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小分子化合物与铝佐剂联用对铜绿假单胞菌疫苗候选抗原PA0833保护效果的影响及机制初步研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第3期44卷 189-197页

作者：孙恬峻张晓丽夏真萍赵卓章金勇王乂中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室青岛266003 陆军军医大学药学与检验医学系微生物与生化药学教研室重庆400038 陆军军医大学药学与检验医学系临床血液学教研室重庆400038

目的评价二乙基二硫代氨基甲酸钠(sodium diethyldithiocarbamate,DTC)、左旋咪唑(levamisole,LMS)、咪喹莫特(imiquimod,Imi)3个小分子化合物对铜绿假单胞菌疫苗候选抗原PA0833免疫原性和保护效果的影响,并进一步对其机制进行初步研究... 详细信息

目的评价二乙基二硫代氨基甲酸钠(sodium diethyldithiocarbamate,DTC)、左旋咪唑(levamisole,LMS)、咪喹莫特(imiquimod,Imi)3个小分子化合物对铜绿假单胞菌疫苗候选抗原PA0833免疫原性和保护效果的影响,并进一步对其机制进行初步研究。方法抗原PA0833分别与上述3种小分子以及铝佐剂配伍制备疫苗,通过肌肉注射的方式于0、14、21 d分别免疫BALB/c小鼠。收集3次免疫后血清,ELISA测定PA0833特异性IgG抗体水平。采用铜绿假单胞菌PAO1感染免疫后的小鼠,通过生存率、体重变化、临床评分、炎症因子检测和肺组织病理学改变等评价疫苗的保护效果。在此基础上,对小鼠连续7 d肌肉注射DTC,取肺脏组织进行转录组测序分析,并通过流式细胞术检测其对抗原提呈细胞活化的影响。结果联用小分子免疫组能够有效提高PA0833特异性IgG抗体效价,降低细菌感染后肺组织中细菌负荷和TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平,显著提高细菌感染后的生存率,其中DTC效果最好。转录组测序结果表明,相比于PBS对照组,DTC处理组样本有121个基因表达上调、18个基因下调;差异表达基因主要富集在免疫信号通路,IL-17信号通路活化明显。流式细胞术结果表明DTC能促进脾细胞中Th17细胞分化,且能促进抗原提呈细胞活化。结论本研究中的3种小分子都能够有效地增强抗原的免疫原性,其中DTC效果最优,可用于新型疫苗佐剂的研发。

关键词：佐剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(DTC) 铜绿假单胞菌疫苗

雌性和雄性非肥胖糖尿病小鼠中CD8^(+)T细胞分化亚群差异研究

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陆军军医大学学报 2024年第8期46卷 837-848页

作者：杨数数刘东黎婕张梦军王莉陆军军医大学(第三军医大学):基础医学院免疫学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系药物分析学教研室重庆400038

目的以雌性和雄性非肥胖糖尿病(nonobese diabetic,NOD)小鼠以及健康对照癌症研究所(institute for cancer research,ICR)小鼠为研究对象,比较分析初始、效应、记忆、耗竭以及调节性CD8^(+)T细胞分化亚群差异,探讨1型糖尿病(type 1 diab... 详细信息

