啶荧光染色活性活力

1株人3型副流感病毒减毒活疫苗候选毒株在小鼠动物模型上的安全性、免疫原性及保护效力评价

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中国生物制品学杂志 2022年第11期35卷 1293-1305页

作者：关文竹火文李雄雄王云瑾王晓程亚慧寇桂英包红白慕群兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的评价1株人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type-3,HPIV-3)减毒活疫苗候选毒株CPW3在小鼠中的安全性、免疫原性及保护效力,以期为HPIV-3减毒活疫苗的研发提供候选毒株。方法从甘肃省妇幼保健医院下呼吸道感染住院患儿下呼... 详细信息

目的评价1株人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type-3,HPIV-3)减毒活疫苗候选毒株CPW3在小鼠中的安全性、免疫原性及保护效力,以期为HPIV-3减毒活疫苗的研发提供候选毒株。方法从甘肃省妇幼保健医院下呼吸道感染住院患儿下呼吸道分泌物标本中分离培养HPIV-3,采用诱变剂加逐步降温法筛选具有冷适应(coldadaptation,Ca)及温度敏感(temperature sensitivity,Ts)特性的HPIV-3毒株CPW3。用CPW3经鼻腔免疫雌性BALB/c小鼠,免疫30 d内每天测定小鼠体质量和体温;噬斑减少试验测定小鼠血清中和抗体;qRT-PCR法检测小鼠肺部和鼻洗液中HPIV-3病毒载量;ELIspot法测定小鼠肺脏、脾脏和外周血中HPIV-3特异性IgG/IgA抗体分泌淋巴细胞(antibody secreting cells,ASC)应答;流式细胞术测定小鼠肺脏、脾脏和外周血中IFNγ-CD4+T/IFNγ-CD8+T/IL-4-CD4+T细胞应答。HPIV-3野毒株攻毒试验测定CPW3免疫对小鼠肺脏HPIV-3感染的保护效力。结果CPW3可在小鼠上、下呼吸道增殖,但在小鼠肺脏的病毒载量比其亲本株低约100倍;免疫后30 d内,CPW3对小鼠的体质量和体温无影响;体液免疫应答结果显示,CPW3不仅可诱导小鼠产生显著的血清中和抗体应答(t=7.296,P<0.0001,n=12),还可产生显著的小鼠肺部局部定植记忆性IgG(t=3.296,P=0.0076,n=6)和IgA(t=2.884,P=0.0215,n=6)ASC免疫应答;细胞免疫应答结果显示,CPW3可显著诱导小鼠肺部局部定植记忆性IFNγ-CD4+T(t=4.941,P=0.038,n=6)和IFNγ-CD8+T(t=4.005,P=0.0005,n=6)细胞应答。CPW3免疫对小鼠下呼吸道HPIV-3感染具有显著的保护效力(t=2.836,P=0.0071,n=21)。结论在小鼠动物模型中,CPW3具有安全性和免疫原性,对小鼠HPIV-3感染具有显著的保护效力,是1株有前途的HPIV-3减毒活疫苗候选株。

关键词：人3型副流感病毒减毒活疫苗免疫原性保护效力

袋鼠豚鼠气单胞菌病的病变观察与病原分离鉴定

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中国兽医科学 2022年第11期52卷 1450-1455页

作者：袁阳王微张黔东刘馨蔡海情张晨旭文明贵州大学动物科学学院贵州省动物生物制品工程技术研究中心贵州贵阳550025

为明确引起贵阳某动物园袋鼠馆袋鼠死亡的病原,本试验采集病料样本进行病理组织学观察和细菌分离鉴定。结果,切片可见死亡袋鼠肝脏出现肝细胞变性坏死,肝窦扩张淤血,脾脏白髓淋巴细胞减少,肠组织黏膜固有层炎性细胞浸润,黏膜下层血管扩... 详细信息

为明确引起贵阳某动物园袋鼠馆袋鼠死亡的病原,本试验采集病料样本进行病理组织学观察和细菌分离鉴定。结果,切片可见死亡袋鼠肝脏出现肝细胞变性坏死,肝窦扩张淤血,脾脏白髓淋巴细胞减少,肠组织黏膜固有层炎性细胞浸润,黏膜下层血管扩张淤血等病理变化。经分离培养后发现均一的菌落生长,且菌落形态、菌体特征和生化结果均符合豚鼠气单胞菌(Aerom onas caviae)特点,遂将其命名为Kangroo21株。该分离菌PCR扩增的16S r RNA序列与豚鼠气单胞菌广东湛江分离株的同源性高达97.4%,接种可致死小白鼠且分离得到原接种菌。药敏试验显示,该分离菌对庆大霉素、氧氟沙星、头孢他啶等9种抗生素敏感。这些结果表明,引起袋鼠死亡的病原是豚鼠气单胞菌,可用敏感抗生素进行预防和治疗。

关键词：袋鼠豚鼠气单胞菌病病理观察病原分离鉴定

嗜水气单胞菌群体感应系统及其抑制剂应用研究进展

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中国畜牧兽医 2023年第5期50卷 1991-2000页

作者：曾成容刘馨毕文文梅世慧何广霞张俊杰文明周碧君陈江凤姜海波贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物生物制品工程技术研究中心贵阳550025