目的以雌性和雄性非肥胖糖尿病(nonobese diabetic,NOD)小鼠以及健康对照癌症研究所(institute for cancer research,ICR)小鼠为研究对象,比较分析初始、效应、记忆、耗竭以及调节性CD8^(+)T细胞分化亚群差异,探讨1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)背景下的性别因素对CD8^(+)T细胞分化命运的影响。方法采用流式细胞术检测雌雄NOD小鼠脾脏、胰腺引流淋巴结(pancreatic draining lymph nodes,pLN)、胰腺浸润淋巴细胞(pancreas-infiltrating lymphocytes,PIL)、初始T细胞(naive T cells,T_(N))、中枢记忆T细胞(central memory T cells,T_(CM))、效应T细胞(effector T cells,T_(EFF))、效应前体样T细胞(effector precursor T cells,T_(EP))、耗竭T细胞(exhausted T cells,T_(EX))、耗竭前体T细胞(precursor exhausted T cells,T_(PEX))以及调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)等CD8^(+)T细胞分化亚群的频率和表型差异。结果与雄性NOD小鼠比较,雌性NOD小鼠pLN及PIL中IFN-γ^(+)、CD107a^(+)和CCL5^(+)CD8^(+)T_(EFF)频率显著升高(P<0.01,P<0.05,P<0.05),同时脾脏中CD8^(+)T_(N)、CD8^(+)T_(CM)、CD8^(+)T_(EX)、CD8^(+)T_(PEX)和CD122^(+)CD8^(+)Tregs亚群的频率均显著降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.001);而雌性和雄性ICR小鼠体内除CD122^(+)CD8^(+)Tregs差异变化与NOD小鼠一致(P<0.05),其余上述各CD8^(+)T细胞分化亚群无显著差异。结论雄激素可能通过抑制记忆T细胞向效应T细胞分化,同时促进效应T细胞功能耗竭,导致雌雄发病率差异。

关键词： 1型糖尿病 CD8^(+)T淋巴细胞调节性T细胞耗竭T细胞初始T细胞记忆T细胞

WT1多肽乳佐剂疫苗的免疫增强效应及其对急性髓系白血病抗肿瘤效应研究

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陆军军医大学学报 2024年第9期46卷 1024-1033页

作者：叶演张泽珑朱宝行刘姝琳宋振袁庆鹏杨赟李海波邹全明曾浩孙红武陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系微生物与生化药学教研室国家免疫生物制品工程技术研究中心重庆400038

目的评价Wilm瘤基因1(Wilms’ tumor gene1, WT1)多肽联合AddaVax^(TM)乳佐剂疫苗的稳定性、安全性、免疫增强效应及其对急性髓系白血病抗肿瘤效应。方法用MALDI-TOF-MS飞行时间质谱评价该佐剂疫苗中WT1多肽的稳定性;将C57BL/6雌性小... 详细信息

目的评价Wilm瘤基因1(Wilms’ tumor gene1, WT1)多肽联合AddaVax^(TM)乳佐剂疫苗的稳定性、安全性、免疫增强效应及其对急性髓系白血病抗肿瘤效应。方法用MALDI-TOF-MS飞行时间质谱评价该佐剂疫苗中WT1多肽的稳定性;将C57BL/6雌性小鼠按照随机数字表法分成3组:PBS组、WT1组和WT1+AddaVax^(TM)组,使用免疫剂量为抗原50μg/只、佐剂50μg/只,按照第0、14、28天肌肉注射免疫程序进行免疫。用HE染色评价疫苗肌肉注射小鼠脏器组织毒性;用ELISA检测细胞因子水平;ELISpot检测脾细胞分泌IFN-γ细胞数量;流式细胞术检测疫苗促体外骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)成熟和促淋巴细胞活化及H-2Db WT1四聚体检测特异性CD8+T细胞比例;用C1498-mWT1稳转细胞株构建小鼠白血病肿瘤模型后,评价其预防与治疗的抗肿瘤效应。结果 WT1多肽可在疫苗中稳定存在,对小鼠肌肉注射未发生明显的脏器组织变化;对小鼠肌肉注射WT1+AddaVax^(TM)疫苗后,与WT1组相比,WT1+AddaVax^(TM)组可诱导高水平的Th1细胞免疫应答γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及其Th17免疫应答白介素17A(IL-17A)(P免疫学和明显抗肿瘤效果。

关键词： WT1多肽 AddaVax^(TM)乳佐剂急性髓系白血病免疫应答抗肿瘤效应

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合成生物学助力细菌疫苗研发

合成生物学 2024年第2期5卷 321-337页

作者：章金勇顾江关山李海波曾浩邹全明陆军军医大学国家免疫生物制品工程技术研究中心陆军军医大学药学与检验医学系微生物与生化药学教研室重庆400037

细菌感染已成为全球第二大死亡因素,给人类健康与公共安全造成了巨大威胁。抗生素一直是治疗细菌感染最为主要的手段,但越来越严重的耐药问题给传统的抗生素疗法带来了严峻挑战。除了抗生素之外,疫苗被认为是防治传染性疾病传播最为科... 详细信息

细菌感染已成为全球第二大死亡因素,给人类健康与公共安全造成了巨大威胁。抗生素一直是治疗细菌感染最为主要的手段,但越来越严重的耐药问题给传统的抗生素疗法带来了严峻挑战。除了抗生素之外,疫苗被认为是防治传染性疾病传播最为科学、经济、安全和有效的手段,在人类抗击病原体感染斗争中发挥了重要作用。然而,细菌基因组庞大,致病机制复杂,研发疫苗存在有效抗原筛选、设计、制备难,抗原组合配伍难,有效性评价难,研发周期长等诸多瓶颈,导致细菌疫苗研发进展缓慢,尤其是临床常见的严重耐药致病菌尚无有效的疫苗可用。合成生物学是一门新兴的交叉学科,近年来在疫苗研究领域已经得到了广泛应用,包括抗原的筛选、理性设计、配伍组合,载体、佐剂和递送系统的设计以及免疫应答调控等。本文综述了细菌疫苗研究的现状以及耐药细菌疫苗临床试验研究进展,总结了合成生物学技术在几种重要类型细菌疫苗研发中的应用进展,最后对相关前景进行了展望。合成生物学在疫苗的形式、疫苗递送、疫苗的研制效率等方面为研究人员提供了更为广阔的空间,未来,应最大化地发挥合成生物学的优势,充分发展和应用合成生物学技术手段,建立科学、理性、有效、可行的管理制度,建设生物安全保障法律体系和监管措施,高效推动细菌疫苗研发,解决抗生素耐药问题,造福人类健康。

关键词：细菌感染抗生素耐药疫苗合成生物学

类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统的Hcp1蛋白转位介导多核巨细胞形成

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陆军军医大学学报 2024年第15期46卷 1721-1728页

作者：吴潘饶承龙南栋琪陈建高张子元刘文正王民洋闫晶敏李倩毛旭虎陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)创伤与化学中毒全国重点实验室重庆400038

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽... 详细信息

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽菌hcp1基因缺失株(BPC006Δhcp1)和缺失回补株(BPC006Δhcp1::hcp1);分别用类鼻疽菌BPC006野生株、BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1感染RAW264.7细胞,通过激光共聚焦分析Hcp1蛋白的定位情况;在293T细胞中转染Hcp1真核表达载体后进行细胞质膜分离进一步验证定位情况;在细胞感染模型上,通过吉姆萨染色检测抗Hcp1多克隆抗体封闭对MNGC形成的影响,探究Hcp1在类鼻疽菌感染导致的MNGC形成中的作用和生物学意义。结果Western blot检测结果显示BPC006Δhcp1不表达Hcp1蛋白,而BPC006Δhcp1::hcp1能恢复Hcp1蛋白的表达,成功构建类鼻疽菌BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1。细胞免疫荧光共定位实验和质膜分离实验都表明Hcp1可以定位在宿主细胞膜上,且相较于对照组抗Hcp1多克隆抗体能抑制类鼻疽菌感染所诱导的MNGC形成(P<0.01)。结论类鼻疽菌感染RAW264.7细胞时Hcp1可转位至细胞膜,并在MNGC形成中发挥重要作用。

关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌 Hcp1 多核巨细胞基因缺失与回补

类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白的重组表达及其免疫学特性研究

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陆军军医大学学报 2024年第15期46卷 1713-1720页

作者：南栋琪文远陈建高饶承龙吴潘张子元王施韦闫晶敏李倩毛旭虎陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)创伤与化学中毒全国重点实验室重庆400038

目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(***)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多克... 详细信息