近年来随着抗生素在水产养殖业的滥用,导致细菌耐药性的产生,因此,需要绿色、安全、高效的新型策略来缓解耐药问题。群体感应作为一种通讯机制,根据细菌细胞间的密度来调节其行为和生理反应,其中许多活性物质能通过群体感应系统在不抑... 详细信息

近年来随着抗生素在水产养殖业的滥用,导致细菌耐药性的产生,因此,需要绿色、安全、高效的新型策略来缓解耐药问题。群体感应作为一种通讯机制,根据细菌细胞间的密度来调节其行为和生理反应,其中许多活性物质能通过群体感应系统在不抑制病原菌生长的情况下影响病原菌的致病性,同时减缓耐药的产生。因此,近年来抑制细菌群体感应系统的抑制剂成为研究热点。嗜水气单胞菌作为水产养殖业中的主要条件病原菌,严重危害着水产养殖业的发展。笔者介绍了嗜水气单胞菌群体感应系统的作用机制,对细菌生物被膜的调节,以及群体感应系统抑制剂中草药和益生菌在防控嗜水气单胞菌中的应用,旨在分析嗜水气单胞菌群体感应抑制在未来的发展潜力,为水产养殖业中嗜水气单胞菌的防控提供一定的参考。

关键词：嗜水气单胞菌群体感应群体感应抑制剂耐药

刺梨渣提取物对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果及作用机制

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四川农业大学学报 2023年第3期41卷 537-545页

作者：曾成容刘馨张晨旭毕文文梅世慧何广霞张俊杰文明周碧君陈江凤姜海波贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物生物制品工程技术研究中心贵阳550025

【目的】探讨刺梨渣提取物对水产养殖业中主要病原菌嗜水气单胞菌的抑菌作用和机制。【方法】通过微量稀释法和平板计数法测定刺梨渣提取物对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC),通过集群运动实验检测刺梨渣提取物对... 详细信息

【目的】探讨刺梨渣提取物对水产养殖业中主要病原菌嗜水气单胞菌的抑菌作用和机制。【方法】通过微量稀释法和平板计数法测定刺梨渣提取物对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC),通过集群运动实验检测刺梨渣提取物对嗜水气单胞菌集群运动的影响,通过脂肪酶和蛋白酶活性实验检测刺梨渣提取物对嗜水气单胞菌脂肪酶活性和蛋白酶活性的影响,通过溶血实验测定刺梨渣提取物对嗜水气单胞菌溶血性的影响,此外通过结晶紫法检测生物膜的形成,以及荧光定量RT-PCR检测毒力和调控系统的相关基因表达情况。【结果】刺梨渣提取物对3株嗜水气单胞菌的MIC为128 mg/mL;其中嗜水气单胞菌ATCC7966的MBC为256 mg/mL,其余两株嗜水气单胞菌的MBC均>512 mg/mL。刺梨渣提取物浓度低于8 mg/mL时,不影响菌株生长;刺梨渣提取物≥4 mg/mL时,对生物膜形成、蛋白酶活性和溶血活性都具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖抑制,但对脂肪酶的活性影响较小。荧光定量RT-PCR结果发现刺梨渣提取物能引起嗜水气单胞菌群体感应(QS)系统中luxS和ahyr基因表达显著下调;同时气溶素aerA表达量也显著下降。【结论】刺梨渣提取物能抑制嗜水气单胞菌生长及运动能力、酶活性、溶血活性、生物膜的形成以及相关毒力基因的表达,表明刺梨渣提取物是一种潜在的嗜水气单胞菌替抗物。

关键词：刺梨渣提取物嗜水气单胞菌抑菌

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A型产气荚膜梭菌感染鸭回肠代谢组学分析

畜牧兽医学报 2023年第6期54卷 2555-2569页

作者：曾成容王娜毕文文梅世慧何广霞张峻杰陈泽文明周碧君贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物生物制品工程技术研究中心贵阳550025

旨在应用非靶向代谢组学技术探究A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type A,CpA)感染鸭回肠差异代谢物变化特征。试验选取CpA感染37日龄健康雏鸭,采用剖检病理观察和PCR检测确定CpA感染成功后,使用液相色谱-质谱联用(liquid chro... 详细信息

旨在应用非靶向代谢组学技术探究A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type A,CpA)感染鸭回肠差异代谢物变化特征。试验选取CpA感染37日龄健康雏鸭,采用剖检病理观察和PCR检测确定CpA感染成功后,使用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技术检测对照组和CpA感染组感染66、90、114 h时鸭回肠的代谢组学,筛选并分析潜在的差异代谢物及相关代谢通路,最后选取对照组和CpA感染114 h组差异代谢物验证。结果表明:经剖检病理观察和病原核酸检测确定成功构建了鸭CpA感染模型;PCA图中回肠样本有部分重叠,提示感染组与对照组鸭回肠间可能存在相同的离子化合物;感染鸭66、90和114 h总差异代谢物种类分别有14、16和24种,富集的代谢通路分别有13、14和28条,主要集中在花生四烯酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、酪氨酸代谢等;同时差异代谢物验证结果显示,感染114 h回肠缬氨酸和丙氨酸含量变化趋势均与非靶向代谢组学检测结果一致。综上所述,CpA感染鸭的致病机制可能通过影响相关氨基酸的代谢通路,调控相关代谢产物的合成。

关键词： A型产气荚膜梭菌鸭代谢组学