目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(***)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多克隆抗体;分别用兔抗类鼻疽菌血清和类鼻疽菌感染阳性患者血清进行Western blot实验检测rBipD的免疫反应性;通过Western blot及免疫荧光染色检测鉴定rBipD的免疫原性;以rBipD建立间接ELISA检测临床类鼻疽患者血清抗体。结果成功构建pET-28a-BipD重组质粒并转化至*** BL21(DE3)中诱导表达、纯化获得了相对分子质量约为36×10^(3)的rBipD蛋白,纯度约为95.4%。rBipD蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。免疫小鼠可产生特异性抗体,制备鼠抗rBipD多克隆抗体,效价达1∶512000。5.0μg/mL rBipD蛋白可与类鼻疽患者血清发生免疫反应,而不与结核患者血清发生免疫反应,差异有统计学意义(P免疫学活性的rBipD蛋白及其多克隆抗体,为其用于临床免疫学诊断和类鼻疽菌感染免疫机制研究提供了良好的工具。

关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌 BipD蛋白重组表达抗体制备

肺炎克雷伯菌耐药靶标KPC-2的免疫原性和保护效果评价及保护机制初步研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第1期44卷 2-10页

作者：王晓琼明光阳陈致富苟强袁月赵莉群章金勇胡仁建重庆理工大学药学与生物工程学院重庆400054 陆军军医大学药学与检验医学系微生物与生化药学教研室重庆400038

目的采用肺炎克雷伯菌耐药靶标KPC-2为抗原制备重组蛋白疫苗,在小鼠肺炎模型中评价疫苗的免疫原性、保护效果和保护机制。方法利用大肠埃希菌原核表达系统表达肺炎克雷伯菌KPC-2蛋白,经GST亲和层析对目的蛋白进行纯化;采用KPC-2蛋白制... 详细信息

目的采用肺炎克雷伯菌耐药靶标KPC-2为抗原制备重组蛋白疫苗,在小鼠肺炎模型中评价疫苗的免疫原性、保护效果和保护机制。方法利用大肠埃希菌原核表达系统表达肺炎克雷伯菌KPC-2蛋白,经GST亲和层析对目的蛋白进行纯化;采用KPC-2蛋白制备疫苗,经皮下注射免疫新西兰兔,心脏采血分离血清,用Protein G亲和层析纯化多克隆抗体,同时运用调理吞噬杀菌试验检测抗体的体外杀菌活性。采用KPC-2疫苗免疫雌性BALB/c小鼠3次,间接ELISA检测血清中特异性IgG抗体滴度。末次免疫后7 d,通过气管插管构建小鼠肺炎克雷伯菌肺部感染模型,感染1 h后尾静脉给予0.1 mg美罗培南治疗,通过比较免疫组与佐剂组的生存率、细菌定植量和组织病理学差异,以及给药组与生理盐水组生存率的差异评价疫苗的保护效果。采用KPC-2多克隆抗体被动免疫评价抗体的保护效果。结果KPC-2免疫组小鼠血清特异性IgG水平显著高于对照组(t=4.325,P免疫组生存率显著高于对照组[70%(7/10)vs 10%(1/10),P免疫组小鼠肺组织炎性程度及细菌定植量显著低于对照组(t=3.127,P免疫与被动免疫均具有良好的保护效果,且对抗生素治疗有明显的增效性;KPC-2多克隆抗体在体外表现出明显的吞噬杀菌活性(t=5.427,P免疫原性和保护效果,体液免疫应答在其保护中发挥了重要作用,证明采用耐药靶标作为抗原制备疫苗具有可行性。

关键词：肺炎克雷伯菌 KPC-2 细菌耐药疫苗

半乳糖上调内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平抑制巨噬细胞活性

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陆军军医大学学报 2024年第13期46卷 1502-1511页

作者：吴妮婷摄渊婷刘红梅李瑾贾乙陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系药剂学教研室重庆400038

目的探究半乳糖对人原代肺动脉内皮细胞上唾液酸特异性Ig样凝集素-9(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin 9,Siglec-9)聚糖配体表达的影响及作用机制。方法采用流式细胞术确定内皮细胞表面Siglec-9聚糖配体的表达并鉴定该... 详细信息

目的探究半乳糖对人原代肺动脉内皮细胞上唾液酸特异性Ig样凝集素-9(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin 9,Siglec-9)聚糖配体表达的影响及作用机制。方法采用流式细胞术确定内皮细胞表面Siglec-9聚糖配体的表达并鉴定该聚糖配体末端糖苷键类型;分别用左旋葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰基葡萄糖、甘露糖、N-乙酰基甘露糖、半乳糖、唾液酸、蔗糖处理内皮细胞48 h,采用流式细胞术检测内皮细胞Siglec-9聚糖配体的表达;将内皮细胞分为对照组和半乳糖组(n=3),Western blot、流式细胞术、免疫荧光分析半乳糖对内皮细胞Siglec-9聚糖配体表达的影响;α2-3,6,8唾液酸酶处理内皮细胞后,Western blot检测半乳糖对内皮细胞Siglec-9聚糖配体恢复时间的影响;半乳糖处理内皮细胞后,Western blot检测分析细胞内唾液酸合成关键酶(GNE、NANS、NANP、CMAS、NPL以及ST3Gals)表达水平,并用RT-qPCR验证相关蛋白的mRNA表达;siRNA敲低NANP、CMAS及ST3Gal-Ⅲ,Western blot检测内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平变化;巨噬细胞与内皮细胞共培养实验分析Siglec-9聚糖配体的增加对巨噬细胞的凋亡与吞噬能力的影响。结果内皮细胞上表达有Siglec-9聚糖配体且该配体为末端结构为α2-3连接的唾液酸糖蛋白;与对照组比较,半乳糖组内皮细胞上该聚糖配体表达水平显著增加(P<0.01),但半乳糖的添加对该配体的自我恢复时间无影响;与对照组比较,半乳糖处理的内皮细胞中NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ表达水平升高(P<0.05,P<0.01),且RT-qPCR验证结果与其一致;抑制内皮细胞中NANP、CMAS、ST3Gal-Ⅲ的表达后,内皮细胞Siglec-9聚糖配体水平下降(P<0.01)。共培养实验中,与未处理组比较,半乳糖处理的内皮细胞促进巨噬细胞凋亡增加(P<0.01),并导致其吞噬能力减弱(P<0.05)。结论半乳糖通过NANP-CMAS-ST3Gal-Ⅲ通路上调内皮细胞上Siglec-9聚糖配体水平,从而抑制巨噬细胞活性。

关键词：半乳糖内皮细胞唾液酸特异性Ig样凝集素-9聚糖配体唾液酸合成关键酶巨噬细胞

金黄色葡萄球菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系的构建

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陆军军医大学学报 2024年第8期46卷 815-821页

作者：石姚佳田湉熊廷蓉王于张笑恺邹全明河南大学药学院河南开封475004 陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系微生物与生化药学教研室国家免疫生物制品工程技术研究中心重庆400038 陆军军医大学士官学校基础部石家庄050081

目的建立金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)巨噬细胞胞内感染状态下分泌蛋白高通量筛选体系,探索金葡菌胞内生存所需关键分泌蛋白。方法利用课题组建立的金葡菌分泌蛋白真核系统表达载体库,通过DNA转染表达技术,得到能够在细... 详细信息

目的建立金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)巨噬细胞胞内感染状态下分泌蛋白高通量筛选体系,探索金葡菌胞内生存所需关键分泌蛋白。方法利用课题组建立的金葡菌分泌蛋白真核系统表达载体库,通过DNA转染表达技术,得到能够在细胞内表达金葡菌分泌蛋白的RAW264.7巨噬细胞阵列。金葡菌感染RAW264.7后,清除胞外菌,观察金葡菌胞内生存情况。最后通过构建相应分泌蛋白的过表达及敲除金葡菌验证筛选结果。结果通过探索RAW264.7质粒转染剂量、金葡菌感染复数(multiplicity of infection,MOI)以及感染时间,确立筛选体系的最优质粒转染剂量为1.0μg/孔、MOI为1.0、感染时间为4 h。筛选结果结合相应分泌蛋白过表达和敲除菌株验证,成功筛选出hypothetical protein、Serine protease E等分泌蛋白具有促进胞内金葡菌生存功能。结论成功构建金葡菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系。

关键词：金黄色葡萄球菌巨噬细胞胞内感染分泌蛋白